專利名稱:利用乳糖誘導pMFH載體生產重組蛋白的發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程藥物制備領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用乳糖誘導pMFH載體生產重組蛋白的發(fā)酵方法。
背景技術：
目前工業(yè)生產中大多使用大腸桿菌作為工程菌來生產目 的蛋白，其中工程菌的高密度培養(yǎng)至關重要，采用高密度培養(yǎng)技術提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產物的比生產率(單位體積單位時間內目的蛋白的產量)，不僅可減少培養(yǎng)體積、強化下游分離純化，還可以縮短發(fā)酵周期、減少設備投資從而降低生產成本，能大大地提高其在市場上的競爭力。為了實現這一目的，不僅要考慮重組菌本身的表達性質，而且還必須考慮重組菌生長和產物表達的最適環(huán)境條件，包括適宜的培養(yǎng)基組成、合適的培養(yǎng)溫度、pH、溶解氧、穩(wěn)定的比生長速率以及營養(yǎng)物的合理流加(分批補料策略)等。
對于設置有乳糖操縱子的重組載體，人們常用IPTG作為誘導劑。然而，IPTG對于人體具有潛在的毒性，當利用IPTG誘導表達應用于人體的重組藥物時，對最終的產品會帶來一些不利影響，一些國家明文已規(guī)定在生產人用重組蛋白類藥物的生產工藝中不得使用IPTG0另外，IPTG的價格也較為昂貴，尤其是在較大體積的發(fā)酵罐中進行工業(yè)化生產誘導時，IPTG的應用會給發(fā)酵成本帶來超重的負擔(Kapralek et al. 1991)。因此，盡管IPTG是Lac操縱子最有效的誘導劑，但它并不適合于大規(guī)模制備重組蛋白，特別是藥用重組蛋白。與IPTG相比，利用乳糖作為誘導劑其誘導過程較為復雜和麻煩，首先乳糖自身無法進入到菌體細胞的內部，它是一個主動運輸的過程，需要借助于乳糖透過酶(Permease)的作用，因此乳糖的轉運受多種因素的影響；另外.乳糖進入細胞后仍然不能誘導Lac啟動子的啟動，它需要經過β_半乳糖苷酶的作用轉化為異乳糖(Allolactose)后才起誘導劑的作用(Jobe A, Bourgeois S. J Mol Biol, 1972,69 :397-408 ；Muller-Hill B, Rickenberg HV, Wallenfels K. J Mol Biol, 1964，10 :303-318)。也正因為如此，迄今為止僅有少量的利用乳糖作為誘導劑誘導重組產物表達的研究報道，而在高密度發(fā)酵中應用乳糖誘導產物表達的研究則少見報道。盡管如此，乳糖的蛋白誘導效率雖不如IPTG，但乳糖所具備的無毒和價廉的優(yōu)點，使得其在重組基因工程蛋白類藥物的工業(yè)化發(fā)酵生產中，仍具有優(yōu)于IPTG的潛在價值和優(yōu)勢。由于乳糖本身會引起細胞在轉運以及生理代謝等方面的一系列復雜的變化，從而需要對工程菌生長及誘導表達條件等進行更為精細的優(yōu)化研究來提高乳糖的誘導效率。
pMFH 表達載體(Su ZD and Ni F. Novel fusion protein for efficientproduction of recombinant peptides. PCT/W02004/015111 ；Su ZD et al, Protein EngDes Sel. 17,647-657,2004 ;Su ZD and Ni F. Staphylococcal nuclease fusion proteinfor the production of recombinant peptides, US 7390639B2 ；Su ZD et al, PCT/CA2003/001197)是一個具有Lac操縱子的表達載體，能有效表達100個氨基酸組成的多肽。目前，尚未有關于用乳糖誘導發(fā)酵利用ρΜ 載體構建得到的重組載體的報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺陷和不足之處，提供一種利用乳糖誘導pMFH載體生產重組蛋白的發(fā)酵方法。
本發(fā)明的目的是由下述技術方案實現的一種利用乳糖誘導pMFH載體生產重組蛋白的發(fā)酵方法，包括如下步驟
(I)將已轉化利用ρΜ 載體和目的基因構建得到的重組載體質粒的宿主菌進行活化，依次制備一級種子和二級種子；
(2)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在接種后2. 5 4h開始慢速流加乳糖誘導前補料液，乳糖誘導前補料液體積與發(fā)酵罐工作體積之比為1/25 1/20，于I 2h流加完，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡 萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期(OD6tltl在25. 8 39范圍內)，這時開始流加乳糖誘導液進行誘導目的蛋白的表達，乳糖誘導液體積與發(fā)酵罐工作體積之比為1/25 1/20,1 2h補加完,加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液,乳糖誘導后補料液體積與發(fā)酵罐工作體積之比為1/25 1/20，于2 3h內流加完，持續(xù)誘導6 8h，發(fā)酵罐中乳糖誘導終濃度為10 16g/L ；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下Glucose (葡萄糖)2 8g/L、Yeast extract(酵母提取物)12 30g/L、Tryptone (胰蛋白胨)8 24g/L、NaCl 2 6g/L、(NH4)2SO4I 3g/L、Na2HPO4 4 10g/L、KH2PO4 2 8g/L、Citric Acid (檸檬酸)O. 5 2. 4g/L、MgSO4 · 7H200.4 1.2g/L，微量元素溶液lml/L，用去離子水配制，氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH6· 8 7· 5 ;
所說的微量元素溶液的組成為=FeSO4 · 7H20 I. 8 3. 6g/L、MnCl2 · 4H20 I. 2 2. 8g/L、Co (NO3)2 · 6H20 2· O 4. Og/L、CaCl2 · 2Η20 I. O 2· Og/L、CuCl2 · 2Η20 O. I O. 3g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 2 0. 4g/L、H3BO3 0. 6 I. 8g/L 和 Na2MoO4 · 2H20 I. 0 3. Og/L溶于lmol/L HCl中，微量元素溶液過濾除菌；
所述的誘導前補料液的組成為Glucose 225 450g/L、MgSO4 · 7H20 5 10g/L、NH4Cl 15 60g/L,用去離子水配制；
所述的誘導后補料液的組成為Glycerol (甘油)150 450g/L、Lactose (乳糖)50 150g/L、MgSO4 · 7H20 5 10g/L,用去離子水配制；
所述的乳糖誘導液的組成為Lactose 50 300g/L、Yeast extract 50 300g/L、MgSO4 · 7H20 5 lOg/L,用去離子水配制；
所述的宿主菌為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)；
所述的目的基因優(yōu)選公開號為“CN 101294187A”、發(fā)明名稱為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應用”中所涉及的GLP-I衍生物的核苷酸序列；
所述的活化優(yōu)選通過搖瓶培養(yǎng)進行活化；搖瓶培養(yǎng)的條件為35 40°C、150 250rpm培養(yǎng)12 20h，接種量為0. 5 2% (體積百分比)，搖瓶裝液量為10 30% (體積百分比)；培養(yǎng)基為含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml ;LB培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，用去離子水配制，pH 值 6. 8 7. 5 ；[0017]所述的一級種子優(yōu)選通過以下方法制備將活化的菌種接種于發(fā)酵基礎培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)的條件為搖瓶裝液量為10 30% (體積百分比)，于35 40°C、150 250rpm培養(yǎng)8 16h ;接種量為O. 5 2% (體積百分比)；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(2YT)的組分組成如下所示胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、用去離子水配制，氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH值為6. 8 7. 5 ;
所述的二級種子優(yōu)選通過以下方法制備將一級種子接種到改進培養(yǎng)基中于35 40°C、150 250rpm繼續(xù)活化7 IOh ;接種量為O. 5 2% (體積百分比)；搖瓶裝液量為10 30% (體積百分比);所述改進培養(yǎng)基的組分組成如下所示葡萄糖O. 5 2g/L、酵母提取物 15 30g/L、胰蛋白胨 10 25g/L、NaCl 2 8g/L、(NH4)2SO4 2 8g/L、Na2HPO4 6 24g/L,KH2PO4 2 6g/L、MgS04 · 7H20 O. 4 I. 6g/L，用去離子水配制，氨芐青霉素 100 μ g/ml，初始 pH 6. 8 7. 5 ;
步驟(2)所述發(fā)酵的培養(yǎng)條件為接種量為8 12% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為37 40°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在30 50% (體積百分比)、pH值控制在6. 8 7. 5，發(fā)酵過程中通過加鹽酸與氫氧化鈉溶液來調節(jié)pH值，發(fā)酵時 間為10 20h ；
以上所涉及的培養(yǎng)基和補料液都是使用前115 121°C，滅菌15 20min。
本發(fā)明的優(yōu)點在于
(I)本發(fā)明成功運用乳糖替代IPTG作為誘導劑來誘導目的蛋白的表達。
(2)通過本發(fā)明所述的技術方案，得到的大腸桿菌BL21(DE3)菌體得率高，0D_值可達到90左右，菌體濕重達48 80g/L。
(3)本發(fā)明的目的蛋白表達水平高，目的蛋白占菌體總蛋白的水平可達35 49%，與IPTG誘導水平相當。
(4)本發(fā)明利用乳糖誘導蛋白表達外，它還能大幅提高菌的生物量。
(5)本發(fā)明在發(fā)酵過程中添加乳糖誘導后再補甘油作為碳源，既可大大提高生物量，又能減少代謝副產物乙酸的生成，還能避免由于發(fā)酵液中葡萄糖的存在而影響乳糖的誘導效果。
(6)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法簡便，發(fā)酵時間短，生產成本低，另外，無IPTG存在，后
處理簡單。


圖I是實施例I制備的pMFH-GLP-Ι的質粒圖譜。
圖2是實施例I中添加乳糖誘導不同時間的蛋白表達情況，其中
泳道M為蛋白Marker,泳道I 8依次分別為添加乳糖誘導Oh、lh、2h、3h、4h、5h、6h和7h的蛋白表達情況。
圖3是實施例3中添加乳糖誘導不同時間的蛋白表達情況，其中
泳道M為蛋白Marker,泳道I 9依次分別為添加乳糖誘導Oh、lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h的蛋白表達情況。
圖4是重組工程菌pMFH-GLP-l-PA6. 2-BL21 (DE3)高密度培養(yǎng)時的生長曲線。
圖5是重組工程菌pMFH-GLP-l-PA6. 2-BL21 (DE3)高密度培養(yǎng)時的蛋白表達情況，其中
泳道M為蛋白Marker,泳道I 7依次分別為添加乳糖誘導Oh、lh、2h、3h、4h、5h和6h的蛋白表達情況。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例I
(I) pMFH-GLP-l-DP6. 2原核表達載體的構建
①pMFH-GLP-1 (7-37)重組質粒的構建
GLP-I (7-37) cDNA 序列為
CAC GCT GM GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTG GM GGG CAG GCTGCA AAAGAA TTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA
根據上面GLP-I (7-37)的序列設計4個寡核苷酸片段，引物I的5’端引入EcoRI黏性末端；引物4的5 ’端包含BamH I黏性末端，并使其3 ’端有同引物I互補的27個堿基，引物序列如下
EcoR I
引物I(Pl) :5，-|aa ttc| cac GCT GAA GGT ACC ttc ACT TCC GAC GTT TCC TCTTAC CTGGAA GGG CAG GCT GCA AAA-3’
引物2(P2) :5，-GAA TTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA G_3’
引物3(P3) :5，-GGA AAC GTC GGA AGT GAA GGT ACC TTC AGC GTG G_3’
BamH I
引物4(P4) :5，-|GA TCC| TTA GCC ACG ACC TTT AAC CAG CCA AGC GAT AAA TTCTTT TGCAGC CTG CCC TTC CAG GTA AGA-3’
引物序列由上海英駿生物技術有限公司代為合成。目的基因GLP-I (7-37)獲得分別將合成的四個寡聚核苷酸鏈P1、P2、P3、P4用TE溶解，接著將等摩爾的P1、P2、P3與P4進行退火復性，并使之終濃度為Ipmol/ μ I,復性總體系為40 μ 1，復性條件94°C保溫5min后，每90秒下降1°C徐冷至25V ;然后用I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收待克隆基因片段(108bp)。
用EcoR I和BamH I對原核表達載體pMFH進行雙酶切，pMFH質粒雙酶切反應體系為pMFH 質粒 2. O μ g，10 X Buffer H 5. O μ L，EcoR I 2· O μ L，BamHI 2· O μ L，加 MillQ水至50 μ L。酶切反應條件30°C水浴2h，然后37°C水浴2h。將目的基因片段與酶切好的pMFH原核表達載體于16°C連接3 4h，連接體系為pMFH雙酶切產物50ng，目的DNA片段60ng, 10 X ligation Buffer 2. Ομ L,T4 DNA Ligase I. O μ L，加 MillQ 水至 20 μ L。連接產物轉化大腸桿菌DH5a (購于大連寶生物公司)，通過氨芐青霉素(Amp)選擇培養(yǎng)后，挑取獨立、分離的單克隆4 6個,分別置于內含AmplOO μ g/ml的5ml液體LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)好的菌液用質粒抽提試劑盒(購于0MEGA，按照說明書進行操作)抽提質粒，用EcoR I和BamH I進行雙酶切(酶切體系與條件同上)，酶切產物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定，將酶切片段長度符合插入片段長度的重組質粒送上海英駿公司測序部測序鑒定，得到pMFH-GLP-1 (7-37)重組質粒(如圖I所示)。
②GLP-I衍生物肽cDNA序列的重疊延伸PCR擴增
GLP-I衍生物肽cDNA序列為
GAT CCG CTG CCG CAT AGC CAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGTGGC CCGCAC GCT GAA GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTG GAA GGG CAG GCTGCA AAA GAATTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA
采用重疊延伸PCR方法，以pMFH-GLP-1 (7-37)重組質粒為模板，擴增GLP-I衍生物肽cDNA序列，具體步驟如下根據模板pMFH-GLP-1 (7-37) DNA序列和人血清白蛋白結合12-mer肽(ABP) LPHSHRAHSLP P的DNA序列設計重疊延伸PCR的引物，因 表達的融合蛋白要通過甲酸的水解釋放GLP-I衍生物肽，故在上游引物I (引物Fl)的5’端添加甲酸作用位點天冬氨酸-脯氨酸(D-P)的密碼子，并在其5’末端添加EcoR I酶切位點和4個保護堿基，上游引物2(引物Fp)5’端是人血清白蛋白結合12-mer肽中H S LP P 5個氨基酸的密碼子，緊接著依次是Thrombin酶切位點FNPR、DPP-IV的酶切位點GP、GLP-I (7-37)中HAEGT的密碼子；下游引物(引物R)則與蛋白表達載體pMFH的反向引物序列相同。引物序列由上海英駿生物技術有限公司代為完成。
EcoRI甲酸位點
F1 :5，-GCGC ^AA TT^jGAT CCG| CTG CCG CAT AGC CAT CGC GCC CAT AGC CTG CCGCCG-3’
Fp :5，-CAT AGC CTG CCG CCG TTC MC CCG CGT GGC CCG CAC GCT GM GGT ACC-3，
R:5， -TCATCCGCCAAAACAGCCAAG-3’
重疊延伸PCR反應體系為
模板pMFH-GLP-1 質粒IOOng
10 X LA GC buffer I5. O μ L
上游引物I (IOpmol)2. O μ L
上游引物2(10pmol)2. O μ L
下游引物(IOpmol)4. O μ L
dNTP Mixture (各 2. 5mM) I. O μ L
Takara LA Taq (5U/ μ L) O. 5 μ L
Mill Q 水up to 50 μ L
重疊延伸PCR反應條件95°C預變性4min后進入循環(huán)，循環(huán)條件為95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共進行30個循環(huán)，然后72°C延伸lOmin，再冷卻至4°C。反應結束后取25 μ L PCR產物于質量體積比為2. O %的瓊脂糖凝較電泳分離長度為216bp目的基因片段。
③重疊延伸PCR產物的膠回收
使用Omega膠回收試劑盒，按照試劑盒的說明進行操作。
④酶切與連接
膠回收目的DNA片段用EcoRI和BamHI雙酶切
膠回收的目的DNA片段的酶切反應體系為[0074]膠回收DNA片段500ng
10 X Buffer H5. O μ L
EcoRI2· O μ L
BamHI2. O μ L
MillQ 水up to 50 μ L
酶切反應條件30°C水浴2h，37°C水浴此。
⑤pMFH表達載體的擴增及抽提
使用OMEGA質粒抽提試盒，按試劑盒的說明進行操作。
⑥pMFH表達載體的雙酶切
pMFH質粒雙酶切反應體系為
pMFH 質粒2. O μ g
10 X Buffer H5. O μ L
EcoRI2· O μ L
BamHI2. O μ L
MillQ 水up to 50 μ L
酶切反應條件30°C水浴2h，然后37°C水浴2h。
⑦pMFH質粒雙酶切產物的清潔
使用V-gene PCR清潔試盒,按試劑盒的說明進行操作。
⑧EcoRI和BamHI雙酶切產物的連接pMFH質粒載體EcoRI和BamHI
雙酶切產物與重疊延伸PCR擴增后GLP-I衍生物對應的目的DNA片段的EcoRI和BamHI雙酶切產物的連接體系為
pMFH雙酶切產物50ng
目的DNA片段雙酶切產物60ng
10 X ligation Buffer2. O μ L
Τ4 DNA Ligasel.OyL
MillQ 水up to 20 μ L
連接反應條件16°C水浴16 20h，接著參照《分子克隆》中的轉化方法將連接產物轉化大腸細菌BL21 (DE3)(購于大連寶生物公司)，接著對在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上生長出來的菌落進行PCR篩選和測序，得到pMFH-GLP-l-DP6. 2原核表達載體。
(2)保種將經過測序鑒定的菌種PMFH-GLP-1-DP6. 2-BL21 (DE3) 4 μ I接種到4mlLB培養(yǎng)基(Amp濃度為100 μ g/ml)中，在37°C下搖床(200rpm)培養(yǎng)約12h，之后用體積百分比50%的甘油進行保種，體積百分比50%的甘油菌液比例為3:7，_70°C保存?zhèn)溆茫?br>(3)菌種的活化將甘油菌PMFH-GLP-1-DP6. 2-BL21 (DE3)進行搖瓶培養(yǎng)，于150ml三角瓶中裝30ml培養(yǎng)基，進行活化，得到活化的菌種；搖瓶培養(yǎng)的條件為37°C、200rpm培養(yǎng)12h,甘油菌的接種量為1% (體積百分比),培養(yǎng)基為含有氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基，氨節(jié)青霉素的濃度為100 μ g/ml ;LB培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L,用去離子水配制，pH值為7. O ；
(4) 一級種子的制備將步驟(3)制備的活化的菌種接種于發(fā)酵基礎培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)的條件為裝液量為250ml搖瓶中裝50ml發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，于37°C、200rpm培養(yǎng)過夜約10h，接種量為1% (體積百分比)；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、用去離子水配制,氨節(jié)青霉素100 μ g/ml，初始pH值為7.0 ；
(5) 二級種子的制備將一級種子接種到600ml改進培養(yǎng)基中于37°C、200rpm繼續(xù)活化8h，接種量為1% (體積百分比)，裝液量為20% (體積百分比)，3個IL搖瓶中各裝200ml改進培養(yǎng)基，氨芐青霉素100 μ g/ml ；
改進培養(yǎng)基的組分組成如下所示葡萄糖lg/L、酵母提取物22g/L、胰蛋白胨18g/L、NaCl 5g/L、(NH4)2SO4 5g/L, Na2HPO4 15g/L, KH2PO4 4g/L、MgSO4 · 7H20 lg/L，用去離子水配制，初始 pH 7.0，1211，滅菌151^11;
(6)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，二級種子接種量為10% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為37°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在40%、pH值 控制在7. O,發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/LNa0H來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為12h ；在接種后2. 5h開始慢速流加乳糖誘導前補料液200ml (Ih流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后5h開始流加乳糖誘導液200ml (I. 5h補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的0D_值為38. 75，乳糖誘導的終濃度為12. 5g/L，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液200ml (2h流加完)，持續(xù)誘導7h，得到GLP-I類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下Glucose4g/L, Yeast extract 20g/L, Tryptone 12g/L, NaCl 4g/L, (NH4)2SO4 2g/L，Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 4g/L, Citric Acid 2g/L，MgSO4 · 7H200.8g/L，微量元素溶液lml/L，用去離子水配制，氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH 7.25，121 °C，滅菌 20min ；
微量元素溶液的組成(g/L)=FeSO4 · 7Η20 2· 8，MnCl2 · 4H20 2.0,Co (NO3) 2 · 6Η203· 0，CaCl2 · 2H20 I. 5，CuCl2 · 2H20 0. 2，ZnSO4 · 7H20 0. 3，H3BO3 I. 0，Na2MoO4 ·2Η20 2. 0溶于lmol/L HCl中，微量元素0. 45 μ m膜(購于Millipore公司)過濾除囷；
所述的誘導前補料液的組成為Glucose300g/L、MgS04 ·7Η20 10g/L,NH4C140g/L,用去離子水配制；
所述的誘導后補料液的組成為Glycerol300g/L、Lactose 75g/L、MgSO4 · H2O5g/L,用去離子水配制；
所述的乳糖誘導液的組成為Lactose150g/L、Yeast extract 150g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L,用去離子水配制；
5L發(fā)酵罐實驗時以上兩種補料液與誘導液各配200ml，115°C，滅菌20min。
實驗結果=OD6tltl達到91，菌體濕重為70. 7g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6. 2占菌體總蛋白的量為45. 4%，不同時間蛋白表達情況見圖2所示，圖2說明乳糖成功替代IPTG實現了目的蛋白的誘導表達。
圖中凡涉及到目的蛋白SDS-PAGE電泳圖的，其中M表示蛋白Marker (從小到大依次是 14. 3kDa、20. IkDa, 29. OkDa,44. 3kDa、66. 4kDa、97. 2kDa 條帶)，20. IkDa 附近較深的條帶就是目的蛋白GLP-I衍生物融合蛋白所在的位置。
圖表中DCW表示細胞干重(dry cell weight)。
圖表中蛋白表達量(％ )是用AlphaEase FC軟件對SDS-PAGE電泳圖進行灰度掃描后得到的數據。
實施例2
(I)本實施例二級種子的制備與實施例I相同。
(2)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，接種量為12% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為37°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在30%、pH值控制在7. 25，發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/L NaOH來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為13h ;在接種后4h開始慢速流加乳糖誘導前補料液200ml (Ih流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降， 因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后6h開始流加乳糖誘導液200ml (I. 5h補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的0D_值為25. 84，乳糖誘導的終濃度為12. 5g/L，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液200ml (2h流加完)，持續(xù)誘導7h，得到GLP-I類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基、補料液、誘導液組分與實施例I 一樣。
實驗結果=OD6qq達到86，菌體濕重為67. 4g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6. 2占菌體總蛋白的量為36.4%。
實施例3
(I)菌種的活化將甘油菌pMFH-GLP-l-DP6. 2-BL21 (DE3)進行搖瓶培養(yǎng)，于150ml三角瓶中裝15ml培養(yǎng)基，進行活化，得到活化的菌種；搖瓶培養(yǎng)的條件為35°C、250rpm培養(yǎng)20h，甘油菌的接種量為O. 5% (體積百分比)，培養(yǎng)基為含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml ；LB培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L,用去離子水配制，pH值為6. 8 ;
(2) 一級種子的制備將步驟(I)制備的活化的菌種接種于發(fā)酵基礎培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)的條件為裝液量為250ml搖瓶中裝25ml發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，于35°C、250rpm培養(yǎng)過夜約16h，接種量為O. 5% (體積百分比)；
發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L、NaCl 5g/L、用去離子水配制,氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH值為6. 8 ；
(3) 二級種子的制備將一級種子接種到600ml改進培養(yǎng)基中于35°C、250rpm繼續(xù)培養(yǎng)10h，接種量為0.5% (體積百分比)，裝液量為10% (體積百分比)，6個IL搖瓶中各裝IOOml改進培養(yǎng)基，氨芐青霉素100 μ g/ml ；
改進培養(yǎng)基的組分組成如下所示葡萄糖2g/L、酵母提取物30g/L、胰蛋白胨25g/L、NaCl 8g/L、(NH4)2SO4 8g/L, Na2HPO4 24g/L, KH2PO4 6g/L、MgSO4 · 7Η201· 6g/L，用去離子水配制，初始 pH 6.8，1151，滅菌201^11;
(4)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，接種量為10% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為38°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在30%、pH值控制在7. 5，發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/L NaOH來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為15h ;在接種后4h開始慢速流加乳糖誘導前補料液200ml (I. 5h流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后7h開始流加乳糖誘導液200ml (I. 5h補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的OD_值為26，乳糖誘導的終濃度為10g/L，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液200ml (2. 5h流加完)，持續(xù)誘導8h，得到GLP-I類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下Glucose2g/L, Yeast extract 30g/L, Tryptone 8g/L,NaCl 6g/L, (NH4)2SO4 3g/L, Na2HPO4 4g/L, KH2PO4 2g/L, Citric Acid 0. 5g/LMgS04 · 7H200.8g/L，微量元素溶液lml/L，用去離子水配制，氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH 7.5，121 °C，滅菌 20min ；
微量元素溶液的組成(g/L):FeS04 · 7H20 I. 8，MnCl2 · 4H20 1.2，Co (NO3) 2 · 6Η204· 0，CaCl2 · 2H20 2. 0，CuCl2 · 2H20 0. 3，ZnSO4 · 7H20 0. 4，H3BO3 I. 8，Na2MoO4 ·2Η20 3. 0溶于lmol/L HCl中，微量元素0. 45 μ m膜(購于Millipore公司)過濾除囷；
所述的誘導前補料液的組成為Glucose450g/L, MgSO4 · 7H20 5g/L、NH4C160g/L，用去離子水配制；
所述的誘導后補料液的組成為Glycerol150g/L、Lactose 125g/L、MgSO4 · 7H205g/L,用去離子水配制；
所述的乳糖誘導液的組成為Lactose50g/L、Yeast extract 200g/L、MgSO4 · 7H20 8g/L,用去離子水配制；
5L發(fā)酵罐實驗時以上兩種補料液與誘導液各配200ml，115°C，滅菌20min。
實驗結果=OD6qq達到78. 57，菌體濕重為54. 9g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6. 2占菌體總蛋白的量為35%，不同時間蛋白表達情況見圖3，圖3說明當發(fā)酵工藝條件改變后乳糖同樣能誘導目的蛋白的表達。
實施例4
(I)菌種的活化將甘油菌pMFH-GLP-l-DP6. 2-BL21 (DE3)進行搖瓶培養(yǎng)，于150ml三角瓶中裝45ml培養(yǎng)基，進行活化，得到活化的菌種；搖瓶培養(yǎng)的條件為40°C、150rpm培養(yǎng)12h，甘油菌的接種量為2% (體積百分比)，培養(yǎng)基為含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml ；LB培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L,用去離子水配制，pH值為7. 5 ;
(2) 一級種子的制備將步驟(I)制備的活化的菌種接種于發(fā)酵基礎培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)的條件為裝液量為250ml搖瓶中裝75ml發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，于40°C、150rpm培養(yǎng)過夜約8h，接種量為2% (體積百分比)；
發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L、NaCl 5g/L、用去離子水配制,氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH值為7. 5 ；
(3) 二級種子的制備將一級種子接種到600ml改進培養(yǎng)基中于40°C、150rpm繼續(xù)活化7h，接種量為2% (體積百分比)，裝液量為30% (體積百分比)，2個IL搖瓶中各裝300ml改進培養(yǎng)基，氨芐青霉素100 μ g/ml ；
改進培養(yǎng)基的組分組成如下所示葡萄糖0. 5g/L，酵母粉15g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L，用去離子水配制，初始 pH 7.5，121°〇，滅菌201^11;
(4)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，接種量為8% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為40°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在30%、pH值控制在
6.8，發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/L NaOH來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為14h ;在接種后5h開始慢速流加乳糖誘導前補料液200ml (Ih流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后7h開始流加乳糖誘導液200ml (2h補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的0D_值為32. 5，乳糖誘導的終濃度為15g/L，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液200ml (2h流加完)，持續(xù)誘導7h，得到GLP-I類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下Glucose6g/L, Yeast extract 18g/L, Tryptone 18g/L, NaCl 2g/L, (NH4)2SO4 2g/L，Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 8g/L, Citric Acid lg/L，MgSO4 · 7H20 0.4g/L，微量元素溶液lml/L，用去離子水配制，氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH 7.0，121 °C，滅菌 20min ；
微量元素溶液的組成(g/L)=FeSO4 · 7Η20 3· 6，MnCl2 · 4H20 2.8,Co (NO3) 2 · 6Η202· 0，CaCl2 · 2H20 I. 0，CuCl2 · 2H20 0. 1，ZnSO4 · 7H20 0. 2，H3BO3 0. 6，Na2MoO4 ·2Η20 I. 0溶于lmol/L HCl中，微量元素0. 45 μ m膜(購于Millipore公司)過濾除囷；
所述的誘導前補料液的組成為Glucose225g/L, MgSO4 · 7H20 5g/L、NH4Cl 15g/L，用去離子水配制；
所述的誘導后補料液的組成為Glycerol300g/L、Lactose 50g/L、MgSO4 · 7H208g/L,用去離子水配制；
所述的乳糖誘導液的組成為Lactose200g/L、Yeast extract 300g/L、MgSO4 · 7H20 lOg/L,用去離子水配制；
5L發(fā)酵罐實驗時以上兩種補料液與誘導液各配220ml，115°C，滅菌20min。
實驗結果=OD6qq達到79，菌體濕重為61. 4g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6. 2占菌體總蛋白的量為40.8%。
實施例5
(I)本實施例二級種子的制備與實施例I相同。
(2)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，接種量為10% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為37°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在50%、pH值控制在
7.0，發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/L NaOH來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為13h ;在接種后3h開始慢速流加乳糖誘導前補料液200ml (2h流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后6h開始流加乳糖誘導液200ml (Ih補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的0D_值為39. 0，乳糖誘導的終濃度為16g/L，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液200ml (3h流加完)，持續(xù)誘導7h，得到GLP-I類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下Glucose8g/L, Yeast extract 12g/L, Tryptone 24g/L,NaCl 4g/L, (NH4)2SO4 lg/L, Na2HPO4 lOg/L, KH2PO4 6g/L, Citric Acid 2. 4g/L，MgSO4 · 7H201.2g/L，微量元素溶液lml/L，用去離子水配制，氨芐青霉素100 μ g/ml，初始pH 7.25，121 °C，滅菌 20min ；
微量元素溶液的組成(g/L)=FeSO4 · 7Η20 2· 8，MnCl2 · 4H20 2.0,Co (NO3) 2 · 6Η203· 0，CaCl2 · 2H20 I. 5，CuCl2 · 2H20 0. 2，ZnSO4 · 7H20 0. 3，H3BO3 I. 0，Na2MoO4 ·2Η20 2. 0溶于lmol/L HCl中，微量元素0. 45 μ m膜(購于Millipore公司)過濾除囷；
所述的誘導前補料液的組成為Glucose300g/L, MgSO4 · 7H20 8g/L、NH4C140g/L，用去離子水配制；
所述的誘導后補料液的組成為Glycerol450g/L、Lactose 150g/L、MgSO4 · 7H2010g/L，用去離子水配制；
所述的乳糖誘導液的組成為Lactose75g/L、Yeast extract 100g/L、 MgSO4 · 7H20 5g/L,用去離子水配制；
5L發(fā)酵罐實驗時以上兩種補料液與誘導液各配250ml，115°C，滅菌20min。
實驗結果=OD6qq達到75. 6，菌體濕重為80g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6. 2占菌體總蛋白的量為46.5%。
實施例6
(I) pMFH-GLP-1-PA 6. 2原核表達載體的構建
②GLP-I ’衍生物肽cDNA序列的重疊延伸PCR擴增
要得到GLP-Γ衍生物肽cDNA序列為(此序列與實施例I中序列有兩個密碼子不同)
GAT CCG CTG CCG CAT AGC CAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGTCCG CCGCAC GCT GAA GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTG GAA GGG CAG GCTGCA AAA GAATTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA
pMFH-GLP-1-PA 6. 2原核表達載體的構建同實施例步驟⑴，與實施例I的不同在于上游引物2 (引物FP)，本實施例用的上游引物2 (引物F/ )如下所示
Fp，5，-CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGT CCG GCT CAC GCT GAA GGTACC-3，。
(2)本實施例二級種子的制備與實施例I相同。
(3)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，接種量為10% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為37°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在40%、pH值控制在
7.0，發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/L NaOH來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為Ilh ;在接種后3h開始慢速流加乳糖誘導前補料液200ml (Ih流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后5h開始流加乳糖誘導液200ml (I. 5h補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的0D_值為30. 52，乳糖誘導的終濃度為12. 5g/L，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液200ml (2h流加完)，持續(xù)誘導6h，得到GLP-1類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基、補料液、誘導液組分與實施例I 一樣。[0169]實驗結果0D6QQ達到93，菌體濕重為82. 8g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-PA6. 2占菌體總蛋白的量為49. 2%，重組工程菌BL21 (DE3)/pMFH-GLP-l-PA6. 2高密度培養(yǎng)時的生長情況如圖4所示，不同時間蛋白表達情況見圖5，圖4和圖5說明本發(fā)明所述的發(fā)酵方法同樣適合于其它GLP-I類似物包涵體蛋白的發(fā)酵生產。
對比實施例(I)本實施例二級種子的制備與實施例I相同。
(2)發(fā)酵和誘導同實施例1，區(qū)別在于使用IPTG誘導液，具體步驟如下將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(臺灣Bio-top公司，型號BTF-A5L)工作體積為3. 5L，接種量為10% (體積百分比)，發(fā)酵溫度為37°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度(O IOOOrpm)控制在40%、pH值控制在7. 0，發(fā)酵過程中通過加2mol/L HCl與2mol/L NaOH來調節(jié)pH值，發(fā)酵時長為12h ;在接種后2. 5h開始慢速流加誘導前補料液200ml (Ih流加完)，此時發(fā)酵液的pH值會一直下降，因為葡萄糖代謝會產酸，當流加進去的葡萄糖耗完后PH值會開始上升，此時進入對數生長期前中期，接種后5h開始流加IPTG誘導液200ml (I. 5h補完)進行誘導目的蛋白的表達，誘導起始時的OD6tltl值為34. 86，IPTG誘導的終濃度為lmmol/L，加完誘導液后立即補加誘導后補料液200ml (2h流加完)，持續(xù)誘導7h，得到GLP-I類似物包涵體蛋白；
發(fā)酵培養(yǎng)基與微量元素溶液的組成同實施例I ;
所述的誘導前補料液的組成為Glucose300g/L、MgS04 ·7Η20 10g/L,NH4C140g/L,用去離子水配制；
所述的誘導后補料液的組成為Glycerol 300g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L,用去離子水配制；
所述的IPTG 誘導液的組成為Yeast extract 150g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L,用去離子水配制，誘導前(滅菌后)添加IPTG至終濃度為lmmol/L ；
5L發(fā)酵罐實驗時以上兩種補料液與誘導液各配200ml，115°C，滅菌20min。
實驗結果=OD6qq達到74. 7，菌體濕重為54. 7g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6. 2占菌體總蛋白的量為49.3%。此結果說明ImM IPTG誘導目的蛋白表達的水平稍高于乳糖，但使用IPTG誘導后的終0D_與菌體濕重均小于使用乳糖誘導后的值，從而進一步說明乳糖不僅能誘導目的蛋白表達還能作為C源被利用促進菌的生長。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種利用乳糖誘導PMHl載體生產重組蛋白的發(fā)酵方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將已轉化利用PMFH載體和目的基因構建得到的重組載體質粒的宿主菌進行活化，依次制備一級種子和二級種子； (2)發(fā)酵和誘導將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在接種后2.5 4h開始慢速流加乳糖誘導前補料液，乳糖誘導前補料液體積與發(fā)酵罐工作體積之比為1/25 1/20，于I 2h流加完；當發(fā)酵罐內的pH值開始上升時流加乳糖誘導液進行誘導目的蛋白的表達，乳糖誘導液體積與發(fā)酵罐工作體積之比為1/25 1/20，I 2h補加完，加完誘導液后立即補加乳糖誘導后補料液，乳糖誘導后補料液體積與發(fā)酵罐工作體積之比為1/25 1/20，于2 3h內流加完，持續(xù)誘導6 8h，發(fā)酵罐中乳糖誘導終濃度為10 16g/L ； 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖2 8g/L、酵母提取物12 30g/L、胰蛋白胨8 24g/L、氯化鈉2 6g/L、硫酸銨I 3g/L、磷酸氫二鈉4 10g/L、磷酸二氫鉀2 8g/L、檸檬酸0.5 2.48/1、七水硫酸鎂0.4 1.28/1，微量元素溶液lml/L，用去離子水配制，氨芐青霉素100 u g/ml，初始pH 6. 8 7. 5 ; 所說的微量元素溶液的組成為=FeSO4 7H20 I. 8 3. 6 g/L、MnCl2 4H20 I. 2 2. 8g/L、Co (NO3)2 6H20 2. 0 4. 0 g/L、CaCl2 2H20 I. 0 2. 0 g/L、CuCl2 2H20 0. I 0. 3g/L、ZnSO4 7H20 0. 2 0. 4 g/L、H3BO3 0. 6 I. 8 g/L 和 Na2MoO4 2H20 I. 0 3. 0 g/L溶于lmol/L HCl中，微量元素溶液過濾除菌； 所述的誘導前補料液的組成為葡萄糖225 450 g/L、七水硫酸鎂5 10 g/L、氯化銨15 60 g/L,用去離子水配制； 所述的誘導后補料液的組成為甘油150 450 g/L、乳糖50 150 g/L、七水硫酸鎂5 10 g/L，用去離子水配制； 所述的乳糖誘導液的組成為乳糖50 300 g/L、酵母提取物50 300 g/L、七水硫酸鎂5 10 g/L,用去離子水配制； 步驟(2)所述發(fā)酵的培養(yǎng)條件為接種量為體積百分比8 12%，發(fā)酵溫度為37 40°C，溶氧通過調節(jié)通氣量與攪拌速度控制在體積百分比30 50%、pH值控制在6. 8 7.5，發(fā)酵過程中通過加鹽酸與氫氧化鈉溶液來調節(jié)pH值，發(fā)酵時間為11 15h ;所述攪拌的速度為0 IOOOrpm。
2.根據權利要求
I所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌{Escherichia coli ) BL21 (DE3)。
3.根據權利要求
I所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的活化為通過搖瓶培養(yǎng)進行活化；搖瓶培養(yǎng)的條件為35 40°C、150 250rpm培養(yǎng)12 20h，接種量為體積百分比0. 5 2%，搖瓶裝液量為體積百分比10 30% ;培養(yǎng)基為含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；氨芐青霉素的濃度為IOOy g/ml ;LB培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，用去離子水配制，pH值6. 8 7. 5。
4.根據權利要求
I所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的一級種子通過以下方法制備將活化的菌種接種于發(fā)酵基礎培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)的條件為搖瓶裝液量為體積百分比10 30%，于35 40°C、150 250rpm培養(yǎng)8 16h ;接種量為體積百分比0. 5 2% ;發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的組分組成如下所示胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化鈉5g/L、用去離子水配制,氨節(jié)青霉素100 u g/ml,初始pH值為6. 8 7. 5。
5.根據權利要求
I所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的二級種子通過以下方法制備將一級種子接種到改進培養(yǎng)基中于35 40°C、150 250rpm繼續(xù)活化7 IOh ;接種量為體積百分比0. 5 2% ;搖瓶裝液量為體積百分比10 30% ;所述改進培養(yǎng)基的組分組成如下所示葡萄糖0. 5 2g/L、酵母粉15 30g/L、胰蛋白胨10 25g/L、氯化鈉2 8g/L、硫酸銨2 8g/L、磷酸氫二鈉6 24g/L、磷酸二氫鉀2 6g/L、七水硫酸鎂0. 4 I.6g/L,用去離子水配制,氨節(jié)青霉素100 V- g/ml,初始pH 6. 8 7. 5。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種利用乳糖誘導pMFH載體生產重組蛋白的發(fā)酵方法。本發(fā)明主要通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配方、誘導前補料液的配方、誘導后補料液的配方、乳糖誘導液的配方以及發(fā)酵參數，成功運用乳糖替代IPTG作為誘導劑來誘導目的蛋白的表達。本發(fā)明的目的蛋白表達水平高，目的蛋白占菌體總蛋白的水平可達35～49％，與IPTG誘導水平相當。而且本發(fā)明在發(fā)酵過程中添加乳糖誘導后再補甘油作為碳源，既可大大提高生物量，又能減少代謝副產物乙酸的生成，還能避免由于發(fā)酵液中葡萄糖的存在而影響乳糖的誘導效果?？梢?，本發(fā)明不僅簡便，發(fā)酵時間短，生產成本低，而且得到的產物中無毒害物質殘留。
文檔編號C12P21/00GKCN101914603 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201010221511
公開日2012年11月21日 申請日期2010年7月8日
發(fā)明者冉艷紅, 周天鴻, 李弘劍, 蘇正定, 蔣德旗 申請人:暨南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),