專利名稱:初級(jí)細(xì)胞的永久化的制作方法
此申請(qǐng)為1986年2月28日提交的835，089號(hào)待批申請(qǐng)的繼續(xù)部分。
本發(fā)明是關(guān)于以致癌基團(tuán)DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染初級(jí)細(xì)胞，應(yīng)用電穿孔技術(shù)將此DNA轉(zhuǎn)移到這些細(xì)胞中以生產(chǎn)永久化初級(jí)細(xì)胞的一種方法。
將DNA轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的研究中，作出了重要的貢獻(xiàn)。這一技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)新的基因，而分子探針則對(duì)其并不適用。慣常引導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞的種種方法，可分為自然的和人工的兩個(gè)系統(tǒng)。
“自然的”轉(zhuǎn)染是通過(guò)完整的(或經(jīng)遺傳操縱處理的)病毒感染細(xì)胞來(lái)完成的。來(lái)自病毒(DNA，RNA)的遺傳信息可被整合到宿主細(xì)胞DNA中，結(jié)果導(dǎo)致縮主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用。
“人工的”轉(zhuǎn)染是在試管中操作處理DNA并將其導(dǎo)入不同起源的完整細(xì)胞，通常用化學(xué)的或手工的方法來(lái)完成。若干技術(shù)已發(fā)展到引導(dǎo)DNA進(jìn)入體細(xì)胞中。這些技術(shù)可分為下述五種，依靠這些不同的方法將大分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)1.微量注射法〔Graessmann等，Hoppe-seyler′s Z Physiol.Chem.，352，527-532，(1971);Capecchi，Cell，22，470-488(1980)〕。
2.載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移一、紅細(xì)胞影〔Furusawa等，Methods in Cell Biol.，14，17-80，(1976)〕。
-脂質(zhì)體〔Poste等，細(xì)胞生物學(xué)方法，(Method in Cell Biol.，14，33-71(1976);Gregoriadis等Nature，224，170-172(1973)〕
-重建的仙臺(tái)病毒被膜〔Loyter等，Exp.Cell Res.，139，223-234(1983)〕。
3.借助促進(jìn)劑轉(zhuǎn)移-磷酸鈣〔Graham等，Virology，52，456-467，(1973)〕。
-磷酸鈣/聚乙二醇-二甲亞砜(DMSO)震蕩(Shock)〔Jonak等，“Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines(Progress and Applications)，”Plerum Press，418-422，(1984)〕。
-DEAE-葡聚糖〔Graham，Adv.Cancer Res.，25，1-51，(1977)〕。
-聚乙二醇/蔗糖震蕩〔Chu等，Gene，13，197-202(1981)〕。
4.激光微光束〔Tsukakoshi等，Applied Physics B.，35，2284-2289，(1984)〕。
5.電穿孔(electroporation)〔Neumann等，Embo.J.，1，841-845，(1982);Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，(1984)〕這些技術(shù)已用于引導(dǎo)DNA，RNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，藥物，小分子以及細(xì)胞器和病毒顆粒進(jìn)入體細(xì)胞。每一種技術(shù)都有其使用限制，而且某些生物學(xué)問(wèn)題只有使用特定方法才得以最好的解決。
DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，通常是由各種改進(jìn)的磷酸鈣-DNA沉淀技術(shù)完成的。此方法需有磷酸鈣-DNA-共沉淀物的形成(45分鐘)和將受體細(xì)胞與共沉淀物作較長(zhǎng)時(shí)間保溫(2小時(shí))。之后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞的類似過(guò)程收集沉淀物〔Loyter等，Ciba Found.，symp.，103，163-175(1982)〕。此技術(shù)需要應(yīng)用具有胞吞潛力的成纖維細(xì)胞起源的特異細(xì)胞，從而限制了它的應(yīng)用。
各種類型細(xì)胞都有特異的效率并借以使之得以被轉(zhuǎn)染。盡管有這些區(qū)別，但各種不同類型的細(xì)胞均已成功地用于轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞包括正常細(xì)胞如淋巴細(xì)胞，此淋巴細(xì)胞是在懸浮液中使用磷酸鈣DNA共沉淀/聚乙二醇-DMSO技術(shù)被轉(zhuǎn)染的〔Jonak等，Hybridoma，3，107-118(1984)〕。
先前的實(shí)驗(yàn)〔Jonak等，Hybridoma，上已引用〕業(yè)已表明，將由人白血病細(xì)胞分離的DNA為借助磷酸鈣DNA-共沉淀/聚乙二醇-DMSO介異導(dǎo)的釋放引入到受刺激過(guò)的初級(jí)小鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生有能力在培養(yǎng)中連續(xù)增殖的細(xì)胞系。因此，用致癌基因DNA經(jīng)這種釋放技術(shù)轉(zhuǎn)染正常的、刺激過(guò)的淋巴細(xì)胞，已表明是一種使小鼠淋巴細(xì)胞不會(huì)死亡并在培養(yǎng)中持續(xù)地保持這些細(xì)胞的新的方法學(xué)。此種新的細(xì)胞系(永久化的小鼠淋巴細(xì)胞)會(huì)以單克隆的形式生產(chǎn)其產(chǎn)物。
Potter等(引文同上)和Celis〔Biochem.J.，223，281-291，(1984)〕研究了可通過(guò)電穿孔將被克隆的人和小鼠的IgK基因引入到小鼠前-B細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并揭示此方法可適用于許多類型的細(xì)胞，包括那些對(duì)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法難于奏效的細(xì)胞。
Van Brunt〔Biotechnology，3，187-191，(1985)〕綜述了在電場(chǎng)中融合細(xì)胞的新方法學(xué)，并指出在Technicleone公司工作的Lundak及其同事已從人癌細(xì)胞分離了myc基因，將其克隆，插入質(zhì)粒，并用一高電壓脈沖以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抗體的人淋巴球。結(jié)果得到一個(gè)至少已經(jīng)穩(wěn)定了8個(gè)月的細(xì)胞系。Van Brunt的文章并不能使本領(lǐng)域內(nèi)熟練的技術(shù)人員重復(fù)Lundak的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槠渲袥](méi)有披露(a)必需用多大電壓的脈沖，(b)是否這樣的細(xì)胞必須在轉(zhuǎn)染之前經(jīng)激活/或刺激過(guò)，(c)在給予脈沖前，如何使細(xì)胞和質(zhì)粒靠得最近，(d)要給多少脈沖，(e)各脈沖的適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度(脈沖時(shí)間)和振幅，(f)細(xì)胞和致癌基因DNA的適當(dāng)濃度，(g)所用的“myc”基因的性質(zhì)和起源，(h)使細(xì)胞在培養(yǎng)中得以增殖并維持其無(wú)限增殖的組織培養(yǎng)條件。
本發(fā)明是關(guān)于生產(chǎn)永久化的初級(jí)細(xì)胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、被激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞;
(b)經(jīng)電穿孔用致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染了的初級(jí)細(xì)胞;和(c)從這種轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞中回收永久化了的初級(jí)細(xì)胞系。
在上述的(b)步驟中用于轉(zhuǎn)化初級(jí)細(xì)胞的致癌基因DNA/致癌基因在通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染之前，可任意選擇地包含于脂質(zhì)體之中。
本發(fā)明還涉及通過(guò)該方法生產(chǎn)永久化的初級(jí)細(xì)胞系。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)生物制品的一種方法，制品的編碼序列是由包含在本發(fā)明的永久化初級(jí)細(xì)胞系內(nèi)的DNA組成的。該方法包括在能夠生產(chǎn)這種生物制品的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞系、“編碼序列”包括那些用來(lái)制備本發(fā)明之永久化初級(jí)細(xì)胞系的正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞的、天然地存在于DNA內(nèi)的編碼序列以及包含在用于本發(fā)明方法的致癌基因DNA/致癌基因的編碼序列。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)含有一外源功能性DNA序列的共轉(zhuǎn)染的永化初級(jí)細(xì)胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞;
(b)用致癌基團(tuán)DNA/致癌基因和外來(lái)功能性DNA序列的經(jīng)電穿孔共轉(zhuǎn)染上述的初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞;并(c)從此種共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞中回收含有外來(lái)功能性DNA序列的共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系。
本發(fā)明還涉及利用這一方法生產(chǎn)共轉(zhuǎn)染的永久化的初級(jí)細(xì)胞系。
本發(fā)明也涉及一生產(chǎn)物制品的方法，其“密碼序列”是由包含于本發(fā)明的共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞內(nèi)的DNA組成的，該方法包括在能夠生產(chǎn)這種生物制品的條件下培養(yǎng)上述的細(xì)胞系。
“密碼序列”包括由在本發(fā)明的方法中用于轉(zhuǎn)染的致癌基因DNA/致癌基因組成的，外來(lái)功能性DNA序列的編碼序列以及那些“自然存在”于為制備本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化細(xì)胞系而用作DNA受體細(xì)胞的正常的、激發(fā)/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞內(nèi)的DNA編碼序列。
此發(fā)明還涉及一永久化初級(jí)細(xì)胞系，條件是這種永久化作用是用主要含有致癌基因DNA轉(zhuǎn)染正常初級(jí)細(xì)胞系的結(jié)果。
在前述步驟(b)中，用于轉(zhuǎn)染初級(jí)細(xì)胞的致癌基因DNA和外源功能性DNA在經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染之前，可有選擇性地含于脂質(zhì)體之中。
Jonak等〔Hybridoma，3，107-118(1984)〕曾報(bào)導(dǎo)將人白血病細(xì)胞DNA由磷酸鈣DNA-共沉淀/聚乙二醇-DMSO介導(dǎo)的釋放引入經(jīng)刺激過(guò)的小鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)，可產(chǎn)生能夠在培養(yǎng)中連續(xù)增殖的細(xì)胞系?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用致癌基因DNA轉(zhuǎn)染初級(jí)細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞)以影響這類細(xì)胞的永久化，取決于用于釋放這樣的DNA進(jìn)入細(xì)胞的方法學(xué)，以及受體細(xì)胞的功能狀態(tài)和用于使之永久化的致癌基因的來(lái)源。例如，磷酸鈣DNA共沉淀技術(shù)，在此種技術(shù)中B淋巴細(xì)胞均與共沉淀物一同保溫，并借助聚乙二醇-DMSO震蕩處理(Jonak等，Hybridoma，引文同上)以促進(jìn)DNA進(jìn)入被用來(lái)將致癌基因DNA轉(zhuǎn)染到各種初級(jí)免疫細(xì)胞(即造血細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞)內(nèi)，以試圖使這類細(xì)胞永久化。這種方法就其產(chǎn)生永久化細(xì)胞系的效率來(lái)說(shuō)，只是偶然地獲得成功。此外，磷酸鈣-DNA共沉淀技術(shù)還有與受體細(xì)胞的性質(zhì)有關(guān)的其它一些限制。例如，初級(jí)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和具有胞吞潛在能力的成纖維細(xì)胞起源的某些細(xì)胞除外)均無(wú)吞噬能力，因此攝入磷酸鈣-DNA共沉淀物并不是將DNA引入這些細(xì)胞的一個(gè)非常有效的方法。同樣，磷酸鈣-DNA共沉淀法的另一限制是此法是復(fù)雜的而且包括使初級(jí)免疫細(xì)胞與高濃度鹽溶液接觸將會(huì)直接影響這些細(xì)胞的生存能力并干擾此方法的轉(zhuǎn)染效率。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，電穿孔能可靠地應(yīng)用于有效地轉(zhuǎn)染從造血和非造血細(xì)胞起源的正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞，用致癌基因有效地制得永久化初級(jí)細(xì)胞系。
“初級(jí)細(xì)胞”一詞，是指為從未曾預(yù)先經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)或曾預(yù)培養(yǎng)過(guò)但未經(jīng)過(guò)無(wú)限期地組織培養(yǎng)的活的生物體得來(lái)的任何細(xì)胞，造血組織起源的初級(jí)細(xì)胞更為適用，特別是多潛能干細(xì)胞，B-淋巴細(xì)胞，B-系細(xì)胞前體，T-淋巴細(xì)胞，T-系細(xì)胞前體，髓樣干細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性白細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和肥大細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可用常規(guī)技術(shù)分離。
“永久化的初級(jí)細(xì)胞’一詞，是指那些用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)染后能在培養(yǎng)中連續(xù)增殖的初級(jí)細(xì)胞，此類細(xì)胞如未經(jīng)這樣的轉(zhuǎn)染便不能增殖。
“正常的初級(jí)細(xì)胞”是指非永久化的初級(jí)細(xì)胞，如果這種正常初級(jí)細(xì)胞是首先經(jīng)過(guò)激活/刺激的，即能夠用本發(fā)明的方法使之永久化?！敖?jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞”是指能夠用本發(fā)明的方法產(chǎn)生永久化的正常初級(jí)細(xì)胞，這種經(jīng)激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞，可通過(guò)將這些細(xì)胞暴露于刺激/激活劑中而制得?！按碳?激活劑”是指一種能刺激正常初級(jí)細(xì)胞增殖(有限的生命期限)的藥劑，這樣的藥劑是本技術(shù)中眾所周知的。經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞的制備方法是本領(lǐng)域中人所共知的。更為可取的是，此刺激/激活劑也能刺激正常的初級(jí)細(xì)胞分化，被應(yīng)用于激活/刺激正常B細(xì)胞的、適用的激活/刺激劑包括抗原、分裂素和生長(zhǎng)因子。如果需要通過(guò)本發(fā)明的永久化初級(jí)細(xì)胞系生產(chǎn)一特異的單克隆抗體，則要用已知的抗原作為刺激/激活劑。例如經(jīng)激活/刺激的B淋巴細(xì)胞，是一種已經(jīng)受到抗原攻擊并已分化成產(chǎn)生抗體細(xì)胞的一種淋巴細(xì)胞，這種抗體對(duì)于攻擊抗原的一種抗原決定因素是特異的。從而，即可用本發(fā)明的方法使這樣的被激活/刺激的B淋巴細(xì)胞永久化。用于激活/刺激正常初級(jí)細(xì)胞而不是B細(xì)胞的適當(dāng)?shù)拇碳?激活劑包含分裂素和生長(zhǎng)因子。分裂素是在技術(shù)中已知的。應(yīng)注意到的是，特異的分裂素可能更適合于特殊類型的正常初級(jí)細(xì)胞。例如，脂多糖(LPS)是更適用于刺激/激活正常B細(xì)胞的分裂素;伴刀豆球蛋白A是更適用于刺激/激活正常T細(xì)胞(它刺激分化和增殖)的分裂素;美國(guó)商陸分裂素是適用于刺激/激活正常B細(xì)胞或正常T細(xì)胞的分裂素(它刺激分化及增殖);胰島素和聚肉豆蔻酸(PMA)則為更適用于刺激/激活正常成纖維細(xì)胞的分裂素。
所采用的最適刺激/激活劑和刺激/激活正常初級(jí)細(xì)胞的最適條件，可由本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員使用通常技術(shù)來(lái)確定。并將取決于所應(yīng)用的初級(jí)細(xì)胞類型和特殊刺激/激活劑等其它因素。
“致癌基因DNA/致癌基因”一詞，是指當(dāng)用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)染到正常、激活的初級(jí)細(xì)胞時(shí)，會(huì)使這些細(xì)胞永久化的任何DNA序列。此中所用的“致癌基因DNA”包括來(lái)自腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系的DNA，當(dāng)用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)染到這種初級(jí)細(xì)胞內(nèi)時(shí)，會(huì)使正常，經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞永久化。致癌基因是分離到的已知其在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞中起作用的DNA序列。本文所說(shuō)的“致癌基因”，包括當(dāng)用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)染到這種細(xì)胞內(nèi)時(shí)，能使正常、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞永久化的任何分離的DNA序列。重要的是要注意到按本發(fā)明的方法使特殊的正常的激活的初級(jí)細(xì)胞永久化可能需要不止一種類型的致癌基因。可依照本發(fā)明的方法用于使正常、激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞永久化的優(yōu)選致癌基因包括來(lái)自初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤的初級(jí)細(xì)胞系的致癌基因，其中癌或癌細(xì)胞系具有與被永久化的初級(jí)細(xì)胞相一致的起源。按照本發(fā)明的方法，更為適用于使正常、激活/刺激過(guò)的B細(xì)胞永久化的致癌基因是從T-24人膀胱癌細(xì)胞系分離到的Ha-ras致癌基因，此可從美國(guó)馬里蘭州羅克維爾市美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心〔American Typeculture Collection Rockville，Maryland，U.S.A.(ATCC)〕得到，其登記號(hào)為ATCC HTB4.(Haras)以及P53致癌基因(P53-H7克隆，此克隆從Varda Rotton醫(yī)生處獲得;對(duì)此克隆的詳細(xì)敘述見(jiàn)Molecular and Cel-lular Biology，Vol.5，NO.8，Pages 1887-1893，1985)。依照本發(fā)明的方法，更為適用于使正常的激活的/刺激的B細(xì)胞永久化的致癌基因DNA，包括得自人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞，即所謂REH細(xì)胞系(可從ATCC得到，其登記號(hào)為CRL8286)或EL4小鼠胸腺瘤細(xì)胞系(可從ATCC得到，其登記號(hào)為TIB39)的基因組DNA;以及來(lái)自腫瘤B細(xì)胞系或B細(xì)胞腫瘤、特別是B細(xì)胞淋巴腫瘤如美國(guó)費(fèi)城兒童醫(yī)院病毒室W.Henle醫(yī)生建株的人Burkitt′s淋巴腫瘤細(xì)胞系(BJAB)的基因組DNA。更適合于按本發(fā)明的方法使正常、經(jīng)激活/刺激的T細(xì)胞永久化的致癌基因DNA包括得自T細(xì)胞腫瘤或腫瘤T細(xì)胞系(如EL4)的基因組DNA。更適合于按本發(fā)明的方法使其他正常、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞永久化的致癌基因DNA包括從初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤初級(jí)細(xì)胞系得到的基因組DNA，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與要進(jìn)行永久化的正常初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。例如，上皮細(xì)胞起源的腫瘤DNA，更適合于按本發(fā)明的方法使正常、經(jīng)激活/刺激過(guò)的初級(jí)上皮細(xì)胞永久化。其他適用于制備本發(fā)明的永久化細(xì)胞系的致癌基因DNA/致癌基因，可使用本發(fā)明方法由熟煉的技術(shù)人員確定，并取決于諸如致癌基因DNA/致癌基因的來(lái)源和所用的正常、經(jīng)激活的初級(jí)細(xì)胞類型等許多因素。近來(lái)文獻(xiàn)中曾報(bào)告了許多不同的致癌基因DNA/致癌基因，某些致癌基因DNA/致癌基因可以從不同來(lái)源如ATCC得到。
“電穿孔”一詞，意為使細(xì)胞暴露于高壓電脈沖。從而使細(xì)胞膜更易于通過(guò)某些高分子量的大分子如DNA。電穿孔用能發(fā)射高壓電脈沖的任何儀器作用于含有細(xì)胞和DNA的容器。例如，有許多可在市場(chǎng)買到的電融合系統(tǒng)，如BTX電動(dòng)細(xì)胞操作器(BTX Electro Cell Manipulator)，比較好的有401型(美國(guó)加州圣迭戈BTX出品)，技術(shù)人員可將其配備電穿孔儀器使用。再者，可用Potter等的方法，(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，1984)完成電穿孔。如果采用Potter的方法則最好用LKB＃2197電源(瑞曲LKB公司)作電脈沖電源。
“高電壓”一詞，是指電壓在1000伏/厘米左右到約5500伏/厘米之間。最適電壓可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)正常、被激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞的性質(zhì)，致癌基因DNA/致癌基因源的性質(zhì)，細(xì)胞和/或DNA濃縮細(xì)胞密度及所用的電穿孔裝置的性質(zhì)等各種不同因素來(lái)確定。
本發(fā)明涉及生產(chǎn)永久化初級(jí)細(xì)胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞;
(b)經(jīng)電穿孔，用致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染此初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞;并(c)從轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞中回收永久化了的初級(jí)細(xì)胞系。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的永久化了的初級(jí)細(xì)胞系。
通過(guò)電穿孔，應(yīng)用一般方法學(xué)將致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染到正常的、經(jīng)激活的/刺激的初級(jí)細(xì)胞內(nèi)的方法如下用常規(guī)技術(shù)分離正常的初級(jí)細(xì)胞。分離細(xì)胞后按上述方法(體內(nèi)刺激)激活/刺激之，或者作為正常、被激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞從曾在體內(nèi)暴露于適當(dāng)?shù)拇碳?激活劑的供體(活的生物體)內(nèi)分離得到。之后將這些正常、被激活/刺激的細(xì)胞懸浮于保護(hù)培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度最好為大約5×106到約2×107細(xì)胞/毫升。
“保護(hù)”培養(yǎng)基是指在電穿孔期間，可維持正常、被激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞存活力的任何培養(yǎng)基?？蓱?yīng)用于本發(fā)明之方法的保護(hù)培養(yǎng)基的例子包括緩沖液和非離子溶液，如磷酸緩沖鹽水(PBS)(pH約7)和葡萄糖(0.3摩爾)。PBS是最為適用的。如果應(yīng)用PBS，優(yōu)選的電壓條件為1000伏/厘米。如果用葡萄糖(0.3摩爾)則以5500伏/厘米的電壓更為合適。
正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞在保護(hù)培養(yǎng)基中混懸之后，將致癌基因DNA(以約1微克/毫升到約100微克/毫升為較合適)或致癌基因(10毫微克/毫升到約10微克/毫升)加入此懸浮液。加到懸浮液中的致癌基因可以游離DNA的形式，包括基因組DNA或一適當(dāng)?shù)闹亟MDNA載體，或者可將DNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，此脂質(zhì)體用對(duì)正常的、激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞表面的至少一種抗原決定簇是特異的抗體作包被的?！斑m當(dāng)?shù)闹亟MDNA載體”，是指由重組DNA技術(shù)制備的載體，其含有一可操縱地連接于致癌基因DNA/致癌基因的表達(dá)控制序列。重組DNA載體的制備，技術(shù)上是眾所周知的。“表達(dá)控制序列”，是指一種DNA序列，如啟動(dòng)子(啟動(dòng)基因)它調(diào)節(jié)致癌基因DNA/致癌基因的轉(zhuǎn)錄。“啟動(dòng)子”是指致癌基因DNA/致癌基因上游的任何區(qū)域，其允許RNA多聚酶的結(jié)合和發(fā)生轉(zhuǎn)錄?！翱刹倏v地連接”的意思是指致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯地連接于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列。脂質(zhì)體的制備和抗體包被的脂質(zhì)體的制備，在技術(shù)上是眾所周知的。
含有正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞和致癌基因DNA/致癌基因的懸浮液在經(jīng)受電穿孔作用之前，最好于約2-4℃保溫5-10分鐘左右。然后，對(duì)懸浮液施以1-10次、最好3-5次的高壓電脈沖借以用致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞。在用401型BTX電動(dòng)細(xì)胞操作儀時(shí)，較為適當(dāng)?shù)碾娒}沖長(zhǎng)度(時(shí)間)為大約50到99微秒左右，尤以99微秒為好。401型BTX電動(dòng)細(xì)胞操作儀的振幅較為適當(dāng)，它能達(dá)到最大振幅。對(duì)釋放到細(xì)胞/DNA懸浮液中之電脈沖的最適電壓、長(zhǎng)度、振幅和脈沖數(shù)，可由本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員使用本發(fā)明的方法，并依據(jù)所用初級(jí)細(xì)胞的性質(zhì)、致癌基因DNA/致癌基因源的性質(zhì)、懸浮液中初級(jí)細(xì)胞的濃度，懸浮液中致癌基因DNA/致癌基因的濃度，所用保護(hù)培養(yǎng)基和所用電穿孔裝置的性能等多種因素加以確定。
在電穿孔作用之后，在加入新的培養(yǎng)基以滋養(yǎng)轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞之前，將懸浮液在大約2～4℃放置5～10分鐘左右。
在電穿孔作用之后，用鑒定永久化細(xì)胞系的常規(guī)技術(shù)由含有已轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞的懸浮液中回收本發(fā)明的永久化了的初級(jí)細(xì)胞系。例如，將細(xì)胞懸浮液分配到96孔培養(yǎng)板，并且每周換一次新鮮培養(yǎng)基或根據(jù)需要更換培養(yǎng)基?？字泻屑?xì)胞的克隆，顯示可連續(xù)增殖(依細(xì)胞克隆數(shù)而定)，例如可增殖至少6周，即含有本發(fā)明的永久化了的初級(jí)細(xì)胞系。
回收之后，可用常規(guī)技術(shù)克隆地?cái)U(kuò)增本發(fā)明之永久化初級(jí)細(xì)胞系，以產(chǎn)生該細(xì)胞系均質(zhì)的細(xì)胞群體，該細(xì)胞系可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(即一種能維持該細(xì)胞系的生存力，并能使其增殖的培養(yǎng)基)中連續(xù)維持。
本發(fā)明也涉及一生產(chǎn)生物制品的方法，該制品的編碼序列是由含在本發(fā)明的永久化細(xì)胞學(xué)內(nèi)的DNA組成的。該方法包括于能夠產(chǎn)生這類生物制品的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞系。如上所述，“編碼序列”包括那些自然地存在于用以制備本發(fā)明的永久化初級(jí)細(xì)胞系的正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞的DNA內(nèi)編碼序列，以及用于本發(fā)明方法中的包含致癌基因DNA/致癌基因的編碼序列。所有正常的初級(jí)細(xì)胞均具有生產(chǎn)生物制品的潛在能力，該制品的編碼序列包括含在上述初級(jí)細(xì)胞中的DNA。激活/刺激此初級(jí)細(xì)胞可使它們能夠產(chǎn)生不同的或另外的生物制品。例如，用某種有用的抗原激活/刺激正常B淋巴細(xì)胞后，這些正常的被激活/刺激的B細(xì)胞便能分化成抗體生成細(xì)胞。產(chǎn)生的抗體將對(duì)激活/刺激抗原的某一決定簇是特異的。用本發(fā)明的方法使這種正常的、經(jīng)激活/刺激的B淋巴細(xì)胞永久化，將產(chǎn)生一種能為單克隆抗體的生產(chǎn)提供連續(xù)來(lái)源的細(xì)胞系，以及包含于該永久化初級(jí)細(xì)胞系內(nèi)的致癌基因DNA/致癌基因密碼序列的表達(dá)產(chǎn)物。同樣，其他正常初級(jí)細(xì)胞的永久化能使它們連續(xù)地生產(chǎn)(a)一種其編碼序列包括有含在初級(jí)細(xì)胞內(nèi)之DNA的生物制品;例如，這樣的編碼序列可編碼淋巴激活素，如白細(xì)胞間素-1(IL-1)，白細(xì)胞間素-2(IL-2)或干擾素;或者某種生長(zhǎng)因子，以及(b)包含于這類永久化初級(jí)細(xì)胞系內(nèi)的致癌基因DNA/致癌基因編碼序列的產(chǎn)物。用以培養(yǎng)能夠生產(chǎn)預(yù)期生物制品的本發(fā)明的之永久化初級(jí)細(xì)胞系的適當(dāng)培養(yǎng)基條件，可由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員按照常規(guī)技術(shù)并依據(jù)所用初級(jí)細(xì)胞的類型及期望產(chǎn)生的生物制品等其它因素來(lái)確定。按照本發(fā)明的方法，由本發(fā)明的初級(jí)細(xì)胞系生產(chǎn)的生物制品可被該細(xì)胞系直接地分泌到培養(yǎng)基中，在此情況下即可從培養(yǎng)基中分離出這種生物制品，如果想要分離，可由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員使用常規(guī)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)來(lái)完成。這種生物制品亦可能不會(huì)分泌出來(lái)，此時(shí)如想要得到這類生物制品，則可應(yīng)用常規(guī)技術(shù)，從此細(xì)胞系的培養(yǎng)物溶解產(chǎn)物中分離之。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)經(jīng)共轉(zhuǎn)染含外源功能性DNA序列之永久化初級(jí)細(xì)胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞;
(b)用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列，通過(guò)電穿孔共轉(zhuǎn)染上述初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞;以及(c)從此共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞中回收含有外源功能性DNA序列的永久化初級(jí)細(xì)胞系。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的方法經(jīng)共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的永久化初級(jí)細(xì)胞系。
“功能性DNA序列”一詞，是指從任何來(lái)源衍生的DNA的任何分離區(qū)，其在本發(fā)明之永久化初級(jí)細(xì)胞系內(nèi)是作為一種基因表達(dá)單位、結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子或一調(diào)節(jié)區(qū)而發(fā)揮功能的?！盎虮磉_(dá)單位”是指一種結(jié)構(gòu)基因和啟動(dòng)子及為其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯所需的調(diào)節(jié)區(qū)?！皢?dòng)子”是指允許RNA多聚酶結(jié)合和發(fā)生轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因上游的任何區(qū)域。“調(diào)節(jié)區(qū)”是指調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。“結(jié)構(gòu)基因”是指用作合成信使RNA之模板的某多肽的編碼序列。
“外源功能性DNA序列”，是指一功能性DNA序列，它并非天然地存在于用于本發(fā)明之方法的正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞DNA中，而且也不是導(dǎo)致按本發(fā)明方法使細(xì)胞永久化的致癌基因DNA/致癌基因的一部分。更優(yōu)選的外源功能性DNA序列包括那些為醫(yī)藥學(xué)上重要的多肽例如(但并不限于)胰島素、生長(zhǎng)激素、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、-1-抗胰蛋白酶、水蛭素、用于生產(chǎn)疫苗的抗原、淋巴激活素、生長(zhǎng)因子、受體等產(chǎn)物編碼的DNA序列，以及為那些能提高本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞增殖能力的產(chǎn)物編碼的DNA序列。
用以生產(chǎn)本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞的通用方法學(xué)，大體上與用以生產(chǎn)本發(fā)明之永久化細(xì)胞系的方法相同，不同的只是其包括了致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列的共轉(zhuǎn)染。這種共轉(zhuǎn)染可同時(shí)或相繼地進(jìn)行?！跋嗬^地”是指可先用本發(fā)明的方法將經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染成永久化的初級(jí)細(xì)胞系，然后再用外源功能性DNA序列經(jīng)電穿孔或任何其他的DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染之。所用外源功能性DNA的量從1微克/毫升左右到100微克/毫升較為合適。所用外源功能性DNA的最適量由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用本發(fā)明的方法，并依據(jù)于所用的外源功能性DNA的性質(zhì)以及上述影響生產(chǎn)本發(fā)明永久化初級(jí)細(xì)胞之方法的其它因素加以確定。這種外源功能性DNA序列可以游離DNA的形式加入到懸浮液內(nèi)，摻入到一適當(dāng)?shù)闹亟MDNA載體中(它也可含有所用的致癌基因DNA/致癌基因)，或者可將其包裹在攜帶對(duì)用于共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞表面抗原決定簇特異之抗體的脂質(zhì)體內(nèi)。用以共轉(zhuǎn)染的電穿孔的優(yōu)選條件，即電脈沖振幅、電壓和長(zhǎng)度(脈沖持續(xù)時(shí)間)，均與上面概述的制備本發(fā)明之永久化初級(jí)細(xì)胞系的條件相同。
電穿孔作用之后，可用下述技術(shù)從懸浮液中回收本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞(a)使用上述的，用于常規(guī)鑒定永久化細(xì)胞系的技術(shù);
(b)使用鑒定包含外源功能性DNA序列之永久化細(xì)胞系的常規(guī)技術(shù)。
回收之后，可用常規(guī)技術(shù)克隆擴(kuò)增本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系，以生產(chǎn)該細(xì)胞系均一群體。該細(xì)胞系可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(即能使該細(xì)胞系保持活存并連續(xù)增殖的培養(yǎng)基)中持續(xù)傳代。這樣的培養(yǎng)基可由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)選定。
本發(fā)明還涉及一生產(chǎn)生物制品的方法，制品的編碼序列包含于含在本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系的DNA內(nèi);此方法包括在能夠生產(chǎn)該生物制品的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞系。如上所述，“編碼序列”包括外源功能性DNA序列的編碼序列以及天然存在于用以制備本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系的正常、經(jīng)激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞的DNA中，還包括用于該細(xì)胞系之制備的致癌基因DNA/致癌基因的編碼序列。
培養(yǎng)本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞以使之能夠產(chǎn)生易于生產(chǎn)的預(yù)期之生物制品的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，可由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)尤其是依據(jù)所包括的初級(jí)細(xì)胞系的類型及所要生產(chǎn)的預(yù)期生物制品等因素而很容易地確定下來(lái)。依照本發(fā)明方法由共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系產(chǎn)生的生物制品，可由這樣的細(xì)胞系直接分泌到培養(yǎng)基中，在這種情況下如需要分離產(chǎn)品時(shí)，即可由本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員使用常規(guī)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)將此類生物制品從培養(yǎng)基中分離出來(lái);在生物制品不能被細(xì)胞系分泌出來(lái)的情況下，如想要從中分離出生物制品，即可應(yīng)用常規(guī)技術(shù)從此細(xì)胞系的培養(yǎng)物溶解產(chǎn)物中得到。
因此，本發(fā)明的共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系提供了下述多肽的持續(xù)來(lái)源(a)由在本發(fā)明中應(yīng)用來(lái)制備初級(jí)細(xì)胞系的、天然存在于本發(fā)明之正常的、經(jīng)激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞內(nèi)的DNA編碼的多肽;
(b)由用于此發(fā)明方法的致癌基因DNA/致癌基因編碼的多肽以及(c)由包含于本發(fā)明之共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系內(nèi)的外源功能性DNA序列編碼的多肽。
現(xiàn)還發(fā)現(xiàn)，主要地由致癌基因組成的DNA能用于使正常的初級(jí)細(xì)胞永久化。因此，本發(fā)明也涉及一種永久化的初級(jí)細(xì)胞系，其條件是這種永久化作用是用主要含致癌基因的DNA轉(zhuǎn)染正常的初級(jí)細(xì)胞的結(jié)果。制備此種永久化的初級(jí)細(xì)胞系的最適宜的方法是依照本發(fā)明的方法，經(jīng)電穿孔作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)染正常的初級(jí)細(xì)胞。
實(shí)施例下述實(shí)施例均更為充分地公開(kāi)了本發(fā)明的特定實(shí)施方案。這些實(shí)施例旨在作為本發(fā)明的例證，而不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明之范圍的限制。
例1
淋巴細(xì)胞的刺激/激活淋巴細(xì)胞的刺激/激活是用常規(guī)的技術(shù)完成的，如應(yīng)用下列的通用方法學(xué)(a)正常人或小鼠淋巴細(xì)胞是經(jīng)用所需的抗原(不同的量)以不同途徑注射到動(dòng)物體內(nèi)而使之在體內(nèi)被激活/刺激的。本發(fā)明的方法中，激活/刺激和轉(zhuǎn)染兩者間的時(shí)間間隔，以及注射的次數(shù)可能是不同的。從小鼠脾臟中分離得來(lái)正常的、經(jīng)刺激/激活的淋巴細(xì)胞，并按〔Kennett等，Current Topics in Microbiol.and Immunol.，81，77-94(1978)〕處理。
(b)正常人或小鼠淋巴細(xì)胞用抗原或分裂素作為刺激/激活劑，于體外被刺激的/激活。用特異抗原在體外刺激/激活是參照J(rèn)onak等〔Hybridoma，3，107-118(1984)〕所敘述的改進(jìn)方法。
(c)在體內(nèi)已接觸抗原的正常的人或小鼠淋巴細(xì)胞，再在體外的用預(yù)期的抗原/分裂素重復(fù)刺激。
例2人淋巴細(xì)胞的永久化作為依本發(fā)明的方法用致癌基因DNA/致癌基因生產(chǎn)永久化初級(jí)細(xì)胞的一個(gè)普通例證，將正常人淋巴細(xì)胞懸浮液和致癌基因DNA混合，并暴露于高壓電脈沖。具體方法如下正常的人淋巴細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞)用淋巴細(xì)胞分離劑(Iymphoprep)經(jīng)離心純化。按實(shí)施例1中所述的方法激活/刺激細(xì)胞。將這種正常的經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞懸浮于冰冷的磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS，未加MgCl2或CaCl2)中再次離心(200×克/10分鐘)。將所得片狀沉淀物再懸浮于PBS緩沖液中，濃度為1-5×107個(gè)細(xì)胞/毫升。將從人腫瘤細(xì)胞系(Burkitt′s淋巴瘤，BJAB)純化的、其起源與B-淋巴細(xì)胞細(xì)胞型相一致的基因組DNA(40-50微克/毫升)或含有功能性致癌基因的質(zhì)粒DNA(P53-H7)(1～20微克/毫升)加入細(xì)胞懸浮液內(nèi)，并在401型BTX電細(xì)胞操作儀的電穿孔室中于0℃保溫10分鐘。之后給予3-5次電脈沖(1000伏/厘米到5，500伏/厘米)(最大振幅)(寬度在99微秒內(nèi))。
電脈沖作用后將細(xì)胞和DNA在0℃放置10分鐘，再加入5毫升經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的TY培養(yǎng)基(Jonak等，“Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines”Plerum Press，418-422，1984)并分到96孔的培養(yǎng)板中，供以新鮮培養(yǎng)基，每月一次或根據(jù)需要更換新鮮培養(yǎng)基。
在用致癌基因(插入表達(dá)載體的功能性致癌基因)P53或得自BJAB人Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞系的致癌基因DNA經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染人淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，已成功地取得了高效永久化。此成功已清楚地為業(yè)經(jīng)得到的高效的連續(xù)增殖細(xì)胞數(shù)所證明。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，同樣方法處理淋巴細(xì)胞，不同的是以正常DNA代替致癌基因DNA/致癌基因，或被省略之。將用致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物與對(duì)照組比較，表明用致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中呈現(xiàn)增殖的細(xì)胞數(shù)(以克隆數(shù)表示)高了許多。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞于三周內(nèi)死亡。致癌基因DNA/致癌基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則可持續(xù)增殖6周到幾個(gè)月以上，從而證實(shí)它們的永久化。
例3小鼠淋巴細(xì)胞的永久化用全脾臟灌注法制備Balb/c小鼠的脾細(xì)胞(雌性，得自Charles River實(shí)驗(yàn)室)并用0.83%的NH4Cl在4℃處理5分鐘以溶解紅細(xì)胞。然后離心分離淋巴細(xì)胞，將片狀沉淀物再懸浮于5毫升Dulbecco′s改進(jìn)的含高葡萄糖的EAGLE′S培養(yǎng)基(DMEM)(見(jiàn)Cerottini等J.Exp.Med.，140.，703-717，1974)內(nèi)，并加至一尼龍棉柱上(柱內(nèi)裝尼龍棉10毫升)。將此柱子在37℃保存45分鐘，加入20毫升添加了5%胎牛血清(FCS)并加溫到37℃的DMEM培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)濾而除去T細(xì)胞，(Julius等.，Eur.J.Immunol.，3∶645，1973)。用20毫升相同的培養(yǎng)基與尼龍棉混合，從柱子上回收b淋巴細(xì)胞。離心出此細(xì)胞，將片狀沉淀(一個(gè)脾約有4×107B細(xì)胞)再懸浮于添加了5%FCS的DMEM的Iscove氏改進(jìn)培養(yǎng)基(RPMI1640)(見(jiàn)Moore等，GAMA，199，519-524，1967)內(nèi)。此細(xì)胞(3×107)裝在有20毫升添加了5%熱滅活之胎牛血清(FCS)，2mM(毫克分子)谷氨酸胺，5×10-5摩爾2-巰基乙醇和慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中，于37℃并充以7%CO2的條件下保溫。
為完成分裂素-誘發(fā)的刺激，將純化的B淋巴細(xì)胞加20微克/毫升(20微克/毫升)的脂多糖(LPS)保溫。細(xì)胞在用LPS(3(H)-胸腺嘧啶參入到DNA中以指示刺激的程度)經(jīng)刺激24-48小時(shí)之后，達(dá)到了最大刺激。培養(yǎng)24-48小時(shí)后，用PBS緩沖液(無(wú)CaCl2或MgCl2)將淋巴細(xì)胞洗滌2次，以2×106～2×107細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度再懸浮并于0℃保存。致癌基因DNA的來(lái)源是由EL4小鼠胸腺瘤細(xì)胞系(ATCC.TIB39)純化的基因組DNA或是插入到合適表達(dá)載體內(nèi)的致癌基因Ha-ras〔從T24(ATCC HTB4)分離的〕。電穿孔是經(jīng)下列步驟達(dá)到的(a)將106-107細(xì)胞/0.5毫升PBS和40微克基因組DNA或10-100毫微克致癌基因懸浮在401型BTX電動(dòng)細(xì)胞操作儀的電穿孔室中，(b)給予3-5次電脈沖(最大時(shí)間長(zhǎng)度和振幅)。電穿孔后，將細(xì)胞于0℃放置10分鐘，然后用TY培養(yǎng)基〔見(jiàn)Jonak等，“Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines(Progress and Application)，”Plenum Press，418-422(1984)〕。稀釋到濃度為106細(xì)胞/毫升，將細(xì)胞以每孔2×105細(xì)胞的濃度加入96孔培養(yǎng)板中于37℃培養(yǎng)。將細(xì)胞每周換一次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)3-4周后，培養(yǎng)板各孔顯現(xiàn)擴(kuò)增了生長(zhǎng)的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞具有未成熟細(xì)胞的形態(tài)，并在培養(yǎng)中生長(zhǎng)了幾個(gè)月。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種刺激在永久化中起到一個(gè)重要的作用，因?yàn)槲创碳さ牧馨图?xì)胞在用致癌基因DNA/致癌基因經(jīng)電穿孔作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后并沒(méi)有生長(zhǎng)。
例4電穿孔/DNA-脂質(zhì)體釋放本發(fā)明的電穿孔技術(shù)，能將攜帶含有致癌基因/致癌基因DNA的脂質(zhì)體的抗體/蛋白A的應(yīng)用與電穿孔作用聯(lián)合起來(lái)。
由54摩爾%的二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(Avanti極性脂質(zhì))、10摩爾%的二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸(Avanti)、35摩爾%膽固醇(Sigma)和用n-羥基琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫丙酸)(SPDP)(Pharmacia)改性的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(Sigma)組成的大單層脂質(zhì)體囊泡是按照改進(jìn)的反相蒸發(fā)技術(shù)的方法(Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75∶4194-4198，1978)制成的。將脂質(zhì)溶于1毫升氯仿2毫升二異丙醚(Merck)中。按已述方法將水溶液(1毫升在緩沖鹽水中含有1～2毫克業(yè)經(jīng)放射標(biāo)記的質(zhì)粒DNA的等分式樣)和有機(jī)相分開(kāi)放入配有Luer栓的氣封玻璃注射器中〔Machy and Leserman，Biophy.Biochem.Acta，730∶313-320，(1983)，Machy and Leserman，“Liposome Technology”(Gregoriadis，ed.)CRC Press，Cleveland Vol.I∶221-234，(1984)〕。注射器均連接一金屬三通閥。將水相注射到有機(jī)相中，然后使混合液能迅速地從一注射器轉(zhuǎn)到另一注射器內(nèi)，反復(fù)通過(guò)10～20次。將此脂質(zhì)-水乳化液轉(zhuǎn)移到14毫升旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)管內(nèi)，加熱到45℃，使有機(jī)相在350-400毫米汞柱壓力時(shí)除去。然后通過(guò)0.4微毫米(um)單孔聚碳酸酯過(guò)濾器(Bio-Red)過(guò)濾，根據(jù)大小而選擇出逆相蒸發(fā)囊泡(REV)。(Olson等，Biochem.Biophys.Acta，557∶9-23(1979)〕。
將脂質(zhì)體與蛋白A(Pharmacia)及經(jīng)10摩爾SPDP/摩爾蛋白A改性的碘化蛋白A(NEN)之等分試樣保溫(終濃度為200微克/毫升)〔Leserman等，Nature，288∶602-604，(1980);Machy等，J.Immunol.，129∶2098-2102，(1982)〕。脂質(zhì)體的終濃度約為20毫摩爾。偶聯(lián)反應(yīng)是于室溫下，在L-緩沖液(145毫升NaCl，10毫摩爾Hepes，pH8)中反應(yīng)20小時(shí)完成的。在結(jié)合含DNA蛋白A包被的脂質(zhì)體以前，依下述方法純化之將脂質(zhì)體與在添加了10毫升MgCl2的L-緩沖液中的5微克/毫升的DNase I(Sigma)于25℃保溫30分鐘。然后使含有DNA的蛋白A包被的脂質(zhì)體通過(guò)用L-緩沖液(pH7.45)平衡過(guò)的瓊脂糖4B-CL柱。從而使未偶聯(lián)的蛋白A和降解了的未被包裹的DNA從脂質(zhì)體制劑中除去。通常約有5%的DNA被包裹并有5-10%的蛋白A偶合到脂質(zhì)體的表面上。
這些更適用的脂質(zhì)體與淋巴樣細(xì)胞按下述方法一起保溫人B-細(xì)胞(107)同40微克/毫升單克隆抗體于4℃保溫1小時(shí)。然后洗去未結(jié)合的抗體并同3微克含有DNA的蛋白A包被的脂質(zhì)體于4℃保溫2小時(shí)。脂質(zhì)與抗體預(yù)處理的細(xì)胞結(jié)合。然后，用上述方法使細(xì)胞被電穿孔。例如，當(dāng)這些細(xì)胞在加脂質(zhì)體之前同抗-HCA抗體保溫時(shí)，至少有35%的培養(yǎng)孔顯示有轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞。若用不相干的抗體或不加抗體，則只有8-10%的培養(yǎng)孔顯示有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞同抗-HCA抗體和脂質(zhì)體保溫但未電穿孔時(shí)，則沒(méi)有細(xì)胞受到轉(zhuǎn)染。此實(shí)施例的結(jié)論是，只有中靶的脂質(zhì)體才能用電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
這種研究方法的優(yōu)點(diǎn)是，DNA(包裹到脂質(zhì)體中)會(huì)特異地釋放到混合細(xì)胞群體中預(yù)期類型的細(xì)胞內(nèi)(即成熟B-細(xì)胞、單核細(xì)胞)。脂質(zhì)體的內(nèi)含物(致癌基因DNA/致癌基因)將會(huì)通過(guò)施以電脈沖被引入細(xì)胞內(nèi)。必需指出的是，并不期望或需要脂質(zhì)體同靶細(xì)胞融合，但希望經(jīng)施以電脈沖，使DNA通過(guò)靶細(xì)胞和脂質(zhì)體間形成微孔(該微孔是電脈沖的結(jié)果)插入到細(xì)胞中。此改進(jìn)方法的優(yōu)點(diǎn)是，可使DNA特異地釋放到淋巴細(xì)胞混合群體內(nèi)的預(yù)期之細(xì)胞類型中。
雖然以上描述和實(shí)施例充分地說(shuō)明本發(fā)明及其優(yōu)選的實(shí)施方案，但不言自明的是，本發(fā)明并不限于這些特別公開(kāi)的實(shí)施方案。因此，本發(fā)明包括以下權(quán)利要求
范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)永久化初級(jí)細(xì)胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞；(b)經(jīng)電穿孔作用用致癌基因DNA/致癌基因(包含或不包含于脂質(zhì)體中)轉(zhuǎn)染上述初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染了的初級(jí)細(xì)胞；以及(c)自上述轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞中回收永久化的初級(jí)細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中致癌基因DNA是從初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫癌初級(jí)細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中致癌基因是從一初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤的初級(jí)細(xì)胞系得來(lái)的，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中初級(jí)細(xì)胞是造血細(xì)胞源。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中初級(jí)細(xì)胞是多潛能干細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、B-系細(xì)胞前體、T-淋巴細(xì)胞。T-系細(xì)胞前體、髓樣干細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中初級(jí)細(xì)胞都是B-淋巴細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中B一淋巴細(xì)胞是已用抗原激活/刺激過(guò)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中致癌基因DNA是從BJAB得來(lái)的基因組DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中致癌基因DNA是從REH細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中致癌基因DNA是從EL4細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法產(chǎn)生的永久化的初級(jí)細(xì)胞系。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是從初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤初級(jí)細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞系類型相一致的起源。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12的細(xì)胞系，其中致癌基因是從初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤初級(jí)細(xì)胞系得來(lái)的，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
15.根據(jù)權(quán)利要求
12的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞是造血細(xì)胞源。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15的細(xì)胞系，其中的初級(jí)細(xì)胞是多潛能干細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、B-系細(xì)胞前體、T-淋巴細(xì)胞、T-系細(xì)胞前體、髓樣干細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求
16的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞是B-淋巴細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17的細(xì)胞系，其中B一淋巴細(xì)胞是已用抗原激活/刺激過(guò)的。
19.根據(jù)權(quán)利要求
16的細(xì)胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求
16的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是來(lái)自BJAB基因組DNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求
16的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是從REH細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA。
22.根據(jù)權(quán)利要求
16的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是從EL4細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA。
23.一種生產(chǎn)生物制品的方法，其中生物制品的編碼序列包含在含于永久化的初級(jí)細(xì)胞系中的DNA內(nèi)，此方法包括(a)提供正常的、經(jīng)激活/刺激的初級(jí)細(xì)胞;(b)經(jīng)電穿孔作用用致癌基因的DNA/致癌基因(可任意選擇地包含于脂質(zhì)體中)轉(zhuǎn)染上述初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞;(c)自這種轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞回收永久化的初級(jí)細(xì)胞系;并且(d)在能夠生產(chǎn)此生物制品的條件下培養(yǎng)此種永久化的細(xì)胞系。
24.一種生產(chǎn)含有外源功能性DNA序列的共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系的方法，該方法包括(a)提供正常的、經(jīng)激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞;(b)用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能能性DNA序列(可任意選擇地包含于脂質(zhì)體中)經(jīng)電穿孔共轉(zhuǎn)染這種初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞;(c)從這種共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞回收含有外源功能性DNA序列的永久化的初級(jí)細(xì)胞系。
25.根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中致癌基因DNA是來(lái)自初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤初級(jí)細(xì)胞系的基因組DNA，其中此腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有和將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
26.根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中致癌基因是來(lái)自初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤初級(jí)細(xì)胞系，其中此腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
27.根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中初級(jí)細(xì)胞均為造血細(xì)胞源。
28.根據(jù)權(quán)利要求
27的方法，其中初級(jí)細(xì)胞是多潛能干細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、B-系細(xì)胞前體、T-淋巴細(xì)胞、T-系細(xì)胞前體、髓樣干細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求
28的方法，其中的初級(jí)細(xì)胞是B-淋巴細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求
29的方法，其中的B一淋巴細(xì)胞是已用抗原激活/刺激過(guò)的。
31.根據(jù)權(quán)利要求
29的方法，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
32.根據(jù)權(quán)利要求
29的方法，其中致癌基因DNA是從BJAB得來(lái)的基因組DNA。
33.根據(jù)權(quán)利要求
29的方法，其中致癌基因DNA是從REH細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA。
34.根據(jù)權(quán)利要求
29的方法，其中致癌基因DNA是從EL4細(xì)胞系得來(lái)的基因組DNA。
35.用權(quán)利要求
24的方法生產(chǎn)的共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系。
36.根據(jù)權(quán)利要求
35的細(xì)胞系，其中致癌基因的DNA是來(lái)自初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤初級(jí)細(xì)胞系的基因組DNA，其中此腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
37.根據(jù)權(quán)利要求
35的細(xì)胞系，其中致癌基因是來(lái)自初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤的初級(jí)細(xì)胞系，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
38.根據(jù)權(quán)利要求
35的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞是造血細(xì)胞源。
39.根據(jù)權(quán)利要求
38的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞為多潛能干細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、B-系細(xì)胞前體、T-淋巴細(xì)胞、T-系細(xì)胞前體、髓樣干細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求
39的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞為B-淋巴細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求
40的細(xì)胞系，其中B-淋巴細(xì)胞是已用抗原激活/刺激過(guò)的。
42.根據(jù)權(quán)利要求
40的細(xì)胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因。
43.根據(jù)權(quán)利要求
40的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是來(lái)自BJAB的基因組DNA。
44.根據(jù)權(quán)利要求
40的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是來(lái)自REH細(xì)胞系的基因組DNA。
45.根據(jù)權(quán)利要求
40的細(xì)胞系，其中致癌基因DNA是來(lái)自EL4細(xì)胞系的基因組DNA。
46.一種生產(chǎn)生物制品的方法，該生物制品的編碼序列包括含于含有外有源功能性DNA序列的經(jīng)轉(zhuǎn)染的永久化細(xì)胞系中的DNA內(nèi)，該方法包括(a)提供正常的、經(jīng)激活/刺激過(guò)的初級(jí)細(xì)胞;(b)用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列(該序列可任選地包裹于脂質(zhì)體中)經(jīng)電穿孔以共轉(zhuǎn)染此初級(jí)細(xì)胞，從而產(chǎn)生共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞;(c)自此共轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞回收含有外源功能性DNA序列的共轉(zhuǎn)染的永久化初級(jí)細(xì)胞系;以及(d)在能生產(chǎn)所需生物制品的條件下培養(yǎng)這一共轉(zhuǎn)染的永久化的細(xì)胞系。
47.一種永久化的初級(jí)細(xì)胞系，其條件是這種永久化作用是用主要含致癌基因的DNA轉(zhuǎn)染正常初級(jí)細(xì)胞的結(jié)果。
48.根據(jù)權(quán)利要求
47的細(xì)胞系，其中致癌基因是來(lái)自初級(jí)細(xì)胞腫瘤或腫瘤的初級(jí)細(xì)胞，其中這樣的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系具有與將被永久化的初級(jí)細(xì)胞類型相一致的起源。
49.根據(jù)權(quán)利要求
47的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞是造血細(xì)胞源。
50.根據(jù)權(quán)利要求
49的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞是多潛能干細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、B-系細(xì)胞前體、T-淋巴細(xì)胞、T-系細(xì)胞前體、髓樣干細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求
50的細(xì)胞系，其中初級(jí)細(xì)胞是B-淋巴細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求
51的細(xì)胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
專利摘要
應(yīng)用電穿孔作為一種轉(zhuǎn)染方法，用致癌基因DNA/致癌基因使初級(jí)細(xì)胞永久化。
文檔編號(hào)C07K14/47GK87102457SQ87102457
公開(kāi)日1988年1月13日 申請(qǐng)日期1987年2月28日
發(fā)明者愛(ài)德華·馬克·亨利, 茲登卡·勒德米拉·喬納克, 帕特里克·西蒙·雅克·馬希 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩貝克曼公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan