具有高效降解亞硝酸鹽和強(qiáng)產(chǎn)酸功能的植物乳桿菌菌株及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株具有高效降解亞硝酸鹽功能和強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌新菌株 及其用途，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)酵蔬菜是我國傳統(tǒng)的蔬菜加工制品之一，風(fēng)味獨(dú)特，具有開胃健脾的功效，自古 以來在餐桌上占有不可替代的一席之地。傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜是以蔬菜為原料，利用蔬菜自身 攜帶的微生物（主要是乳酸菌）進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，降低發(fā)酵蔬菜pH值，在乳酸菌的代謝過程 中，產(chǎn)生細(xì)菌素，提高發(fā)酵蔬菜的抗菌活性，結(jié)合食鹽的高滲透壓作用，共同抑制其他有害 微生物的生長，防止蔬菜腐敗變質(zhì)；另外在蔬菜的發(fā)酵過程中會形成具有獨(dú)特風(fēng)味的有機(jī) 物質(zhì)（多糖、檸檬酸、乳酸、醋酸、雙乙酰等）；而乳酸菌本身具有協(xié)調(diào)人體代謝、抗腫瘤、降 低膽固醇水平、改善肝功能、緩解乳糖不耐癥和增強(qiáng)免疫等保健功能活性。蔬菜通過發(fā)酵加 工可延長保質(zhì)期，便于包裝運(yùn)輸，調(diào)劑蔬菜淡旺季，從而做到全年均衡供應(yīng)，滿足人們對蔬 菜制品日益增長的需要。
[0003] 傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜存在發(fā)酵周期長，生產(chǎn)力不高，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制，不利于工廠化， 規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，同時還存在食鹽、亞硝酸鹽含量高等問題。在日常膳食中，高鹽的攝 入會使人產(chǎn)生高血壓，骨質(zhì)疏松等癥狀。
[0004] 亞硝酸鹽含量超標(biāo)是一個困擾蔬菜發(fā)酵生產(chǎn)廠家和消費(fèi)者的嚴(yán)重問題，亞硝酸鹽 會對人體產(chǎn)生多種危害，微生物和酶對蔬菜中蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸有降解作用，致使發(fā)酵 蔬菜中存在一定量的胺類物質(zhì)，這些物質(zhì)與亞硝酸鹽在一定條件下合成強(qiáng)致癌物質(zhì)N-亞 硝基化合物。胃癌、食道癌等消化系統(tǒng)癌癥高發(fā)地區(qū)往往與其膳食中過量的硝酸鹽和亞硝 酸鹽有關(guān)。因此，嚴(yán)格控制發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量是保證其食用安全的一個重要措施。
[0005] 接種發(fā)酵技術(shù)不僅避免了季節(jié)的限制，而且通過發(fā)酵過程的控制能夠有效的避免 有害微生物的侵害，縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的含量，提高發(fā)酵蔬菜制品質(zhì) 的穩(wěn)定性。因此，篩選具有降解亞硝酸鹽功能的優(yōu)良發(fā)酵菌種是當(dāng)前研宄的熱點(diǎn)。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題目前對發(fā)酵蔬菜中乳酸菌的分離鑒定進(jìn)行了大量的研宄工作，但真正 實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的還不多見。針對這一現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一株具有高效降解亞硝酸鹽功能 和強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌菌株FM-LP1-1及其在蔬菜發(fā)酵中的用法，用于發(fā)酵蔬菜的工 業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明涉及一株具有高效降解亞硝酸鹽和強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌菌株 FM-LP1-1及其用法，其內(nèi)容和實(shí)施方案如下：
[0009] -株具有高效降解亞硝酸鹽和強(qiáng)產(chǎn)酸功能的植物乳桿菌菌株，命名為FM-LP1-1， 經(jīng)鑒定該菌為植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)，該菌株于2014年8月4在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號是CGMCCNO. 9488。
[0010] 所述的植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LPl_l可以作為發(fā)酵菌的應(yīng) 用。
[0011] 植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LP1-1 在含有 200mg/L似腸2的MRS 培養(yǎng)液中，接種該菌的菌體密度為1. 〇 1X107?1. 54X10 7cfu/ml，25 °C條件下培養(yǎng)24h， NaN02的降解率達(dá)到97. 5%以上，培養(yǎng)48h，NaNO2的降解率達(dá)到99. 1 %以上。在MRS培養(yǎng) 液中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液的pH值達(dá)到3. 51。
[0012] 所述植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LPl_l可以在制作泡菜或酸菜的 發(fā)酵劑方面的應(yīng)用。
[0013] 用所述植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LPl_l制作的泡菜或酸菜的發(fā) 酵劑。
[0014] 所述的發(fā)酵劑，其特性在于，植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LPl_l 生長至穩(wěn)定前期的FM-LP1-1菌液經(jīng)離心濃縮后，用凍干保護(hù)液進(jìn)行重懸后，-20°C預(yù) 凍5?8h后用冷凍干燥器進(jìn)行凍干，獲得FM-LP1-1菌的凍干粉，凍干粉的菌體密度在 1. 01XlO11^ 5. 01X10ncfu/g〇
[0015] 用所述的植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LPl_l發(fā)酵獲得的泡菜產(chǎn) 品。
[0016] 用所述的植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)FM-LPl_l發(fā)酵制作的酸菜產(chǎn) 品。
[0017] 有益效果
[0018] 本發(fā)明以MRS培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，從南京地區(qū)家庭自制泡菜及沈陽地區(qū)農(nóng)家自 制酸菜樣品中分離篩選到51株單菌落，根據(jù)革蘭氏染色和過氧化氫接觸酶實(shí)驗結(jié)果，初步 鑒定出23株乳酸菌，以亞硝酸鹽降解率、產(chǎn)酸能力和菌體的生長性能為目標(biāo)進(jìn)行篩選，篩 選出5株亞硝酸鹽降解率大于80%、菌液pH值低于3. 80和菌液的0D_大于2. 30的菌株。 然后以膽鹽耐受性試驗、耐酸性試驗、耐滲透壓試驗進(jìn)行復(fù)篩，綜合復(fù)篩試驗結(jié)果，篩選出 一株具有高效降解亞硝酸鹽、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐酸性能高和耐滲透壓性能高的乳酸菌，命名為 FM-LP1-1，通過測定16srDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和生理生化試驗鑒定該菌株，鑒定結(jié) 果是該菌株為植物乳桿菌，于2014年8月4在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心進(jìn)行保藏，保藏號是CGMCCNO:9488。
[0019] 本發(fā)明提供一株新的植物乳桿菌菌株FM-LP1-1，該菌株不僅具有高效降解亞硝酸 鹽能力、強(qiáng)產(chǎn)酸能力、較高的耐膽鹽能力，并且該菌具有優(yōu)良的發(fā)酵性能和耐滲透壓性能， 可以作為發(fā)酵菌種進(jìn)行蔬菜發(fā)酵，經(jīng)該菌株發(fā)酵的泡菜和酸菜，發(fā)酵風(fēng)味優(yōu)良，且亞硝酸鹽 含量低，為發(fā)酵蔬菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的菌株資源。FM-LP1-1接種發(fā)酵明顯縮短泡 菜的發(fā)酵時間，在發(fā)酵3d，發(fā)酵泡菜的pH值達(dá)到了 3左右，已經(jīng)成熟，亞硝酸鹽的含量為 0. 89mg/kg左右，遠(yuǎn)低于發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)（<20mg/kg)而自然發(fā)酵的泡菜還 沒有成熟，其pH值為4.4左右，亞硝酸鹽的含量為23.24±2.3311^/1^，高于發(fā)酵蔬菜中亞硝 酸鹽含量的標(biāo)準(zhǔn)。
[0020] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下：
[0021] 1?植物乳桿菌（Lactobacilius plantarum)FM-LPl_l，來源于南京地區(qū)的傳統(tǒng)的 發(fā)酵蔬菜制品中，來源比較安全。
[0022] 2?植物乳桿菌（Lactobacilius plantarum)FM-LPl_l，不僅具有高效的降解亞硝 酸鹽的能力、較高的產(chǎn)酸和耐酸能力和較高的耐膽鹽能力，并且具有較強(qiáng)耐滲透壓能力和 優(yōu)良的發(fā)酵性能，可作為發(fā)酵菌種進(jìn)行蔬菜的發(fā)酵，提高蔬菜發(fā)酵制品的食用安全性。
[0023] 3?植物乳桿菌（Lactobacilius plantarum)FM-LPl_l，為蔬菜發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn) 提供可靠的菌種資源。 四、
【附圖說明】
[0024] 圖1FM-LP1-1平板菌落形態(tài)
[0025] 圖2FM-LP1-1菌體形態(tài)
[0026] 生物保藏
[0027]FM-LP1-1，植物乳桿菌（Lactobaciliusplantarum)，于 2014 年 8 月 4 日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中 科院微生物研宄所，保藏號是CGMCCNO. 9488。 五、
【具體實(shí)施方式】
[0028] 1、菌株的初篩
[0029] 從南京地區(qū)家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜和沈陽地區(qū)農(nóng)家自制的傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中發(fā) 酵蔬菜汁，將樣品用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（1〇入1〇_ 2、1〇_3、1〇_4、1〇_5、1〇_6)，取后四個梯度稀 釋樣品100ul均勻涂布至MRS瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度做3個平行，30°C恒溫培養(yǎng)48h，挑 選具有典型乳酸菌菌落形態(tài)的單菌落在MRS平板上進(jìn)行劃線純化，傳代3-4次，經(jīng)鏡檢為 純種后，結(jié)合菌落形態(tài)，革蘭氏染色和接觸酶試驗，初篩獲得23株乳酸菌，將其依次編號 為FM-LP1-1、FM-LP1-2、FM-LP1-3、FM-LP1-4、FM-LP1-5、FM-LP1-6、FM-LP1-7、FM-LP1-8、 FM-LP卜9、FM-LP2-1、FM-LP2-2、FM-LP2-3、FM-LP2-4、FM-LP2-5、FM-LP2-6、FM-LP2-7、 FM-LP3-1、FM-LP3-2、FM-LP3-3、FM-LP3-4、FM-LP3-5、FM-LP3-6、FM-LP3-7。挑取初步篩選 出的23株目標(biāo)菌株的單菌落接種MRS液體培養(yǎng)基，30°C靜止培養(yǎng)至穩(wěn)定期，按1 %的接種 量接種至含有200mg/L的MRS液體培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，采用格里斯比色法測定 MRS液體中NaN02的含量，采用分光光度法檢測菌體密度，用pH計測定菌液的pH值，結(jié)果見 表 1。從表 1 中可以看出，菌株FM-LP1-1、FM-LP1-2、FM-LP1-7、FM-LP2-1、FM-LP3_5 的降解 亞硝酸鹽的活性較高，亞硝酸鹽降解率在80%以上，菌體密度0D_值在2. 30以上，菌液的 pH值在3. 80以下。
[0030] 表1不同菌株的菌體密度和亞硝酸鹽降解率
[0031]
【主權(quán)項】
1. 一株具有高效降解亞硝酸鹽和強(qiáng)產(chǎn)酸功能的植物乳桿菌菌株，命名為FM-LP1-1，經(jīng) 鑒定該菌為植物乳桿菌該菌株于2014年8月4在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號是CGMCC NO. 9488。
2. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌（的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，是指植物乳桿菌（Zac(oAaciBiys p/a/? (a/??) FM-LP1-1作為發(fā)酵菌的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，是指植物乳桿菌（ FM-LP1-1在含有200 mg /L似勵2的MRS培養(yǎng)液中，接種該菌的菌體密度為 1.01\107^1.54\107〇包/1111，25°〇條件下培養(yǎng)24 11，似冊2的降解率達(dá)到97.5%以上， 培養(yǎng)48h，NaN02的降解率達(dá)到99. 1 %以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，是指植物乳桿菌（ FM-LP1-1在MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液的pH值達(dá)到3. 51。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，是指植物乳桿菌（Zac(oAaciBitts p/a/? (a/??) FM-LP1-1在制作泡菜或酸菜的發(fā)酵劑方面的應(yīng)用。
7. 用權(quán)利要求1所述植物乳桿菌（/^/a/?(ara?)FM-LPl-l制作的泡菜 或酸菜的發(fā)酵劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的發(fā)酵劑，其特性在于，植物乳桿菌（ /77a/7tei??)FM-LPl-l生長至穩(wěn)定前期的FM-LP1-1菌液經(jīng)離心濃縮后，用凍干保護(hù)液進(jìn)行 重懸后， _20°C預(yù)凍5~8 h后用冷凍干燥器進(jìn)行凍干，獲得FM-LP1-1菌的凍干粉，凍干粉的 菌體密度在 1. 01 X lO11^ 5. 01 X 10 11 cfu/g。
9. 用權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌（LactoAaciBiys /^/a/?(ara?)FM-LPl-l發(fā)酵獲得 的泡菜產(chǎn)品。
10. 用權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌/^/a/?(ara?)FM-LPl-l發(fā)酵制作 的酸菜產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株具有高效降解亞硝酸鹽和強(qiáng)產(chǎn)酸功能的植物乳桿菌菌株及其用途，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。從沈陽農(nóng)戶家中傳統(tǒng)的發(fā)酵酸菜中選到1株具有高效降解亞硝酸鹽和強(qiáng)產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌新菌株，命名為FM-LP1-1，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌( Lactobacillius plantarum )，該菌株于2014年8月4在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號是CGMCCNO.9488.以FM-LP1-1作為蔬菜發(fā)酵的發(fā)酵劑，能夠有效降低發(fā)酵蔬菜制品的亞硝酸鹽含量，縮短蔬菜的發(fā)酵時間，提高蔬菜的發(fā)酵風(fēng)味，具有廣泛的應(yīng)用前景。CGMCC No.948820140804
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-25, A23L1-218
【公開號】CN104531578
【申請?zhí)枴緾N201410805862
【發(fā)明人】王英, 周劍忠, 李清, 夏秀東, 李瑩, 劉小莉, 張麗霞, 黃自蘇
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月22日