與哮喘相關(guān)的基因單核苷酸多態(tài)性位點、預(yù)測哮喘的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及與哮喘相關(guān)的基因 單核苷酸多態(tài)性位點、預(yù)測哮喘的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 兒童哮喘是一種嚴重影響小兒身心健康的最常見的呼吸道疾病，近年來兒童哮喘 的患病率及死亡率均有上升趨勢，1990年全國0-14歲兒童哮喘患病率調(diào)查結(jié)果為0. 91 %， 2000年已上升至1. 5%，這個數(shù)字意味著我國存在1000多萬哮喘病患兒?，F(xiàn)有研宄證實哮 喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，由于這種慢性炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在，導(dǎo)致氣道呈高反應(yīng)狀 態(tài)，當(dāng)接觸誘因時即會反復(fù)出現(xiàn)癥狀。臨床治療以抗炎和解除平滑肌痙攣的聯(lián)合治療為主。
[0003] 在 2000 年的亞太地區(qū)哮喘現(xiàn)狀研宄--AIRAP(AsthmaInsightsandReality InAsiaPacific)中，從中國區(qū)的調(diào)查報告顯示，我國哮喘控制狀況與GINA方案中提到的 哮喘長期管理目標相去甚遠。在兒童哮喘的診斷方面，基層醫(yī)療單位漏診、誤診，因此反復(fù) 濫用抗生素來治療兒童哮喘的現(xiàn)狀較為普遍。因此兒科醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)不斷提高兒童哮喘的 診治水平。
[0004] 哮喘是一種復(fù)雜的多因子、多基因遺傳病。中國期刊《第六屆江浙滬兒科學(xué)術(shù) 會議暨兒科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研宄進展學(xué)術(shù)班論文匯編》2009年，刊出的論文《RANTES基因 與Eotaxin-3基因單核苷酸多態(tài)性位點與漢族兒童哮喘關(guān)系研宄》，研宄了RANTES基因 C-28G、RANTES基因A403G單核苷酸多態(tài)性（SNP)以及嗜酸性粒細胞趨化蛋白（eotaxin-3) 基因C+77TSNP對漢族兒童哮喘的影響，結(jié)果表明RANTESC-28G和RANTESA-403G兩個SNP 位點與中國漢族兒童哮喘發(fā)生無關(guān)，Eotaxin-3C+7"7T是漢族兒童哮喘易感SNP位點，其中 Eotaxin-3C+77TT/T純合子基因型與哮喘發(fā)病明顯相關(guān)。中國期刊《上海交通大學(xué)》2009 年刊出的論文《漢族兒童哮喘易感基因預(yù)測模型的初步建立》，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性 片段長度多態(tài)性方法，對 8 個基因（IL13、IL4、IL4RA、ADRB2、FcER1、TGFB1、NOS1 和RANTES 基因）的 15 個單核苷酸多態(tài)性位點（IL13C-1112T、C1923T、A2044G，IL4C-590T，IL4RA I75V、Q551R，ADRB2R16G、Q27E，F(xiàn)cERlC-109T、E237G，TGFB1C-509T、R25P，N0S1C5266T， RANTESA-403G、G-28C)進行基因分型，對這些多態(tài)性位點進行單點、高階交互作用以及兩 兩協(xié)同作用分析，結(jié)果證明：①IL13A2044G、ADRB2R16G和FcERlC-109T三位點在兩組 間的基因型和等位基因頻率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均< 0.05)，病例組A2044G位 點GG基因型和G等位基因頻率，R16G位點AA基因型和A等位基因頻率，C-109T位點TT 基因型和T等位基因頻率均高于對照組。其余十二位點在兩組間的基因型和等位基因頻 率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值>〇. 05)。②MDR分析顯示，F(xiàn)cERlE237G、FcERlC-109T、 ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13 C-1112T組成最佳模型，其交叉驗證一致性為10/10,哮喘預(yù)測指標為：準確度92. 97 %，靈 敏度 97. 92%，特異度 88. 02%，OR(95%CI) = 345. 3478(117. 0514,1018. 9122)，x2 值= 286.3984，？值< 0.0001。@六01?2 1?166和？〇￡1?1(：-1091'，比13六20446和六01?2 1?166，ADRB2R16G和FcERlE237G兩兩之間對哮喘發(fā)生具有協(xié)同作用。最終得出以下結(jié)論：漢族 兒童哮喘易感基因預(yù)測模型初步建立，由FcERlE237G、FcERlC-109T、ADRB2R16G、IL4RA Q551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T九個單核苷 酸多態(tài)性位點組成，具有良好的哮喘預(yù)測效能，但該模型仍需進一步完善。
[0005] 然而，為更好的診斷兒童哮喘，建立更多的兒童哮喘易感基因預(yù)測模型仍然是十 分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種多個基因單核苷酸多態(tài)性位點 的組合。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的多個基因單核苷酸多態(tài)性位點的組合的用 途。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供檢測單核苷酸多態(tài)性位點IL13R110Q、IL4-590C>T、 ADRB2R16G和FcERlE237G的試劑組合的用途。
[0009] 本發(fā)明第四個目的是，提供一種評估個體患哮喘風(fēng)險的試劑盒。
[0010] 本發(fā)明第五個目的是，提供檢測單核苷酸多態(tài)性位點IL13R110Q、IL4-590OT或 FcERlE237G的試劑的用途。
[0011] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0012] 多個基因單核苷酸多態(tài)性位點的組合，所述的多個基因單核苷酸多態(tài)性位點包括 以下位點：IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcERlE237G。
[0013] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0014] 如上所述的多個基因單核苷酸多態(tài)性位點的組合在制備用于評估個體患哮喘風(fēng) 險的檢測裝置中的應(yīng)用。
[0015] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0016] 檢測單核苷酸多態(tài)性位點IL13R110Q、IL4-590OT、ADRB2R16G和FcERlE237G 的試劑組合在制備評估個體患哮喘風(fēng)險的試劑、試劑盒或檢測裝置中的應(yīng)用。
[0017] 所述的檢測單核苷酸多態(tài)性位點IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcERl E237G的試劑為：用于直接測序法的試劑；或用于聚合酶鏈式反應(yīng)與限制性片段長度多態(tài) 性分析相結(jié)合的試劑；或用于聚合酶鏈式反應(yīng)與直接測序法相結(jié)合的試劑；或用于以下任 一種SNP分型方法的試劑：基于雜交的方法、基于引物延伸的方法、基于構(gòu)象的方法或高分 辨率溶解曲線分析技術(shù)。
[0018] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0019] 一種評估個體患哮喘風(fēng)險的試劑盒，所述的試劑盒包含：檢測單核苷酸多態(tài)性位 點IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcERlE237G的試劑。
[0020] 所述的試劑盒包含SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 9-SEQIDNO. 12、SEQ 10勵.21-5￡〇10勵.24、5￡〇10勵.25-5￡〇10勵.28所示的核苷酸序列。
[0021] 為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0022] 檢測單核苷酸多態(tài)性位點IL13R110Q、IL4-590C>T或FcERlE237G的試劑在制備 評估個體患哮喘風(fēng)險的試劑、試劑盒或檢測裝置中的應(yīng)用。
[0023] 所述的檢測單核苷酸多態(tài)性位點IL13R110Q、IL4-590C>T或FcERlE237G的試劑 為：用于直接測序法的試劑；或用于聚合酶鏈式反應(yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合 的試劑；或用于聚合酶鏈式反應(yīng)與直接測序法相結(jié)合的試劑；或用于以下任一種SNP分型 方法的試劑：基于雜交的方法、基于引物延伸的方法、基于構(gòu)象的方法或高分辨率溶解曲線 分析技術(shù)。
[0024] 需要說明的是，檢測本發(fā)明的多個單核苷酸多態(tài)性位點可用本領(lǐng)域已知的多種技 術(shù)在DNA水平、RNA水平檢測本發(fā)明所述的多個單核苷酸多態(tài)性位點。例如：
[0025] 可以采用直接測序的方法，通過DNA直接測序可以直接揭示對照基因和攜帶突變 基因之間的序列差異，具體可以是傳統(tǒng)的使用商業(yè)測序試劑盒或自動測序儀對DNA直接進 行測序，或是近年來發(fā)展的焦磷酸測序（Pyrosequencing)、微測序（SNaPshot)等。焦磷酸 測序技術(shù)適于對已知的短序列的測序分析，其原理是引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶 (DNApolymerase)、ATP硫酸化酶（ATPsulfurytase)、焚光素酶（luciferase)和三磷酸腺 苷雙磷酸酶（Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次焚光信號 的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。SnaPshot技 術(shù)平臺是AppliedBiosystems，ABI公司推出了專為檢測SNP設(shè)計的分析軟件和試劑盒，可 對多個SNP位點同時進行基因分型，也被稱為minisequencing，該方法針對不同突變位點 設(shè)計不同長度的引物SNaPshot反應(yīng)后，產(chǎn)物通過電泳分離、五色焚光檢測、Genemapper分 析，可在一次電泳膠內(nèi)檢測多個SNP位點。
[0026] 也可以采用基于雜交的方法，具體包括Taqman探針法，DNA芯片法等。TaqManSNP 基因分型原理：利用核酸外切酶對5'特異等位基因染色標記的切除產(chǎn)生持續(xù)的檢驗信號， 反應(yīng)體系包括：以基因組DNA或PCR產(chǎn)物為模板；一對PCR引物，以及分別用FAM和VIC標 記的2條MGB探針檢測S