枝孢霉zf-35及在制備羥化環(huán)氧黃體酮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株新的海洋真菌，特別涉及一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其對(duì)環(huán)氧 黃體酮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化從而獲得羥化環(huán)氧黃體酮的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 生物轉(zhuǎn)化是在細(xì)胞或酶等生物催化劑催化下進(jìn)行某種化學(xué)修飾的化學(xué)反應(yīng)，廣泛 應(yīng)用于天然產(chǎn)物的生物合成、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、有機(jī)化合物的不對(duì)稱(chēng)合成、藥物代 謝研宄等領(lǐng)域，在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾中顯示了巨大的應(yīng)用潛力。A. Christy Hunter等利用曲霉屬真菌tamarii KITA對(duì)一系列的5-enesteroids進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化 的研宄，確證了 5-enesteroids的代謝途徑涉及了內(nèi)醋化酶和輕基化酶的共同作用，首 次證明了真菌具有同時(shí)調(diào)控dehydroepiansdrosterone以及含有c-17側(cè)鏈的留體類(lèi)化 合物的作用。Kun Chen，Wang-Yu Tong等利用犁頭霉屬coerulea IBL02實(shí)現(xiàn)了 16 α， 17 α -epoxyprogesterone 的 Cn_β 輕基化。
[0003] 近20年間，隨著陸生資源的急劇減少，人類(lèi)面臨著可持續(xù)發(fā)展與資源匱乏的矛 盾，從而使開(kāi)發(fā)海洋資源成為不可抗拒的熱潮。海洋微生物的多樣性加之生長(zhǎng)環(huán)境的特殊 性，決定了其獨(dú)特的多元結(jié)構(gòu)是陸生植物無(wú)法比擬的，其新穎性和復(fù)雜性是科學(xué)家無(wú)法預(yù) 測(cè)的，因此海洋真菌內(nèi)新穎的代謝體系，或許能作為環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化的新體系，從而成為新 藥研制開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明以海洋真菌為研宄對(duì)象，以環(huán)氧黃體酮為底物，研宄了海洋真菌對(duì)環(huán)氧黃 體酮的轉(zhuǎn)化工藝。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其微生物轉(zhuǎn)化制備羥化環(huán)氧黃 體酮的方法，該方法通過(guò)枝孢霉轉(zhuǎn)化獲得了多種羥化產(chǎn)物，解決了化學(xué)合成羥化環(huán)氧黃體 酮困難，污染嚴(yán)重的問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一株新菌株一枝孢霉（Cladosporium sphaerospermum) ZF-35,保藏 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC No !M2014399,保藏日期2014年9月5日，地 址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種所述枝孢霉ZF-35在制備羥化環(huán)氧黃體酮中的應(yīng)用，所述的 應(yīng)用為：以16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮為底物，以無(wú)水乙醇為反應(yīng)介質(zhì)，以枝孢霉ZF-35經(jīng)發(fā)酵 培養(yǎng)獲得的含菌發(fā)酵液為酶源，在25?30°C、160?200rpm下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié) 束后（優(yōu)選反應(yīng)2-3天），將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液分離純化，獲得羥化環(huán)氧黃體酮；所述酶源的用量 以含菌發(fā)酵液中濕菌體的重量計(jì)為〇. 25?0. 8g/mL反應(yīng)介質(zhì)，所述16 α，17 α -環(huán)氧黃體 酮用量為〇. 1?〇. 3g/mL反應(yīng)介質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明所述應(yīng)用中底物先與反應(yīng)介質(zhì)混合后，再加入酶源中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0010] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述酶源按如下步驟制備：
[0011] ⑴種子培養(yǎng)
[0012] 將接種環(huán)滅菌，無(wú)菌操作挑取保藏于液體石蠟的斜面中的枝孢霉ZF-35真菌孢 子，用劃線法接入新制備含種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿倒置于28°C的恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)2天后，出現(xiàn)明顯的單菌落，繼續(xù)培養(yǎng)約3?4d，出現(xiàn)分生孢子，獲得種子菌落；
[0013] 種子培養(yǎng)基終濃度組成：葡萄糖5?15g/L，酵母浸粉1?I. 5g/L，蛋白胨1. 5? 2. 5g/L，瓊脂15?20g/L，以體積比6:4的人工海水與蒸餾水的混合液為溶劑，pH為4?6 ; 優(yōu)選種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖7?12g/L，酵母浸粉I. 1?I. 3g/L，蛋白胨1. 7?2. 2g/ L，瓊脂17?21g/L，以體積比6:4的人工海水與蒸餾水的混合液為溶劑，pH為4?5 ;
[0014] 人工海水終濃度組成：NaCl 24. 477g/L、MgCl2 · 6H20 4. 9810g/L、Na2S043 . 9 1 70g/ LXaCl2 *H20 I. 1020g/L,KCl 0. 6640g/L,NaHCO3O. 1920g/L,KBr 0. 0960g/L,H3BO3O. 0260g/ L、SrCl2O. 0240g/L、NaFO. 0039g/L，溶劑為蒸餾水；
[0015] ⑵發(fā)酵培養(yǎng)
[0016] 用接種環(huán)挑取種子菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入25?30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3?4天至菌體濕重為30?60g/L發(fā)酵液，獲得含菌發(fā)酵液；
[0017] 發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成：葡萄糖25?35g/L，玉米漿20?30g/L，硫酸銨1. 5? 2g/L，酵母粉0. 5?lg/L，以體積比6:4的人工海水與蒸餾水的混合液為溶劑，pH為4? 6 ;優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖27?30g/L，玉米漿22?27g/L，硫酸銨1. 7? I. 9g/L，酵母粉0. 6?0. 9g/L，以體積比6:4的人工海水與蒸餾水的混合液為溶劑，pH為 4?5 ;所述人工海水的組成同種子培養(yǎng)基；所述人工海水的組成同種子培養(yǎng)基。
[0018] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述反應(yīng)液分離純化的方法為：轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過(guò)濾，濾 液用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層減壓蒸餾獲得產(chǎn)物浸膏，再將產(chǎn)物浸膏進(jìn)行硅膠柱層析， 分別以體積比1:4的乙酸乙酯和石油醚混合液，體積比1 :3的乙酸乙酯和石油醚混合液、體 積比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液、體積比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液、無(wú)水乙酸乙 酯為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫劑為體積比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液對(duì)應(yīng)的流 出液，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1 ;收集體積比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液對(duì)應(yīng)的流出液，得到轉(zhuǎn) 化產(chǎn)物2 ;收集無(wú)水乙酸乙酯對(duì)應(yīng)的流出液，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3,分別干燥，獲得三種羥化環(huán)氧 黃體酮。
[0019] 更進(jìn)一步，優(yōu)選所述酶源的用量以含菌發(fā)酵液中濕菌體的重量計(jì)為0. 25?0. 6g/ mL反應(yīng)介質(zhì)，所述16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮用量為〇. 1?〇. 2g/mL反應(yīng)介質(zhì)。
[0020] 本發(fā)明采用從東海海水中分離獲得的具有環(huán)氧黃體酮羥基化能力海洋真菌，通過(guò) 將接種環(huán)滅菌，無(wú)菌操作挑取保藏于液體石蠟的斜面中的真菌孢子，用劃線法接入新制備 種子培養(yǎng)基中；將培養(yǎng)皿倒置于28°c的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察其生長(zhǎng)狀況并記錄； 培養(yǎng)約2天后，即出現(xiàn)明顯的單菌落，繼續(xù)培養(yǎng)約3?4d，出現(xiàn)分生孢子，用接種環(huán)挑取其 中沒(méi)有污染且生長(zhǎng)較好的菌落接種于經(jīng)過(guò)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)；培養(yǎng)4d后，將底物溶于2% (占發(fā)酵液體積）無(wú)水乙醇中，投入到轉(zhuǎn)化瓶中，轉(zhuǎn)化48h后 取出，乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，減壓蒸餾得浸膏，5mL乙酸乙酯溶解，加入適量粗硅膠 至糊狀，減壓濃縮至干，進(jìn)行硅膠柱層析，收集含目標(biāo)組分的流出液，HPLC確定組分純度，核 磁分析檢測(cè)，最終確定化合物結(jié)構(gòu)。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0022] 本發(fā)明提供一株新菌株一枝孢霉ZF-35及其生物轉(zhuǎn)化環(huán)氧黃體酮制備羥化 環(huán)氧黃體酮的方法，即利用微生物轉(zhuǎn)化的方法，以枝孢霉ZF-35經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含 菌發(fā)酵液為酶源，以環(huán)氧黃體酮為底物，同時(shí)獲得了三種羥基化環(huán)氧黃體酮：11 α -羥 基-16 α, 17 α-環(huán)氧-孕甾-4-稀-3, 20-二酮，6 β -輕基-16 α, 17 α-環(huán)氧-孕 甾-4-烯-3, 20-二酮，7 β -羥基-16 α，17 α -環(huán)氧-孕留-4-烯-3, 20-二酮，具有一步引 入、專(zhuān)一性強(qiáng)、環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單，分離迅速，便于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用；羥化環(huán)氧 黃體酮可作為留體激素類(lèi)藥物化學(xué)合成的先導(dǎo)化合物，對(duì)于研宄其新化學(xué)合成路徑具有重 要的指示作用。由于該微生物轉(zhuǎn)化方法具有作用條件溫和，可以在常溫、弱酸性、水等環(huán)境 中進(jìn)行，同時(shí)具有高效的底物選擇性，并且具有分離純化簡(jiǎn)單高效等優(yōu)點(diǎn)，因此在工業(yè)生產(chǎn) 性激素和其他留體激素藥物的方面，具有很好的應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為菌株ZF-35菌落形態(tài)。
[0024] 圖2為菌株ZF-35的顯微照片（*800倍）。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0026] 實(shí)施例1枝孢霉ZF-35的分離鑒定
[0027] 1、初篩
[0028] 制備海水稀釋液：取Iml中國(guó)東海北煒28. 2690度，東經(jīng)121. 6047度海域海水加 入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，以此類(lèi)推，制成10'10'10'10'KT5不同濃度的海水稀釋 液，使用已滅菌的吸管，分別吸取一滴加入到初篩培養(yǎng)基中，使用涂布棒涂勻。將培養(yǎng)皿倒 置于28°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，出現(xiàn)菌落，挑取單菌落，通過(guò)劃線分離法接種至初篩 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)約2d，出現(xiàn)明顯單菌落，挑取單菌落保藏于初篩培養(yǎng)基斜面中，即可獲 得菌種。
[0029] 每升初篩培養(yǎng)基組成：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15?20g，蒸餾水1000mL，pH 為7。
[0030] 2、復(fù)篩
[0031] 分別挑取初篩分離純化獲得的菌株投入250mL的錐形瓶中（發(fā)酵培養(yǎng)基約50mL)， 放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中，200rpm培養(yǎng)3d，獲得菌體濕重為60g/L發(fā)酵液的含菌發(fā)酵液。取 50ml含菌發(fā)酵液，加入16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮〇. 〇2g和Iml無(wú)水乙醇的混合液，在28°C、 200rpm下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化2d后，將反應(yīng)液過(guò)濾，濾液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層減 壓蒸干，加入無(wú)水甲醇，配成5mg 的甲醇溶液，進(jìn)行HPLC分析，最終篩選獲得底物轉(zhuǎn)化 率高于50%的菌株，記為菌株2?-35。
[0032] HPLC檢測(cè)條件為：色譜柱：Phenomenex, USA, (5 μπι)，流動(dòng)相：甲醇-水，流速： 0· 8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。
[0033] 3、生理生化特征
[0034] 菌株菌落絨狀到粉末狀，顏色呈橄欖綠，反面為橄欖黑色，顯微鏡下，分生孢子梗 為橄欖棕色，長(zhǎng)度不等，一般長(zhǎng)為350微米，分生孢子梗末端和外側(cè)可產(chǎn)生支狀分生孢子 鏈，菌株ZF-35形態(tài)如圖1、圖2所示，因此，通過(guò)形態(tài)觀察可初步判定為枝孢霉。
[0035] 4、分子鑒定
[0036] 基因?qū)W測(cè)定，委托南京金斯瑞有限公司進(jìn)行測(cè)定：以ITSl和ITS4為引物，提取 菌株ZF-35總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增，PCR純化，最終獲得 近ITS區(qū)全序列（核苷酸序列為SEQ ID ΝΟ:1所示），最后通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息中心 (NCBI)的基因庫(kù)Genback檢索得到菌株ZF-35的ITS全序列與枝孢霉（Cladosporium sphaerospermum)相似度> 99%。
[0037] 引物 ITS1:3，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5，；
[0038] 引物 ITS4:3' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-5，；
[0039] SEQ ID NO ： 1 ：
[0040] CTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTTGAACCCGGCCCTCGGGCCGGGATGTTCACAAC CCTTTGTT