專利名稱:用于生產(chǎn) l-鳥氨酸或l-精氨酸的突變株以及用于生產(chǎn)其的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的棒狀桿菌(Corynebacterium)變異體以及用于生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及編碼參與鳥氨酸或精氨酸生物合成的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶兩者的谷氨酸棒桿菌來源的多核苷酸、由該多核苷酸編碼的多肽、攜帶該多核苷酸的重組載體、通過將該重組載體引入到生產(chǎn)L-精氨酸的宿主生物中而制備的轉化體，以及通過培養(yǎng)該轉化體來生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的方法。
背景技術：
L-氨基酸被用作用于人的藥物中的成分并且特別地應用于制藥工業(yè)和食品工業(yè)并且也被用作用于動物的營養(yǎng)物。在L-氨基酸中，L-鳥氨酸，在精氨酸循環(huán)上的產(chǎn)物之一，已知是增強肝功能的藥物組分(Salvatore等人，1964)。L-精氨酸以游離形式大量地存在于植物種子和大蒜中并且在藥物或食品產(chǎn)品中用作營養(yǎng)增補劑。L-精氨酸的藥物應用的實例包括抗-肝毒物質、腦代謝增強劑、用于雄性不育的治療劑、以及一般性氨基酸劑型(配方)。應用了 L-精氨酸的食物中的代表是魚糊添加劑、健康飲料添加劑以及用于患有高血壓的患者的鹽替代物。
當棒狀桿菌(尤其是谷氨酸棒狀桿菌)用于大量生產(chǎn)氨基酸時，發(fā)酵得以應用。由于在工業(yè)方面其高顯著性，氨基酸的細菌生產(chǎn)方法連續(xù)地改善。就例如在發(fā)酵過程中攪拌、氧氣引入、以及糖濃度的維持而言，已經(jīng)實現(xiàn)了方法上的改進。
為了增加氨基酸的微生物生產(chǎn)率，選擇適當?shù)奈⑸锸欠浅Ｖ匾??？梢赃x擇產(chǎn)生L-氨基酸的菌株，這些菌株對于抗代謝物質具有耐受性或對于負責氨基酸調節(jié)的代謝 產(chǎn)物是營養(yǎng)缺陷的。例如，使用生產(chǎn)谷氨酸的短桿菌或棒狀桿菌的變異體來生產(chǎn)鳥氨酸(EP0393708A3)。而且，使用生產(chǎn)谷氨酸的短桿菌或棒狀桿菌的變異體來從碳和氮源直接生產(chǎn)L-精氨酸(日本專利公開號Sho. 57-163487,60-83593以及62-265988)。
重組DNA技術也是一種有用的工具，可以通過它來基因上改變生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀桿菌株從而增強與生產(chǎn)L-氨基酸相關的功能。例如，可以將argCJBD (—種鳥氨酸生物合成基因)引入到并且過表達在不能合成精氨酸和脯氨酸的菌株中(Hwang等人，2008)。而且，可以對菌株進行基因重組用于使argR (—種抑制精氨酸生物合成操縱子的表達的基因)失活(美國專利申請公開號2002/0045223A1)。
通過加強感興趣基因的生物合成可以實現(xiàn)氨基酸生產(chǎn)率的增加。存在這樣的報告，即可以通過增加生物合成基因的表達來提高氨基酸生產(chǎn)的產(chǎn)率。例如，精氨酸生物合成基因argF的過表達導致精氨酸的生產(chǎn)增加(韓國專利申請?zhí)?0-2004-107215)。
此外，披露了一種用于生產(chǎn)L-精氨酸的方法，其中argD2基因(Ncgl2355)或(Ncgl0990)，一種涉及谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸生物合成的乙酰鳥氨酸氨基轉移酶的推定基因，被過表達用于以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-精氨酸(韓國專利號0830289和0830290)。[0008]與此類似，能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)鳥氨酸或精氨酸的微生物菌株可能是由于生物合成基因的增強，尤其是生物合成酶乙酰谷氨酸合酶以及乙酰鳥氨酸酶的基因導致的。
然而，在迄今已知的棒狀桿菌中尚未發(fā)現(xiàn)乙酰谷氨酸合酶。在本發(fā)明中，本發(fā)明檢查了對負責乙酰谷氨酸合酶功能的酶進行編碼的基因。已經(jīng)報道了該基因的多肽具有類似于由argj編碼的乙酰鳥氨酸酶的活性。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因活性的增強增加了鳥氨酸或精氨酸的濃度?；谶@些研究結果，完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
技術問題
因此本發(fā)明的一個目的是提供一種對具有乙酰谷氨酸合酶或乙酰鳥氨酸酶活性的多肽進行編碼的新型棒狀桿菌來源的多核苷酸，或由此編碼的多肽。
本發(fā)明的另一個目的是提供其中該基因被過表達并且對于鳥氨酸或精氨酸具有改善的生產(chǎn)率的菌株。
本發(fā)明的另一個目的是提供使用該菌株以高濃度來生產(chǎn)鳥氨酸或精氨酸的方法。
技術方案
根據(jù)其一個方面，本發(fā)明提供了一種顯示乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶活性的谷氨酸棒狀桿菌來源的多肽。
在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)基因Ncgll469 (其序列可通過國立衛(wèi)生研究院(NationalInsititute of Health)的數(shù)據(jù)庫公開地得到)編碼乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶兩者。在棒狀桿菌中，對乙酰谷氨酸進行編碼的基因尚未被確定，然而報道了通過argj來編碼乙酰鳥氨酸酶(Sakayan等人，1996)。在本發(fā)明之前的文件均沒有披露基因Ncgll469編碼這兩種酶。它的氨基酸和核苷酸序列分別給出為SEQ ID N0S. I和2。根據(jù)其另一個方面，本發(fā)明提供了攜帶對乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶兩者進行編碼的基因的載體。該載體包含乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶基因?？捎米鞅景l(fā)明載體的質粒的實例包括pZl (menkel等人)、pEkExl (Eikmarms等人)、pHS2_l (Sonnen等人)、pCG4 (美國專利號 4, 489, 190)、pNG2 (Serwold-Davis 等人)以及 pEKO (Eikmanns 等人)，其中優(yōu)選pEKO。更優(yōu)選地，該載體包含SEQ ID NO. I的氨基酸序列或SEQ ID NO. 2的核苷酸序列并且示于圖I中。
根據(jù)其另外的方面，本發(fā)明提供了富含乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶的微生物、或轉化體或重組細胞。在該上下文中，該菌株可以是在增強乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶之前已經(jīng)能夠生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的菌株。本領域技術人員根據(jù)任何已知的轉化方法可以容易地制備該轉化體。如本文中使用的，術語“轉化”用于指由于外源性DNA的攝取、結合、復制和表達引起的細胞的基因改變。
典型的典型轉化方法是CaCl2沉淀、基于CaCl2沉淀使用DMSO (二甲亞砜)作為還原劑的Hanahan法、電穿孔、磷酸鈣沉淀、原生質融合(血漿融合)、碳化硅纖維介導的轉化、農桿菌介導的轉化、PEG-介導的轉化、硫酸葡聚糖法、陽離子脂質體法(Lipofectaminemethod)、以及干燥/抑制介導的轉化。
例如，在本發(fā)明中，通過電穿孔將重組載體pEK-Ptrc: :1469引入到宿主微生物中以產(chǎn)生轉化體，然后利用抗菌素耐受性來分離該轉化體。[0021]表達“相對于內在活性增強”用于指與內在活性相比引入的酶乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶的細胞內活性的優(yōu)越性。通過增加感興趣基因的拷貝可以實現(xiàn)酶活性的增強?？梢酝ㄟ^使用載體(例如質粒)，或通過將另外的基因整合到染色體中來增加基因拷貝的數(shù)量。調節(jié)元件(該元件對基因表達具有正面影響)的增強可以是用于增加基因拷貝數(shù)的一種途徑。該調節(jié)元件可以在轉錄水平上增強基因活性，并且特別地可以用于增強轉錄信號?？商鎿Q地，例如可以通過增加mRNA的穩(wěn)定性在翻譯水平上實現(xiàn)該增強?？梢允褂镁哂懈呋钚缘母信d趣的基因。感興趣基因的過表達可能是由培養(yǎng)基構成的改變引起的。可以通過增強其啟動子或使用更強的啟動子來增加基因的活性。可用于本發(fā)明的強啟動子的一個實例是Tac-啟動子(Amann等人)。通過突變可以增強基因的內在活性?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法使用UV光或誘變化學劑或通過基于核苷酸殘基的缺失、插入和/或取代的基因操作方法來引入突變?？梢詫⑸鲜龃胧┙Y合以增強酶的活性。
可以將棒形菌、棒狀桿菌或短桿菌用于本發(fā)明中。適合于制備轉化的谷氨酸棒狀桿菌變異體的起始菌株的實例包括下面的野生型菌株谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032、醋谷氨酸棒狀桿菌ATCC15806、嗜醋酸棒狀桿菌ATCC13870、嗜熱棒狀桿菌FERM BP-1539、黃色短桿菌ATCC14067、乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869、分支短桿菌ATCC14020、以及它們的過表達L-鳥氨酸的變異體(這些變異體缺少涉及鳥氨酸生物合成途徑的酶類，例如鳥氨酸氨甲酰轉移酶、精氨酸抑制劑、和/或谷氨酸激酶)、以及它們的過表達L-精氨酸酶的變異體(這些變異體缺少涉及精氨酸生物合成的精氨酸抑制劑)。
根據(jù)其另外的方面，本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)本發(fā)明的轉染微生物來生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的方法。為了培養(yǎng)該微生物，可以使用本領域熟知的適當?shù)呐囵B(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件。本領域技術人員可以根據(jù)這些微生物容易地選擇或改變適當?shù)呐囵B(yǎng)條件。它們可以例如以適當?shù)姆绞絹砼囵B(yǎng)，其實例包括但不限于批量培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)以及進料分配培養(yǎng)?？梢岳缭凇癇iochemical Engineering，，(James M. Lee, Prentice-Hall InternationalEditions, ppl38-176, 1991)中找到這些不同的培養(yǎng)方法?？梢酝ㄟ^添加pH調節(jié)劑(例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸以及硫酸)對培養(yǎng)物的PH進行調節(jié)。在微生物生長期間，可以使用消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯來防止泡沫的形成。為了在需氧條件下保持培養(yǎng)物，可以通過引入氧氣或含氧氣體(例如空氣)對培養(yǎng)基充氣?？梢詫⑴囵B(yǎng)基保持在從20° C至45° C的溫度下，并且優(yōu)選在從25° C至40° C的溫度下。對于培養(yǎng)期而言，可以將它延長到這種程度，即獲得了期望水平的L-精氨酸甲硫氨酸并且可以在10至160小時的數(shù)量級上。只要它是本領域已知的，可以使用任何典型的方法以從該培養(yǎng)物中分離L-鳥氨酸或L-精氨酸。分離方法的實例包括離心、過濾、離子交換層析以及結晶。例如，在以低速離心以去除生物質之后，使得到的上清液經(jīng)受離子交換層析從而純化感興趣的氨基酸。
有益效果
如上所述，本發(fā)明提供了編碼涉及鳥氨酸或精氨酸生物合成的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶兩者的谷氨酸棒桿菌來源的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，攜帶該多 核苷酸的重組載體，通過將該重組載體引入到生產(chǎn)L-精氨酸的宿主微生物中而制備的轉化體，以及通過培養(yǎng)該轉化體來生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的方法。顯示了比內在活性更高的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶活性，該轉化體能夠生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸并且因此在生物醫(yī)藥工業(yè)中找到有用的應用。


圖I是一個基因圖，其示出了根據(jù)本發(fā)明的載體pEK-Ptrc: :Ncgl 1469的結構。
具體實施方式
可以通過下面實施例獲得對本發(fā)明更好的理解，列出這些實施例是用于說明而不應理解為限制本發(fā)明。
實施例
實施例I :Ncgll469 克隆
使用SEQ ID N0S. 3和4的寡核苷酸作為引物，將pTrc99A(Amann等人1988)用作模板，進行PCR，從而擴增用于制備過表達載體的trc啟動子。分別地，使用SEQ ID N0S. 5和6的寡核苷酸，將pTrc99A用作模板，通過PCR來擴增rrnB終止子。在PfuUltra 高保真DNA聚合酶(stratagene)存在下進行PCR，其中在95。C下變性30秒、在55。C下退火 30秒，并且在68° C下延伸I分鐘，25個循環(huán)。從NIH GenBank的數(shù)據(jù)庫中獲得NCgl 1469的核苷酸序列?；谠撔蛄?，設計了一對引物(SEQID N0S. 7和8)。使用合成的引物，在谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組DNA上進行PCR，其中在95° C下變性30秒，在55° C下退火30秒，并且在68° C下延伸I. 5分鐘，25個循環(huán)。
用XbaI對pEKO載體(大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體,Eikmanns等人1991)進行處理。分別地，分別用XbaI、NdeI/NedI、Xbal消化ptrc啟動子和14690RF (兩者都是上面擴增的)，并且然后連接到消化的載體上用來產(chǎn)生重組載體。用HincII和EcoRI對此進行雙重消化同時用Smal/EcoRI對擴增的rrnB終止子部分進行處理，緊接著進行連接從而提供其中插入了啟動子-14690RF-終止子部分的重組載體。
實施例2 Ncgll469過表達
為了檢查實施例I中克隆的基因Ncgll469的活性，首先，對于其中argj斷裂(中斷，disrupt)的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的突變體存在需要。在本發(fā)明上下文中，使用pK18mobsacB整合載體(Schafer等人1994)來產(chǎn)生argj-斷裂菌株。使用兩對引物(SEQID N0S. 7和8 ;9和10)，在ATCC13032的基因組DNA上進行PCR，其中在95。C下變性30秒，在55° C下退火30秒，并且在68° C下延伸I. 5分鐘，25個循環(huán)。分別用Xbal/Apal和Apal/Xbal處理由此獲得的兩個PCR產(chǎn)物，同時用XbaI消化pK18mobsacB載體。使這些得到的三種消化物彼此連接從而產(chǎn)生重組載體。
通過電穿孔，將重組載體轉化到ATCC13032菌株中，然后使該菌株生長在包含25mg/L濃度卡那霉素的瓊脂上從而區(qū)別其中該基因通過同源重組插入到染色體中的菌株。在攪拌下在營養(yǎng)培養(yǎng)基中(30° C，4小時)培養(yǎng)插入初級染色體的菌株，緊接著將該菌株涂布在包含從10_4至10,的10倍稀釋濃度的蔗糖的瓊脂板上。大多數(shù)細菌死亡同時僅小部分顯示為菌落。選擇形成菌落的菌株作為需要的菌株，其中通過二次交換來除去插入到染色體中的載體序列。最后在針對卡那霉素敏感性對該菌株進行檢查之后對該菌株進行選擇并且使用SEQ ID N0S. 7和8的引物通過PCR鑒別其基因結構。
實施例3 :針對乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶活性測量Ncgl 1469
在肉湯中培養(yǎng)在實施例2中最終選擇的菌株。在通過離心進行收獲之后,用IOOmMTris/Hcl緩沖液(pH 7. 5)將細胞物質洗滌兩次并且用玻璃珠粒進行溶解用于去除膜。
根據(jù)已知的方法(Errey和Blanchard, 2005),通過測量421nm處5_硫代-2-硝基苯甲酸鹽的吸光度水平來確定乙酰谷氨酸的活性。還根據(jù)一種已知方法(Vogel和Mcleelan, 1970)來確定乙酰鳥氨酸酶的活性。
通過將pEKO載體和pEK-Ptrc::1469載體引入到菌株ATCC13032中獲得這些菌株，對argJA進行誘導以過表達感興趣的基因，并且將這些結果總結在下面的表I中。
表I
當對該菌株進行誘導(該菌株被構建成缺少argj，一種已知編碼乙酰鳥氨酸酶的基因)從而過表達Ncgll469時，乙酰谷氨酸和乙酰鳥氨酸酶兩者的活性都增加，這導致了這種結論，即Ncgl 1469編碼這兩種酶。
實施例4 SJ8073-pEK-Ptrc: : 1469菌株的鳥氨酸生產(chǎn)
為了檢查該菌株的鳥氨酸生產(chǎn)率(其中基因Ncgll469被過表達)，使用生產(chǎn)鳥氨酸的菌株 SJ8074 (argF-argR-proB Δ , Hwang 等人 2008)作為母菌株。
在攪拌下將這些菌株培養(yǎng)在250mL擋板燒瓶中包含O. 8g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4Ug/L MgSO4 · 7Η20、1· 2g/L Na2HPO4、2mg/LMnS04 · H20、10mg/L ZnSO4 · 7H20、10g 酵母提取物、20g/L CaC03、60g/L葡萄糖以及IOmM IPTG的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中鳥氨酸的水平總結在下面的表2中。
表2
當在生產(chǎn)鳥氨酸的菌株SJ8074中將Ncgl 1469過表達時，鳥氨酸的生產(chǎn)水平增加了約20%或更多。
通過將重組載體pEK-Ptrc: :Ncgl 1469引入到谷氨酸棒狀桿菌SJ8074中而制備的轉化體命名為谷氨酸棒狀桿菌CA06-0020并且于2009年12月23日保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(Korean Culture center of Microorganisms)(下文稱為“KCCM”)，登錄號為 KCCM11057P。
實施例5 :ATCC21831、argRA-pEK-Ptrc: :1469 菌株的精氨酸生產(chǎn)
為了檢查TL2過表達菌株的鳥氨酸生產(chǎn)率，將生產(chǎn)精氨酸的菌株ATCC21831修飾成缺少精氨酸抑制物argR，并且將修飾的菌株用作母菌株。
在攪拌下將這些菌株培養(yǎng)在250mL擋板燒瓶中包含0. 8g/L KH2PO4, IOg/L (NH4)2SO4Ug/L MgSO4 · 7Η20、1· 2g/L Na2HPO4'2mg/LMnS04 · H2O、IOmg/L ZnSO4 · 7H20、IOg酵母提取物、20g/L CaCO3、以及60g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中精氨酸的水平總結在下面的表3中。
表3
權利要求
1.一種源自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的多肽，具有SEQ IDNO. I的氨基酸序列，顯示出こ酰谷氨酸合酶和こ酰鳥氨酸酶二者活性。
2.—種由SEQ ID NO. 2表示的多核苷酸，編碼權利要求
I所述的多肽。
3.ー種攜帶權利要求
2所述的多核苷酸的重組載體pEK-Ptrc: :Ncgll469,如圖2中說明的。
4.一種能夠生產(chǎn)氨基酸的棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)菌株,所述棒狀桿菌菌株用權利要求
3所述的重組載體轉化從而相對于內在活性增強こ酰谷氨酸合酶和こ酰鳥氨酸酶的活性。
5.根據(jù)權利要求
4所述的棒狀桿菌菌株，其中，所述菌株是谷氨酸棒狀桿菌。
6.根據(jù)權利要求
4所述的棒狀桿菌菌株，其中，所述氨基酸是L-鳥氨酸或L-精氨酸。
7.ー種用于生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的方法，包括 培養(yǎng)權利要求
4所述的谷氨酸棒狀桿菌菌株；以及 從所述菌株中回收鳥氨酸或精氨酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種多核苷酸，該多核苷酸對于與來自谷氨酸棒狀桿菌的鳥氨酸或精氨酸生物合成相關的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶具有活性。本發(fā)明還涉及由所述多核苷酸編碼的多肽，包括所述多核苷酸的重組載體，通過將所述重組載體引入到用于生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的宿主微生物中，并且轉化該重組載體而獲得的轉化體，以及通過培養(yǎng)所述轉化體來生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸的方法。與內在活性相比較，本發(fā)明的轉化體對于乙酰谷氨酸合酶和乙酰鳥氨酸酶的活性增加，并且因此可以以高產(chǎn)率從本發(fā)明的轉化體中生產(chǎn)L-鳥氨酸或L-精氨酸。
文檔編號C12P13/10GKCN102712910SQ201080055961
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月29日
發(fā)明者李智惠, 趙栽熔, 趙鎮(zhèn)滿, 金蕙園 申請人:Cj第一制糖株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan