一種親水性超大孔聚合物微球及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分子微球制備領(lǐng)域，特別涉及一種親水性超大孔聚合物微球及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 色譜技術(shù)到目前為止仍然是高效分離蛋白質(zhì)、質(zhì)粒等生物大分子的一種有效手 段。選擇一種合適的分離介質(zhì)是保證分離效率的關(guān)鍵因素。由于生物大分子空間三四級(jí)結(jié) 構(gòu)復(fù)雜，尺寸大(蛋白質(zhì)分子直徑通常為I-IOOnm,質(zhì)粒分子直徑則在150-250nm之間)，穩(wěn) 定性差等特點(diǎn)。為了保持生物大分子的生物活性，要求在保證分離純度的前提下盡可能的 縮短分離時(shí)間，以減少生物大分子被流體切割的程度（PerfusiveChromatography, USPate nt5, 833, 861，1998)，同時(shí)要求分離介質(zhì)孔徑要與生物大分子體積相適應(yīng)，一般要大于溶質(zhì) 分子直徑10 - 20倍（Polymer, 2007, 48:1981-1988)，否則分子擴(kuò)散會(huì)受到限制。傳統(tǒng)的色 譜分離介質(zhì)孔徑通常在l〇_5〇nm之間，生物大分子只能吸附在微球外表面，不能有效利用 微球的孔道和表面積，傳質(zhì)速率慢，分離效率低下，已成為現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)限制因 素。此外，目前占主流的多糖類分離介質(zhì)還存在機(jī)械強(qiáng)度低，只能在低流速下操作的缺陷。 超大孔聚合物微球的出現(xiàn)為解決該問(wèn)題提供了有效思路。
[0003] 超大孔聚合物微球機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，近年來(lái)引起研究人員的廣泛興趣。 上世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的灌注色譜介質(zhì)（POROS)就是一種超大孔聚苯乙烯（PS)微球，已 成功用于蛋白質(zhì)的快速分離（Perfusionchromatography. Nature, 1991，350:634-635; J. Chromatogr. A，1996, 743:221-229)，具有操作壓強(qiáng)低、流速快、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。P0R0S介質(zhì) 具有兩類孔，一類是600-800nm的貫穿孔（through pores),另一類是80-150nm的擴(kuò)散孔 (diffusive pores)。貫穿孔內(nèi)流體可以對(duì)流形式流動(dòng)，傳質(zhì)速度快；而擴(kuò)散孔提供了足夠 高的比表面積，保證了介質(zhì)的吸附容量。但由于該類介質(zhì)制備工藝復(fù)雜，微球孔道的形成不 易控制，批次重復(fù)性差，并且納米顆粒間結(jié)合力弱，介質(zhì)在裝柱過(guò)程中容易破碎，很難工藝 放大進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，以上問(wèn)題使P0R0S介質(zhì)的應(yīng)用停滯不前，近年來(lái)少有P0R0S介質(zhì)的應(yīng) 用報(bào)道。
[0004] Magnapore 微球是另一種超大孔微球（PolymericMicrobeads. USPatent5, 863, 957, 1999)，它的特點(diǎn)是孔道非常規(guī)整，孔徑較大（1-50 μ m)，相互聯(lián)通的孔 明顯可見(jiàn)。Magnapore微球是米用高內(nèi)相乳液法（high internal phase emulsion, HIPE) 制備的，在制備過(guò)程中，由于HIPE內(nèi)相的體積濃度高達(dá)80-90%，乳液的穩(wěn)定性是制備的 一個(gè)難點(diǎn)。同時(shí)，HIPE粘度很高，在外水相分散性不好，成球率低，球體大小不均勻，并且 Maganopore介質(zhì)的大孔徑造成比表面積很低（2-30m2/g)，孔壁很薄機(jī)械強(qiáng)度不夠高，容易 破碎，無(wú)法在大規(guī)模制備色譜上應(yīng)用。天津大學(xué)孫彥以無(wú)機(jī)顆粒為致孔劑制備出孔徑約為 500nm的球形介質(zhì)（Biotechnol. Prog, 2003, 19, 1300-1306)，制備的超大孔介質(zhì)在分離應(yīng) 用中效果較好。他們發(fā)現(xiàn)要得到貫穿的大孔徑，無(wú)機(jī)顆粒的體積含量應(yīng)為10-40%。然而，有 機(jī)高分子材料與無(wú)機(jī)顆粒之間的相容性差，要用有機(jī)高分子材料完全將大量的無(wú)機(jī)顆粒包 埋在內(nèi)，是一個(gè)難題。
[0005] 專利號(hào)為200510087138. 0的專利《一種超大孔聚合物微球的制備方法及其產(chǎn) 品》，為中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所的馬光輝等人利用表面活性劑反膠團(tuán)溶脹法制備了孔 徑達(dá)300-500nm左右的超大孔聚苯乙烯微球（Polymer, 2007,48:1981-1988)，這種方法 簡(jiǎn)單方便，重復(fù)性好，容易放大生產(chǎn)。但是制備過(guò)程中需要大量的表面活性劑(表面活性 劑的加入量達(dá)到單體量的40%)，為微球后續(xù)處理帶來(lái)麻煩，并且制備得到的超大孔聚苯 乙烯微球，由于疏水性較強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子存在非特異性吸附，在實(shí)際應(yīng)用中會(huì) 使生物大分子產(chǎn)生不可逆吸附而變性失活。同時(shí)聚苯乙烯表面缺乏能進(jìn)一步衍生的功能 基團(tuán)，需要進(jìn)行親水改性才能作為色譜基質(zhì)應(yīng)用（Langmuir，2008, 24(23) : 13646-13652 ; J. Chromatogr. A.，2009, 1216:6511-6516)。最近該研究所又報(bào)道了一種采用雙乳液模板 法制備具有微米級(jí)貫穿孔微球的方法（Colloid Polym Sci，2013, 291:117-126)。他們采 用線性聚合物作為高分子材料，聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作為表面活性劑，采用均質(zhì) 乳化方法得到復(fù)乳，然后通過(guò)溶劑提取固化。微球的直徑在30-100 μ m之間，表面孔徑在 0. 5-90 μ m之間。但是，這種制備微球的方法雖然方便，但是由于沒(méi)有交聯(lián)，微球強(qiáng)度較差， 用作色譜分離介質(zhì)有一定的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明克服了上述方法的不足，采用自制的雙親性兩嵌段含糖大分子單體作為表 面活性劑，通過(guò)懸浮聚合法制備微球。雙親性兩嵌段大分子單體會(huì)在油相中形成反膠團(tuán)，進(jìn) 一步吸水溶脹得到連續(xù)相乳液，升溫聚合時(shí)水相和聚合物發(fā)生相分離形成超大孔。由于在 吸水溶脹過(guò)程中親水性鏈段會(huì)自發(fā)排列在面向水通道的微球的外表面，疏水性鏈段則通過(guò) 雙鍵參與聚合反應(yīng)結(jié)合到微球骨架內(nèi)部，從而一步實(shí)現(xiàn)了超大孔聚合物微球的制備和表面 親水改性(見(jiàn)附圖1)。該親水性超大孔聚合物微球在酶固定化和蛋白質(zhì)快速分離純化領(lǐng)域 有廣泛的應(yīng)用空間。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種親水性超大孔聚合物微球的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
[0009] (1)以含糖單體或乙酸乙烯酯為單體，采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法（ATRP) 或電子活化再生原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法（AGET-ATRP)制備線性聚合物，反應(yīng)溫度為 IO-KKTC ;反應(yīng)時(shí)間為0. 5-6h ;單體濃度0. 1-10M，單體與引發(fā)劑的摩爾比范圍為10:1? 200:1，催化劑的加入量與引發(fā)劑相同，配體的加入量為催化劑的0. 5-3倍，反應(yīng)溶劑可選 甲苯、黎蘆醚、苯甲醚、溴苯、氯苯等有機(jī)溶劑的一種；反應(yīng)后用四氫呋喃（THF)或三氯甲烷 稀釋反應(yīng)產(chǎn)物并過(guò)氧化鋁柱除去催化劑，得到的無(wú)色溶液在甲醇中（當(dāng)單體為乙酸乙烯酯 時(shí)可用正己烷沉淀）沉淀兩次，室溫下抽濾，真空干燥后進(jìn)入步驟（2);
[0010] (2)以步驟（1)所得的線性聚合物作為大分子引發(fā)劑，苯乙烯為單體，