一種光學(xué)分析檢測cho細(xì)胞增殖的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種非侵入式光學(xué)分析檢測中國倉鼠卵 巢（CHO)細(xì)胞增殖的方法，適用于促CHO細(xì)胞生長的培養(yǎng)基及各種因子的快速篩選。
【背景技術(shù)】
[0002] 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系是藥用蛋白首選的表達(dá)系統(tǒng)：1986年，第一個治療型蛋 白一人組織型纖溶酶原激活劑由哺乳動物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)；據(jù)統(tǒng)計，2006年至2010年獲 得美國FDA批準(zhǔn)的58個生物藥物中，其中有32個是使用哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)（Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol2010 ;28:917 - 924)。而在眾多 哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中有近70%的治療用蛋白用CHO細(xì)胞表達(dá)（Jayapal KP，Wlaschin KFj Hu WSj Yap MG. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20years and counting. ChemEngProg2007 ； 103:40 - 47)〇
[0003] 哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)采用合成培養(yǎng)基，并加入適量的血清。血清是一類去除纖維蛋 白后的復(fù)雜混合物，含有血漿蛋白、生長因子、激素、毒素清除劑及脂肪、多肽、維生素、核 酸和微量元素等。在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中，血清對細(xì)胞的增殖及分化不可或缺（Grillberger L j Kreil TRj NasrS.Emerging trends in plasma-free manufacturing of recombinant protein therapeutics expressed in mammalian cells.Biotechnology Journal 2009 ； 4 (2) : 186-201)。但添加血清存在一些無法徹底解決的弊端：血清成分復(fù)雜，不可避免地存 在支原體和外源病原體等污染（Zoon K. Points to consider in the characterization of cell lines used to produce biologicals. Center for Biological Evaluation and Research，F(xiàn)ood and Drug Administration，Rockville，MD, 1993:7-8.);血清中含有 細(xì)胞貼壁因子，不適用于工業(yè)化高密度CHO細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)糖蛋白；血清含有少量蛋白， 表達(dá)目的蛋白過程中無法避免引入了雜蛋白，大大增加了蛋白質(zhì)下游工程分離純化過程難 度（Van VJ, Mellor D,Brands R. The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicology in vitro 2004 ； 18(1) :1-12.) 〇
[0004] 因此細(xì)胞培養(yǎng)方面的學(xué)者也在2005年出版的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范中提議生物藥品需 使用無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)（Coecke S, Balls M, Bowe G. Guidance on good cell culture practice, a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to laboratory animals:ATLA2005;33(3) :261. )。2008 年歐洲替代方法研 宄中心科學(xué)咨詢委員會強(qiáng)烈建議在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域使用無血清培養(yǎng)基。因此，無血清培養(yǎng)基、 特別是無外源蛋白成分的無血清培養(yǎng)基，已逐漸成為哺乳動物細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物制品 行業(yè)中主流與趨勢，尋找廉價的血清類似物生長因子已迫在眉睫。
[0005] 已報道的篩選血清類似物的細(xì)胞增殖檢測方法主要分為四類：DNA合成檢測 (BrdU標(biāo)記法）、代謝活性檢測（四挫鹽或者Alamar Blue)、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測（細(xì) 胞核抗原PCNA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IIB和磷酸化組蛋白H3)和ATP濃度檢測（Ceresa L，Ball P. Using ATP bioluminescence for microbiological measurements in pharmaceutical manufacturing. Pall Life Sci2004.)。這些方法均存在一些弊端：如BrdU標(biāo)記法需要變 性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響了其他染料的結(jié)合染色，導(dǎo)致 染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問題；四唑鹽（MTT、XTT、MTS)這一類檢測方法屬于終點檢測，化合 物存在毒性，靈敏度不足以及不能實時在線監(jiān)測細(xì)胞的動態(tài)生長等；細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢 測法中抗原有極大的局限性，只能在細(xì)胞周期S期、G2期和M期表達(dá)，而在GO期和Gl期 (非增殖期）不表達(dá)，需要通過組織切片檢測，不能實現(xiàn)高通量篩選；ATP濃度檢測需要采用 熒光素酶（Iuciferase)及其底物熒光素（Iuciferin)的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎(chǔ)，對細(xì) 胞增殖進(jìn)行檢測，但是該方法需要外源熒光素標(biāo)記，操作費時等。
[0006] 基于上述方法存在諸多不足，需要構(gòu)建一種能解決上述弊端的篩選方式，能高通 量篩選出適合CHO細(xì)胞生長的血清類似物并能保持甚至提高外源蛋白的表達(dá)量，對實驗室 的科學(xué)研宄及規(guī)?；瘧?yīng)用都有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種采用GFP光學(xué)分析法檢測細(xì)胞增殖的方法，該方法是 將PEGFP-N2整合到CHO細(xì)胞基因組中，由于質(zhì)粒含有高效的啟動子SV40和CMV，使GFP基 因在細(xì)胞增殖過程中穩(wěn)定表達(dá)，以GFP作為報告基因通過熒光強(qiáng)度變化來評估培養(yǎng)基及各 種生長因子對CHO細(xì)胞生長的影響。本發(fā)明以穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株內(nèi)熒光強(qiáng)度來快速、 靈敏地檢測CHO細(xì)胞增殖情況，檢測的結(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)胞增殖檢測方法一MTT法的實驗結(jié)果 十分吻合，同時還具有操作便捷、無毒害、重復(fù)性好、靈敏度高和檢測范圍廣等優(yōu)勢，為CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基及生長因子的篩選提供了一種非侵入式的篩選方法，具有良好的應(yīng)用前景。
[0008] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 一種光學(xué)分析檢測CHO細(xì)胞增殖的方法，步驟如下：
[0010] (l)pEGFP-N2轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備
[0011] 將PEGFP-N2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，搖菌，提取無內(nèi)毒素的質(zhì)粒；
[0012] ⑵脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
[0013] 將CHO細(xì)胞接種于孔板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)70%時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將步驟 (1)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中；
[0014] (3)穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
[0015] 采用遺傳霉素 G418對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，至少經(jīng)過30代以上的抗性篩選 即可獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株；
[0016] (4)擴(kuò)增培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株，消化細(xì)胞并對其計數(shù)及檢測熒光強(qiáng)度，基于 細(xì)胞內(nèi)GFP熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系，可判斷CHO細(xì)胞增殖情況。
[0017] 步驟（1)所述轉(zhuǎn)染質(zhì)粒是通過去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取。
[0018] 步驟（2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染采用lipofectimene3000試劑盒。
[0019] 所述遺傳霉素 G418的篩選濃度為400?1000ug/ml。
[0020] 上述方法應(yīng)用于促生長培養(yǎng)基和生長因子的篩選。
[0021] 更具體的方法如下：
[0022] 1 · pEGFP-N2轉(zhuǎn)化，提取。制備方法如下：
[0023] a.取一管大腸菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化30min，取1 μ 1質(zhì)粒加入感 受態(tài)細(xì)胞中，用手指輕彈混勻，置于冰上30min后于42°C水浴9〇sec，然后迅速置于冰上 2min ；
[0024] b.取0. 8ml SOC培養(yǎng)基于無菌EP管中，37°C、180rpm搖床恢復(fù)培養(yǎng)Ih ;
[0025] c.離心后重懸沉淀菌液，取IOul涂布于含抗性的LB平板培養(yǎng)基37°C過夜培養(yǎng)。
[0026] d.挑取長勢好的克隆，接種于含抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，180rpm搖床培養(yǎng) 過夜，提取質(zhì)粒測序；
[0027] e.測序結(jié)果正確后搖菌，采用OMGA質(zhì)粒提取試劑盒提取去內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA，通 過超微量紫外/可見光光度計檢測質(zhì)粒濃度及其純度。
[0028] 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
[0029] a.接種I X IO5個CHO-Kl細(xì)胞于24孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞密度生長至70%時，對細(xì)胞 進(jìn)行瞬轉(zhuǎn)實驗操作；
[0030] b.取適量體積lipofectimene3000試劑與opti-MEM Medium均勾混合后得到A ; 取lug pEGFP-N2于opti-MEM Medium混合，然后加入P3000試劑后得到B ;A和B按照等體 積混合形成混合液，在室溫條件下孵育5min后，將其加入到24孔板中培養(yǎng)；
[0031] c.培養(yǎng)數(shù)天后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
[0032] 3.穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
[0033] a.遺傳霉素 G418的篩選濃度：設(shè)置400-1000ug/ml的濃度分別加入CHO-Kl中培 養(yǎng)數(shù)十天，觀察CHO-Kl細(xì)胞生長情況，確定最佳穩(wěn)篩濃度；
[0034] b.將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化傳代于6孔板中培養(yǎng)，加入最佳篩選濃度遺傳霉素 G418試 劑來篩選；
[0035] c.經(jīng)過30次傳代進(jìn)行逐次篩選即可獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株，其中GFP陽性克 隆率為95%以上。
[0036] 4.抗性細(xì)胞克隆團(tuán)PCR鑒定：
[0037] a.采用Takara基因組提取試劑盒提取陰性細(xì)胞和抗性細(xì)胞全基因組；
[0038] b.設(shè)計PCR引物如下：
[0039] pEGFP-N2-Fl :5' -CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3'
[0040] pEGFP-N2-Rl :5, -CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3'
[0041] c. PCR擴(kuò)增程序：
[0042]
【主權(quán)項】
1. 一種光學(xué)分析檢測CHO細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) pEGFP-N2轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備 將PEGFP-N2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，搖菌，提取無內(nèi)毒素的質(zhì)粒； (2) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 將CHO細(xì)胞接種于孔板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)70%時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將步驟（1)的 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中； (3) 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 采用遺傳霉素 G418對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，至少經(jīng)過30代以上的抗性篩選培養(yǎng)即可 獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株； (4) 將穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，消化細(xì)胞并采用臺盼藍(lán)染色對細(xì)胞計數(shù)及采 用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，基于細(xì)胞內(nèi)GFP熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系，可判斷CHO細(xì)胞 增殖情況。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述轉(zhuǎn)染質(zhì)粒是通過去內(nèi)毒素的 質(zhì)粒提取試劑盒提取。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑵脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染采用 lipofectimene3000 試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述遺傳霉素 G418的篩選濃度為400? 1000ug/ml〇
5. 權(quán)利要求1?4所述方法在促生長培養(yǎng)基和生長因子的篩選中應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種光學(xué)分析檢測CHO細(xì)胞增殖的方法及應(yīng)用，步驟如下：(1)將pEGFP-N2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，搖菌，提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒；(2)將CHO細(xì)胞接種于孔板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)70％時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將步驟(1)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中；(3)采用遺傳霉素G418對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，至少經(jīng)過30代以上的抗性篩選即可獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株；(4)擴(kuò)增培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞株，消化細(xì)胞并采用臺盼藍(lán)染色對細(xì)胞計數(shù)及采用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，基于細(xì)胞內(nèi)GFP熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系，判斷CHO細(xì)胞增殖情況。本發(fā)明方法具有易操作性、檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、良好重復(fù)性、敏感度高和無毒等優(yōu)勢。
【IPC分類】C12Q1-06, C12N15-85
【公開號】CN104561091
【申請?zhí)枴緾N201410788129
【發(fā)明人】王菊芳, 鐘啟, 馬毅, 劉婷婷, 王海鷹
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月17日