專利名稱:使用egfl8拮抗劑抑制血管發(fā)生的方法
使用EGFL8拮抗劑抑制血管發(fā)生的方法
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發(fā)明領(lǐng)域
一般而言，本發(fā)明涉及對(duì)于與血管發(fā)生有關(guān)的狀況和疾病的治療有用的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及EGF樣結(jié)構(gòu)域8 (EGFL8)的拮抗劑。
發(fā)明背景
現(xiàn)在完全確立了血管發(fā)生對(duì)多種病癥的發(fā)病機(jī)理有重要貢獻(xiàn)。這些包括實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管疾病諸如增殖性視網(wǎng)膜病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞(RVO)、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、新血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Dudaet al., J.Clin.0ncology 25(26):4033-42 (2007) ；Kesisis et al.,Curr.Pharm.Des.13:2795-809(2007) ；Zhang and Ma,Prog.Ret.&Eye Res.26:1-37(2007)。
在腫瘤生長的情況中，血管發(fā)生讓腫瘤細(xì)胞獲得了與正常細(xì)胞相比的生長優(yōu)勢(shì)和增殖自治。腫瘤通常開始于單個(gè)異常細(xì)胞，由于與可利用毛細(xì)管床的距離，該細(xì)胞只能夠生長至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時(shí)間里保持“休眠”狀態(tài)而不進(jìn)一步生長或傳播。有些腫瘤細(xì)胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，所述內(nèi)皮細(xì)胞增殖并成熟成新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞傳播并再建群(recolonization)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的機(jī)制,但是認(rèn)為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡。
迄今為止，多種分子，多為由周圍細(xì)胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已鑒定為涉及刺激血管發(fā)生和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子。Ferrara et al.,Endocr.Rev.18:4-25(1997)。另外,一種ECM相關(guān)蛋白，稱作表皮生長因子樣7 (EGFL7)已經(jīng)顯示為由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)且在血管發(fā)生中有作用。Parker et al.,Nature 428:754-58 (2004) ；Fitch et al.,Dev.Dynamics 230:316-24(2004) ；Campagnolo et al.,Am.J Path.167(I):275-284(2005) ；Schmidt et al.,Development, 134(16):2913-23(2007);美國專利申請(qǐng) US2007/0031437。Fitch 等人還記載了 Egfl7的一種種內(nèi)同源基因(paralog)，稱作Egfl8，并指出了它的表達(dá)與Egfl7的相似，但是EGFL7和EGFL8在功能上可能不交疊。
盡管血管發(fā)生領(lǐng)域取得了許多進(jìn)展，仍然需要鑒定靶物和開發(fā)能補(bǔ)充或增強(qiáng)現(xiàn)有抗血管發(fā)生療法的療效的手段。
發(fā)明概述
本發(fā)明至少部分基于下述發(fā)現(xiàn)，即EGF樣結(jié)構(gòu)域S(EGFLS)涉及血管發(fā)生。因而，本發(fā)明提供用于抑制具有血管發(fā)生成分的病理性過程的新組合物及其用途。
一方面，本發(fā)明提供一種在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理性狀況的受試者中降低或抑制血管發(fā)生的方法，包括對(duì)該受試者施用EGFL8拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述EGFL8拮抗劑是抗EGFL8抗體。在一些實(shí)施方案中，所述病理性狀況是新生物，例如癌。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括化療劑。在一些實(shí)施方案中，所述病理性狀況與眼有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，所述病理性狀況是眼內(nèi)新血管疾病。
在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)所述受試者施用第二抗血管發(fā)生劑。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗血管發(fā)生劑在所述EGFL8拮抗劑的施用之前或之后施用。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗血管發(fā)生劑與所述EGFL8拮抗劑同時(shí)施用。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗血管發(fā)生劑是EGFL7的拮抗劑或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的拮抗齊U，例如抗EGFL7抗體或抗VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))。
附圖簡述

圖1A和圖1B顯示E10.5小鼠胚胎顱脈管系統(tǒng)中的Egf 17和Egf 18表達(dá)樣式。
圖2顯示被采用來生成Egf 18敲除小鼠的策略。
圖3顯示Egf 17+/-、Egf 18-/-和Egfl7_/_、Egfl8_/_小鼠的視網(wǎng)膜中的血管表型。
圖4顯示EgflS敲除小鼠中的角膜微袋血管發(fā)生表型。
發(fā)明詳述
定義
除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。參見例如Singleton et al., Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 第 2 版，J.Wiley & Sons (New York,NY 1994) ；Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold SpringHarbor, NY 1989)。為了本發(fā)明的目的,下文定義某些術(shù)語。
如本文中所使用的，術(shù)語“EGFL8”和“EGFL8多肽”指具有自自然界衍生的EGFL8多肽的氨基酸序列的多肽，不管其制備模式或物種。如此，EGFL8可具有天然存在的人EGFL8、鼠EGFL8、或來自任何其它物種的EGFL8的氨基酸序列。全長人EGFL8氨基酸序列為:
MGSRAELCTLLGGFSFLLLLIPGEGAKGGSLRESQGVCSKQTLVVPLHYNESYSQPVYKPYLTLCAGRRICSTYRTMYRVMWREVRREVQQTHAVCCQGWKKRHPGALTCEAICAKPCLNGGVCVRPDQCECAPGWGGKHCHVDVDECRTSITLCSHHCFNTAGSFTCGCPHDLVLGVDGRTCMEGSPEPPTSASILSVAVREAEKDERALKQEIHELRGRLERLEQWAGQAGAWVRAVLPVPPEELQPEQVAELWGRGDRIESLSDQVLLLEERLGACSCEDNSLGLGVNHR(SEQ IDNO:1)ο
全長小鼠EGFL8氨基酸序列為:
MGLWAELCISLRGLSFFLVLMTGEGTRGGSFKESLGVCSKQTLLVPLRYNESYSQPVYKPYLTLCAGRRICSTYRTTYRVAWREVRREVPQTHVVCCQGWKKPHPGALTCDAIC SKPCLNGGVCTGPDRCECAPGWGGKHCHVDVDECRASLTLCSHGCLNTLGSFLCSCPHPLVLGLDGRTCAGGPPESPTSASILSVAVREADSEEERALRWEVAELRGRLEKLEQWATQAGAWVRAVLPMPPEELRPEQVAELWGRGDRIESLSDQVLLLEERLGACACEDNSLGPSLRG(SEQID NO:2)。
此類EGFL8多肽可以自自然界分離，或者可以通過重組和/或合成手段來生成。
“分離的EGFL8”指已經(jīng)自EGFL8來源純化或已經(jīng)通過重組或合成方法制備并純化的EGFL8。純化的EGFL8基本上不含其它多肽或肽?！盎旧喜缓痹诒疚闹兄钙渌鼇碓吹鞍踪|(zhì)的污染少于約5 %，優(yōu)選少于約2 %，更優(yōu)選少于約I %，甚至更優(yōu)選少于約0.5 %，最優(yōu)選少于約0.1%。
術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括任何部分或完全阻斷、抑制、或中和EGFL8的生物學(xué)活性的分子。合適的拮抗劑分子明確包括拮抗性抗體或抗體片段、天然EGFL8多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、EGFL8受體的可溶性片段、反義RNA、核酶、RNA1、有機(jī)小分子、等。用于鑒定EGFL8多肽的拮抗劑的方法可包含使EGFL8多肽接觸候選拮抗性分子，并測(cè)量通常與EGFL8多肽有關(guān)的一項(xiàng)或多項(xiàng)生物學(xué)活性的可檢測(cè)變化。
“有活性的”或“活性”為了本發(fā)明的目的指EGFL8保留EGFL8的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的形式，其中“生物學(xué)”活性指由EGFL8引起的，除誘導(dǎo)針對(duì)EGFL8所擁有的抗原性表位的抗體生成的能力外的生物學(xué)功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免疫學(xué)”活性指誘導(dǎo)針對(duì)EGFL8所擁有的抗原性表位的抗體生成的能力。EGFL8的主要生物學(xué)活性是它促進(jìn)血管形成及支持內(nèi)皮細(xì)胞粘附和遷移的能力。
“EGFL8受體”指EGFL8所結(jié)合的且介導(dǎo)EGFL8的生物學(xué)活性的分子。
術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，而且明確涵蓋人的、非人的(例如鼠的)和人源化的單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性。
“天然抗體”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重⑶鏈構(gòu)成的約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變域(Vh)，接著是多個(gè)恒定域。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變域(')，而另一端是一個(gè)恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)`生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F (ab' )2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。
“Fv”是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。
Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(λ)。
根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類:IgA、IgD, IgE, IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。[0037]“抗體片段”包含全長抗體的一部分，一般是全長抗體的抗原結(jié)合或可變域?？贵w片段的例子包括Fab、Fab1、F(ab' )jPFv片段。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。此外，與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首次由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利N0.4, 816, 567)?！皢慰寺】贵w”也可以使用例如Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)及 Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利N0.4，816，567和Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:6851-6855 (1984))。
非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用來自具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變區(qū)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見 Jones et al., Nature 321:522-525 (1986) ；Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
如本文中所使用的，“處理”或“治療”指用于獲得有益的或期望的臨床結(jié)果的辦法。為了本發(fā)明的目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀減輕、疾病程度減弱、病情穩(wěn)定(即不惡化)、疾病進(jìn)展延遲或減緩、病情改善或減輕、及消退(無論部分的或完全的)，無論可檢測(cè)的或不可檢測(cè)的?！疤幚怼被颉爸委煛边€可指與不接受治療的情況中的預(yù)期存活相比存活延長?！爸委煛敝敢鈭D預(yù)防病癥形成或改變病癥病理而實(shí)施的干預(yù)。因而，“處理”或“治療”指治療性處理和防范性或預(yù)防性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。具體而言，治療可直接預(yù)防、減緩或以其它方式減輕細(xì)胞變性或損傷的病理，諸如癌癥治療中腫瘤細(xì)胞的病理，或者可使得細(xì)胞對(duì)其它治療劑的治療更加敏感。
“長期”施用指 與短期模式相反，以連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活性)維持較長一段時(shí)間。“間歇”施用指不是無間斷連續(xù)進(jìn)行的治療，而是本質(zhì)上周期性的。[0043]“腫瘤”在用于本文時(shí)指所有腫瘤性細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)胞和組織。
術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyor renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、及各種類型的頭和頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL) NHL、中級(jí)/濾泡性NHL、中級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞性NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞性NHL、高級(jí)小無核裂細(xì)胞性NHL、大塊病(bulky disease)NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢疲病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。
“化療劑”指在癌癥治療中有用的化學(xué)化合物。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)控劑(SERM)。
“眼內(nèi)新血管疾病”指以眼部新血管形成為特征的疾病。眼內(nèi)新血管疾病的例子包括但不限于增殖性視網(wǎng)膜病包括增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水腫(DME)、病理性近視、von Hippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、分枝的視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(BRVO)、角膜新血管形 成、視網(wǎng)膜新血管形成、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、結(jié)膜下出血、高血壓性視網(wǎng)膜病、等。
疾病的“病理”包括所有危及患者康樂的現(xiàn)象。例如，這包括但不限于異常的或不可控的細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、對(duì)鄰近細(xì)胞正常機(jī)能的干擾、細(xì)胞因子或其它分泌產(chǎn)物的異常水平釋放、炎性或免疫學(xué)應(yīng)答的抑制或惡化、等。
與一種或多種其它治療劑“聯(lián)合”施用包括同時(shí)(共同)施用和任何次序的序貫施用。
“載體”在用于本文時(shí)包括藥劑學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們?cè)谒捎玫膭┝亢蜐舛葘?duì)暴露于其的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。通常，生理學(xué)可接受的載體是PH緩沖水溶液。生理學(xué)可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合齊U，諸如EDTA ;糖醇,諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子,諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如 TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。
“小分子”在本文中定義為具有約500道爾頓以下的分子量。
用于實(shí)施本發(fā)明的方法[0052]EGFL8
人Egfl8基因編碼進(jìn)化保守的約32kD的分泌蛋白。人(Homo sapiens)氨基酸序列(SEQ ID NO:1)與小鼠(Mus musculus ；SEQ ID NO:2)共享約 80%的同源性。EGFL8 多肽的登錄號(hào)為:NM_030652 (Homo sapiens)，NM_152922 (Musmusculus)。
EGFL8活性的拮抗劑的制備和鑒定
拮抗劑藥物候選物的篩選測(cè)定法設(shè)計(jì)成鑒定結(jié)合或復(fù)合EGFL8多肽，或以其它方式干擾EGFL8與其它細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的化合物。
小分子可具有起EGFL8拮抗劑作用的能力，并因此在治療上有用。此類小分子可包括天然存在的小分子、合成的有機(jī)或無機(jī)化合物和肽。然而，本發(fā)明中的小分子不限于這些形式。小分子的廣大文庫是商品化的，而且用于對(duì)這些分子篩選期望活性的極其多種測(cè)定法是本領(lǐng)域公知的。
在一些實(shí)施方案中，小分子EGFL8拮抗劑是通過它們抑制EGFL8的一種或多種生物學(xué)活性而鑒定的。如此，使候選化合物接觸EGFL8。然后評(píng)估EGFL8的生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中是EGFL8支持內(nèi)皮細(xì)胞粘附和遷移的能力。在EGFL8的生物學(xué)活性受到抑制的情況中，化合物被鑒定為拮抗劑。
鑒定為EGFL8拮抗劑的化合物可以在本發(fā)明的方法中使用。例如，EGFL8拮抗劑可用于治療癌癥。
對(duì)于癌癥，多種公知的動(dòng)物模型可用于進(jìn)一步了解EGFL8在腫瘤形成和發(fā)病機(jī)制中的作用，及測(cè)試候選治療劑(包括天然EGFL8多肽的抗體和其它拮抗劑，諸如小分子拮抗齊U)的功效。此類模型的體內(nèi)性質(zhì)使得它們對(duì)人類患者中的響應(yīng)特別有預(yù)測(cè)性。腫瘤和癌癥(例如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等)的動(dòng)物模型包括非重組的和重組的動(dòng)物二者。非重組動(dòng)物模型包括例如 嚙齒類，例如鼠模型。此類模型可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入同基因小鼠來生成，例如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內(nèi)植入、腎囊下植入、或同位(orthopin)植入，例如將結(jié)腸癌細(xì)胞植入結(jié)腸組織。參見例如1997年9月18日公布的PCT公開號(hào)W097/33551。腫瘤學(xué)研究中最常用的動(dòng)物物種大概是免疫缺陷型小鼠，特別是裸鼠。具有胸腺發(fā)育不全/不發(fā)育的裸鼠可成功充當(dāng)人腫瘤異種移植物宿主的觀察結(jié)果導(dǎo)致其用于該目的的廣泛應(yīng)用。已經(jīng)將常染色體隱性nu基因?qū)肼闶蟮臉O其多種獨(dú)特同基因異系品系，例如 ASW、A/He、AKR、BALB/c、B10.LP、C17、C3H、C57BL、C57、CBA, DBA、DDD, I/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、NZW、P、RII1、和 SJL。另外，在裸鼠以外已經(jīng)培育了極其多種具有遺傳性免疫學(xué)缺陷的其它動(dòng)物并用作腫瘤異種移植物的接受者。更多詳情參見例如 The Nude Mouse in Oncology Research,E.Boven 和 B.Winograd 編(CRC Press,Inc.,1991)。
導(dǎo)入此類動(dòng)物的細(xì)胞可以衍生自已知的腫瘤/癌細(xì)胞系，諸如任何上文所列腫瘤細(xì)胞系及例如B 104-1-1細(xì)胞系(經(jīng)neu原癌基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定NIH-3T3細(xì)胞系)；經(jīng)ras轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞；Caco-2 (ATCC HTB-37);或中等分化的II期人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29 (ATCC HTB-38);或者衍生自腫瘤和癌。可以使用標(biāo)準(zhǔn)條件從接受手術(shù)的患者獲得腫瘤或癌細(xì)胞的樣品，其中涉及在液氮中冷凍和保存。Karmali等，Br.J.Cancer,48:689-696(1983)。
可以通過多種規(guī)程將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物，諸如裸鼠或EGFL8敲除小鼠。小鼠中的表皮下(subcutaneous, s.c.)空間非常適于腫瘤植入?？梢员砥は乱浦矊?shí)心塊、針吸活檢(通過使用套管針)、或細(xì)胞懸浮液形式的腫瘤。對(duì)于實(shí)心塊或套管針植入，將合適大小的腫瘤組織碎片導(dǎo)入表皮下空間。自原發(fā)瘤或穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞系新鮮制備細(xì)胞懸浮液，并表皮下注射。也可以以真皮下(subdermal)植入物的形式注射腫瘤細(xì)胞。在此位置，接種體沉積在真皮結(jié)締組織的下部與表皮下組織之間。
乳腺癌的動(dòng)物模型可以通過例如將大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(neu癌基因最初就是自其分離的)或經(jīng)neu轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞植入裸鼠來生成，基本上如Drebin等，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 83:9129-9133 (1986)所述。
類似的，結(jié)腸癌的動(dòng)物模型可以通過使結(jié)腸癌細(xì)胞在動(dòng)物(例如裸鼠)中傳代而導(dǎo)致腫瘤在這些動(dòng)物中出現(xiàn)來生成。人結(jié)腸癌在裸鼠中的同位移植物模型已有記載，例如 Wang 等，Cancer Research 54:4726-4728(1994)及 Too 等，Cancer Research 55:681-684 (1995)。此模型基于所謂的 “METAMOUSE ” (AntiCancer, Inc.，San Diego,California)。
可以切下在動(dòng)物中生成的腫瘤并在體外培養(yǎng)。然后可以將來自體外培養(yǎng)物的細(xì)胞傳給動(dòng)物。此類腫瘤可充當(dāng)進(jìn)一步測(cè)試或藥物篩選的靶物。或者，可以分離源自傳代的腫瘤，并對(duì)來自傳代前細(xì)胞和一輪或多輪傳代后分離的細(xì)胞的RNA分析感興趣基因的差異表達(dá)。此類傳代技術(shù)可以用任何已知的腫瘤或癌細(xì)胞系來實(shí)施。
例如，Meth A、CMS4、CMS5、CMS21和WEH1-164是BALB/c雌性小鼠的化學(xué)誘導(dǎo)纖維肉瘤(DeLeo等，J.Exp.Med., 146:720 (1977))，其為研究各種藥劑的抗腫瘤活性提供了高度可控制的模型系統(tǒng)。Palladino等，J.1mmunol.，138:4023-4032 (1987)。簡言之，使腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中在體外繁殖。在注射入動(dòng)物前，將細(xì)胞系在緩沖液中清洗和懸浮，細(xì)胞密度為大約IOxlO6到IOxIO7細(xì)胞/ml。然后給動(dòng)物皮下感染10-100 μ I細(xì)胞懸浮液，腫瘤出現(xiàn)需要1-3周。
另外，小鼠Lewis肺癌(其是最徹底研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤之一)可以用作研究用腫瘤模型。在此腫瘤模型中的·功效已經(jīng)與在診斷有小細(xì)胞肺癌(SCCL)的人類患者治療中的有益效果聯(lián)系起來。在注射來自患病小鼠的腫瘤碎片或在培養(yǎng)物中維持的細(xì)胞后，此腫瘤可以導(dǎo)入正常小鼠。Zupi等,Br.J.Cancer, 41:suppl.4, 30 (1980)。有證據(jù)表明，腫瘤可以始自甚至單一細(xì)胞的注射，而且非常高比例的受感染腫瘤細(xì)胞存活。關(guān)于此腫瘤模型的更多信息參見 Zacharski, Haemostasis 16:300-320 (1986)。
評(píng)估測(cè)試化合物在具有所植入腫瘤的動(dòng)物模型中的功效的一種方式是在治療前后測(cè)量腫瘤的大小。傳統(tǒng)上，所植入腫瘤的大小用游標(biāo)卡尺在二維或三維上測(cè)量。限于二維的測(cè)量不能精確反映腫瘤的大小；因此，通常使用數(shù)學(xué)公式將其換算成相應(yīng)的體積。然而，腫瘤大小的測(cè)量是非常不精確的。藥物候選物的治療效果可以更好地通過治療誘導(dǎo)的生長延遲和比生長延遲(specific growth delay)來描述。腫瘤生長描述中的另一項(xiàng)重要變量是腫瘤體積倍增時(shí)間。用于計(jì)算和描述腫瘤生長的計(jì)算機(jī)程序也是可獲得的，諸如Rygaard 和 Spang-Thomsen,Proc.6th Int.Workshop on Tmmune~DeficientAnimals,ffu 和Sheng編，Basel, 1989，p.301所報(bào)告的程序。然而，應(yīng)當(dāng)注意，治療之后的壞死和炎性應(yīng)答實(shí)際上可導(dǎo)致腫瘤大小的增大，至少在最初時(shí)。因此，需要通過形態(tài)測(cè)定方法和流式細(xì)胞術(shù)分析的組合來仔細(xì)監(jiān)測(cè)這些變化。[0068]特異性結(jié)合本文中所鑒定的EGFL8的抗體和其它藥物候選物的功效也可以在自發(fā)性動(dòng)物腫瘤的治療中測(cè)試。適于此類研究的靶物是貓口腔鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。貓口腔SCC是高度侵入性的惡性腫瘤，是最常見的貓口腔惡性腫瘤，占此物種中所報(bào)告的口腔腫瘤的超過60%。它罕見轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處部位，盡管此低轉(zhuǎn)移發(fā)生率可僅僅反映具有此腫瘤的貓的短存活時(shí)間。這些腫瘤通常不適于手術(shù)，主要因?yàn)樨埧谇坏慕馄?。目前，此腫瘤沒有有效的治療方法。在進(jìn)入研究前，每只貓進(jìn)行完整臨床檢查和活檢，并進(jìn)行計(jì)算斷層照相法(CT)掃描。將診斷有舌下口腔鱗狀細(xì)胞腫瘤的貓排除出研究。舌可因?yàn)榇祟惸[瘤而變得癱瘓或麻痹，而且，即使治療殺死了腫瘤，動(dòng)物可能不能自己進(jìn)食了。每只貓?jiān)诟L的一段時(shí)間里重復(fù)治療。在治療期間的每天和每次后續(xù)復(fù)查時(shí)拍攝腫瘤照片。治療后，每只貓進(jìn)行另一次CT掃描。此后每8周評(píng)估CT掃描和胸透照片。對(duì)數(shù)據(jù)評(píng)估存活、應(yīng)答和毒性與對(duì)照組相比的差異。陽性應(yīng)答可要求腫瘤消退的證據(jù)，優(yōu)選有生活質(zhì)量的改善和/或壽命延長。
另外，也可以測(cè)試其它自發(fā)性動(dòng)物腫瘤，諸如犬、貓和狒狒的纖維肉瘤、腺癌、淋巴瘤、軟骨瘤或平滑肌肉瘤。其中，犬和貓中的乳腺腺癌是優(yōu)選的模型，因?yàn)樗耐庥^和表現(xiàn)與人的非常相似。然而，此模型的應(yīng)用受限于此類型腫瘤在動(dòng)物中的罕見發(fā)生。
本領(lǐng)域已知的其它體外和體內(nèi)心血管、內(nèi)皮、和血管發(fā)生測(cè)試在本文中也是合適的。
抗體結(jié)合研究
測(cè)試抗EGFL8抗體抑制EGFL8對(duì)心血管、內(nèi)皮、和血管發(fā)生測(cè)定法中使用的內(nèi)皮細(xì)胞或其它細(xì)胞的影響的能力。例示性的抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性、和異源偶聯(lián)抗體，本文中描述了它們的制備。
抗體結(jié)合研究可以以任何已知的測(cè)定法來進(jìn)行，諸如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法、直接和間接夾心式測(cè)定法、及免疫沉淀測(cè)定法。Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques(CRC Press, Inc.，1987)，pp.147-158。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定 法依靠標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與測(cè)試樣品分析物競(jìng)爭(zhēng)對(duì)有限量的抗體的結(jié)合的能力。測(cè)試樣品中靶蛋白質(zhì)的量與結(jié)合至抗體的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了便于測(cè)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，優(yōu)選在所述競(jìng)爭(zhēng)之前或之后使抗體不溶，從而結(jié)合至抗體的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物可以方便地與保持未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物分開。
夾心式測(cè)定法涉及使用兩種抗體，每一種都能夠結(jié)合要檢測(cè)的蛋白質(zhì)的不同的免疫原性部分，或表位。在夾心式測(cè)定法中，測(cè)試樣品分析物被固定化在固體支持物上的第一抗體結(jié)合，此后第二抗體結(jié)合至所述分析物，從而形成不溶的三部分復(fù)合物。參見例如美國專利N0.4，376，110。第二抗體可以自身用可檢測(cè)模塊標(biāo)記(直接夾心式測(cè)定法)，或可以使用用可檢測(cè)模塊標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體來測(cè)量(間接夾心式測(cè)定法)。例如，一類夾心式測(cè)定法是ELISA測(cè)定法，其中可檢測(cè)模塊是酶。
對(duì)于免疫組織化學(xué)，組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或可以包埋入石蠟并用防腐劑諸如例如福爾馬林固定。
在心血管、內(nèi)皮、和血管發(fā)生病癥的治療中有用的組合物包括但不限于抑制靶基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性的抗體、有機(jī)和無機(jī)小分子、肽、磷酸肽、反義、siRNA和核酶分子、三股螺旋分子等。
潛在拮抗劑的更具體的例子包括結(jié)合EGFL8的寡核苷酸，特別是抗體，包括但不限于多克隆和單克隆抗體及抗體片段，單鏈抗體，抗獨(dú)特型抗體，和嵌合或人源化型式的此類抗體或片段，以及人抗體和抗體片段?；蛘撸瑵撛诘霓卓箘┛梢允敲芮邢嚓P(guān)的蛋白質(zhì)，例如識(shí)別受體但沒有效應(yīng)，由此競(jìng)爭(zhēng)性抑制EGFL8的作用的突變形式EGFL8。
另一種潛在的EGFL8拮抗劑是使用反義技術(shù)制備的反義RNA或DNA構(gòu)建物，其中例如反義RNA或DNA分子通過與靶mRNA雜交并防止蛋白質(zhì)翻譯來起直接阻斷mRNA翻譯的作用。反義技術(shù)可用于通過三股螺旋形成或反義DNA或RNA來控制基因表達(dá)，這兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，可將本文中編碼成熟EGFL8多肽的多核苷酸序列的5'編碼部分用于設(shè)計(jì)長度為約10-40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。將DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)成與基因中參與轉(zhuǎn)錄的區(qū)互補(bǔ)(三股螺旋-參見Lee et al., Nucl.Acids Res.6:3073 (1979) ；Cooney et al., Science 241:456(1988) ；Dervan et al., Science251:1360(1991))，由此防止轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生EGFL8。如本文中提到的，與RNA —部分“互補(bǔ)”的序列指具有足夠互補(bǔ)性，從而能夠與RNA雜交，形成穩(wěn)定雙鏈體的序列；在雙鏈反義核酸的情況中，可如此測(cè)試雙鏈體DNA的單鏈，或者可測(cè)定三股螺旋形成。雜交的能力會(huì)依賴于互補(bǔ)性的程度和反義核酸的長度二者。一般而言，雜交的核酸越長，則仍能與RNA形成穩(wěn)定雙鏈體(或三鏈體，作為可能的情況)的核酸可含有的與RNA的堿基錯(cuò)配越多。通過使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來測(cè)定雜交復(fù)合物的解鏈溫度，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定錯(cuò)配的可容忍程度。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成為EGFL8 (反義Okano, Neurochem.56:560(1991) ；01igodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRCPress:Boca Raton, FL, 1988)。
反義寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合化合物或其衍生物或修飾形式，單鏈的或雙鏈的?？梢栽趬A基模塊、糖模塊、或磷酸酯骨架處修飾寡核苷酸，例如用以改進(jìn)分子的穩(wěn)定性、雜交等。寡核苷酸可以包括其它附加基團(tuán)，諸如肽(例如用于在體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)、或促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)穿越細(xì)胞膜(參見例如Letsinger, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.86:6553-6556 (1989) ；Lemaitre, et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84:648-652(1987) ; PCT公開號(hào)W088/09810，1988年12月15日公布)或血腦屏障(參見例如PCT公開號(hào)W089/10134，1988年4月25日公布)的試劑、雜交觸發(fā)的切割劑(參見例如Krol et al., BioTechniques 6:958-976(1988))或嵌入劑(參見例如 Zon, Pharm.Res.5:539-549 (1988))。為此目的，可以將寡核苷酸偶聯(lián)至另一分子，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、運(yùn)載劑、雜交觸發(fā)的切割劑等。
反義寡核苷酸可包含至少一種經(jīng)過修飾的堿基模塊，其選自包括但不限于下述各項(xiàng)的組:5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β -D-半乳糖基Q核苷、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨甲基尿嘧啶、5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’_甲氧羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、W核苷(wybutoxosine)、假尿卩密卩定、Q核苷(queosine)、2_硫胞卩密卩定、5-甲基~2~硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3) W、和2，6-二氨基嘌呤。
反義寡核苷酸還可包含至少一種經(jīng)過修飾的糖模塊，其選自下組但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖、和己糖。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含至少一種選自下組的經(jīng)過修飾的磷酸酯骨架:硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、亞氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基勝酸酯(methylphosphonate)、經(jīng)基憐酸三酯(alkylphosphotriester)、及其甲縮醒(formacetal)或類似物。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是端基異構(gòu)(anomeric)寡核苷酸。端基異構(gòu)寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與通常的單元不同，鏈彼此平行(Gautier, et al.，Nucl.Acids Res.15:6625-6641 (1987))。所述寡核苷酸是 2’ -O-甲基核糖核苷酸(Inoue，et al.,Nucl.Acids Res.15:6131-6148(1987))或嵌合 RNA-DNA 類似物(Inoue, et al.，F(xiàn)EBS Lett.215:327-330(1987))。
在一些實(shí)施方案中，所述拮抗劑是抑制性雙鏈體RNA，例如siRNA、shRNA等。
本發(fā)明的寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成，例如通過使用自動(dòng)化DNA合成儀(諸如可購自Biosearch, Applied Biosystems等)。例如，可以通過Stein et al.(Nucl.Acids Res.16:3209 (1988))的方法來合成硫代磷酸酯寡核苷酸,可以通過使用受控孔徑玻璃聚合物支持物(Sarin, et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:7448-7451(1988))等來制備甲基膦酸酯寡核苷酸。
上述寡核苷酸還可遞送至細(xì)胞，使得反義RNA或DNA可在體內(nèi)表達(dá)以抑制EGFL8的生成。在使用反義DNA時(shí)，優(yōu)選衍生自靶基因核苷酸序列的翻譯起始位點(diǎn)(例如約-10到+10位置之間)的 寡脫氧核糖核苷酸。
潛在的拮抗劑進(jìn)一步包括結(jié)合EGFL8，由此阻斷其活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或肽樣分子(優(yōu)選可溶性肽)，和合成的非肽基有機(jī)或無機(jī)化合物。
別的潛在的拮抗劑有核酶，它們是能夠催化對(duì)RNA的特異性切割的酶性RNA分子。核酶通過與互補(bǔ)IE RNA發(fā)生序列特異性雜交,隨后進(jìn)行內(nèi)切核酸水解(endonucleolytic)切割來起作用?？赏ㄟ^已知技術(shù)來鑒定潛在RNA靶物內(nèi)的特定核酶切割位點(diǎn)。更多細(xì)節(jié)參見例如 Rossi，Current Biology 4:469-471(1994)及 PCT 公開文本號(hào) WO 97/33551 (1997年9月18日公布)。
雖然在位點(diǎn)特異性識(shí)別序列處切割mRNA的核酶可用于破壞靶基因mRNA，但是優(yōu)選錘頭型核酶。錘頭型核酶在由與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的側(cè)翼序列規(guī)定的位置處切割。唯一的要求是靶mRNA具有兩個(gè)堿基的下述序列:5' -UG-3'。錘頭型核酶的構(gòu)建和生成是本領(lǐng)域公知的，而且更全面地記載于Myers, Molecular Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference, VCH Publishers,New York(1995)(尤其參見圖 4、第 833頁)及 Haseloff 和 Gerlach，Nature, 334:585-591 (1988)，通過述及完整收入本文。
優(yōu)選的是，改造核酶，使得切割識(shí)別位點(diǎn)位于靶基因mRNA的5'末端附近，即用于提高效率及使非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞內(nèi)積累最小化。
本發(fā)明的核酶還包括RNA內(nèi)切核糖核酸酶(下文的“Cech型核酶”)，諸如嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)中天然存在(稱作IVS或L-19 IVS RNA)及廣泛記載于 Thomas Cech 及其合作者(Zaug, et al., Science, 224:574-578 (1984) ;Zaug 和Cech, Science, 231:470-475(1986) ；Zaug, et al., Nature,324:429-433(1986)；已公布的國際專利申請(qǐng)?zhí)?WO 88/04300, University Patents Inc.;Been 和 Cech, Cell,47:207-216 (1986))的。Cech型核酶具有一個(gè)8堿基對(duì)的活性位點(diǎn)，其雜交至靶RNA序列，然后發(fā)生對(duì)靶RNA的切割。本發(fā)明涵蓋那些靶向靶基因中存在的8堿基對(duì)活性位點(diǎn)序列的Cech型核酶。
正如在反義辦法中，核酶可以由經(jīng)過修飾的寡核苷酸(例如為了改進(jìn)穩(wěn)定性、靶向等)構(gòu)成，而且應(yīng)當(dāng)在體內(nèi)投遞至表達(dá)靶基因的細(xì)胞。一種優(yōu)選的投遞方法涉及使用如下的DNA構(gòu)建物，其在強(qiáng)組成型pol III或pol II啟動(dòng)子控制下“編碼”核酶，使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞會(huì)生成足夠數(shù)量的核酶來破壞內(nèi)源靶基因信息并抑制翻譯。因?yàn)榕c反義分子不同，核酶是催化性的，所以實(shí)現(xiàn)功效需要較低的細(xì)胞內(nèi)濃度。
用于抑制轉(zhuǎn)錄的三股螺旋結(jié)構(gòu)中的核酸分子應(yīng)當(dāng)是單鏈的且由脫氧核苷酸組成。設(shè)計(jì)這些寡核苷酸的堿基組成，使得它通過Hoogsteen堿基配對(duì)原則促進(jìn)三股螺旋形成，這通常需要在雙鏈體的一條鏈上有大段嘌呤或嘧啶。更多細(xì)節(jié)參見例如PCT公開號(hào)WO97/33551，見上文。
EGFL8拮抗劑的另一項(xiàng)用途在于預(yù)防腫瘤血管發(fā)生，這涉及腫瘤的血管形成，使其能夠生長和/或轉(zhuǎn)移。此過程依賴于新血管的生長。涉及腫瘤血管發(fā)生的新生物及相關(guān)狀況的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyor renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、及各種類型的頭和頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL) NHL、中級(jí)/濾泡性NHL、中級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞性NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞性NHL、高級(jí)小無核裂細(xì)胞性NHL、大塊病(bulky disease)NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢疲病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。
EGFL8拮抗劑在治療眼內(nèi)新血管疾病中也可以是有用的，包括但不限于增殖性視網(wǎng)膜病包括增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、糖尿病和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病、糖尿病黃斑水腫(DME)、病理性近視、von Hippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、分枝的視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(BRVO)、角膜新血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、結(jié)膜下出血、高血壓性視網(wǎng)膜病、等。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是另一種適應(yīng)證。血管生長和炎癥細(xì)胞經(jīng)由脈管系統(tǒng)的靶向是類風(fēng)濕性和血清陰性形式的關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中的一項(xiàng)重要成分。
見于上文 ，本文所述EGFL8及其拮抗劑(其顯示出改變或影響內(nèi)皮細(xì)胞功能和遷移的)很可能在許多或所有上文所述病癥的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并因此能充當(dāng)治療靶來抑制這些過程或用于這些病癥中的血管血管藥物的靶向。
施用方案、進(jìn)度表、劑暈和配制劑
本文中的EGFL8拮抗劑在藥學(xué)上可用作上文所列各種病癥和疾病的預(yù)防劑和治療劑。
EGFL8拮抗劑的治療用組合物如下制備供貯存，即以凍干劑型或水溶液的形式，將具有適宜純度的期望分子與任選的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol, Α.編，1980)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、芐索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烴基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物);和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。
此類載體的其它例子包括離子交換劑、礬土(氧化鋁)、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質(zhì)諸如人血清清蛋白、緩沖物質(zhì)諸如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、和聚乙二醇。用于表面或局部的或基于凝膠的形式的拮抗劑的載體包括多糖諸如甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚 氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、和木蠟醇。對(duì)于所有施用，適當(dāng)使用常規(guī)貯存(depot)形式。此類形式包括例如微膠囊、納米膠囊、脂質(zhì)體、硬膏齊U、吸入形式、鼻腔噴霧、舌下片劑、和持續(xù)釋放制劑。EGFL8拮抗劑通常在此類媒介中以大約0.lmg/ml到100mg/ml的濃度進(jìn)行配制。
另一種配制劑包括將EGFL8拮抗劑摻入所形成顆粒。此類顆粒可用于調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管發(fā)生。另外，腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移可以用這些顆粒來調(diào)控。
將用于體內(nèi)施用的EGFL8拮抗劑應(yīng)當(dāng)是無菌的。這可容易的通過在凍干和重建之前或之后經(jīng)無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。如果是凍干形式，EGFL8拮抗劑通常聯(lián)合其它成分一起配制，臨使用時(shí)用適當(dāng)?shù)南♂寗┲亟?。EGFL8拮抗劑的液體配制劑的例子是裝在單劑藥瓶中用于皮下注射的無菌、清澈、無色、無防腐處理(unpreserved)的溶液。主要根據(jù)多肽的類型和適應(yīng)癥，適于重復(fù)使用的經(jīng)過防腐處理的藥物組合物可包含例如以下各項(xiàng):
EGFL8 拮抗劑；
能夠?qū)H維持在多肽或其它分子在溶液中的最大穩(wěn)定性的范圍內(nèi)(優(yōu)選約4-8)的緩沖劑；
洗滌劑/表面活性劑，主要用于穩(wěn)定多肽或分子免于攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集；
等滲調(diào)控劑(isotonifier)；
防腐劑，選自酚、苯甲醇和苯乙銨鹵化物，例如氯化物；和水。
如果所采用的洗滌劑是非離子型的，那么它可以是例如聚山梨醇酯(例如P0LYS0RBATEtm(TWEEN )20、80等)或泊洛沙姆(例如POLOXAMER 188)。非離子型表面活性劑的使用容許配制劑暴露于剪切面應(yīng)力而不引起多肽變性。另外，此類含表面活性劑配制劑可用于氣霧劑裝置，諸如肺部給藥和無針頭噴射注射槍(參見例如EP 257，956)中所使用的那些。
可以存在等滲調(diào)控劑以確保EGFL8拮抗劑的液體組合物的等滲性，等滲調(diào)控劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥基的或更高級(jí)的糖醇，諸如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。這些糖醇可以單獨(dú)的或聯(lián)合的使用。或者，可以使用氯化鈉或其它適宜無機(jī)鹽，使得溶液等滲。
緩沖劑可以是例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽緩沖液，取決于期望的pH。本發(fā)明的一種類型的液體配制劑的pH緩沖在大約4-8的范圍內(nèi)，優(yōu)選大致生理pH。
防腐劑，酚、苯甲醇和苯乙銨鹵化物(例如氯化物)是可采用的已知抗微生物劑。
本文中所描述的治療用多肽組合物通常置于具有無菌存取口的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或藥瓶。配制劑優(yōu)選以重復(fù)的靜脈內(nèi)(1.v.)、皮下(s.c.)或肌肉內(nèi)(1.m.)注射，或者作為適于鼻內(nèi)或肺內(nèi)投遞的氣霧劑劑型(關(guān)于肺內(nèi)投遞參見例如EP 257, 956)來施用。
治療性多肽還可以持續(xù)釋放制劑的形式施用。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有蛋白質(zhì)的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)^Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15: 167-277 (1981)和 Langer, Chem.Tech.，12:98-105 (1982)所述，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利N0.3，773，919 ；EP 58，481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸Y乙酯的共聚物(Sidman等,Biopolymers, 22:547-556 (1983))、不可降解的乙烯-乙酸乙烯(Langer等，見上文)、可降解的乳酸_乙醇酸共聚物諸如Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)、及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133，988)。
雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化蛋白質(zhì)在體內(nèi)長時(shí)間維持時(shí)，它們可由于暴露于37°C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？筛鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定化合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過修飾巰基、自酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。
持續(xù)釋放的EGFL8拮抗劑組合物還包括用脂質(zhì)體捕獲(entrap)的拮抗劑。此類脂質(zhì)體通過本身已知的方法來制備:DE 3, 218, 121 ；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82:3688-3692(1985) ；Hwang 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，77:4030-4034 (1980) ；EP52, 322 ；EP 36, 676 ；EP 88, 046 ；EP 143，949 ;EP142, 641 ;日本專利申請(qǐng) 83-118008 ;美國專利N0.4，485，045和4，544，545 '及EP102, 324。任選的是，脂質(zhì)體是小的(大約200-800埃)單層的類型，其中脂質(zhì)含量大于大約30mol.%膽固醇，所選擇的比例根據(jù)最佳療法進(jìn)行調(diào)整。
EGFL8拮抗劑的治療有效劑量當(dāng)然會(huì)取決于某些因素有所變化，諸如待治療(包括預(yù)防)的病理性狀況，施藥的方法，用于治療的化合物的類型，所涉及的任何輔療法或共療法(co-therapy)，患者的年齡、體重、一般醫(yī)學(xué)狀況、醫(yī)學(xué)史等，而且它的確定完全在執(zhí)業(yè)醫(yī)師的技術(shù)范圍內(nèi)。因而，治療學(xué)家有必要根據(jù)獲得最大治療效果的需要而確定劑量和調(diào)整施用路徑。
根據(jù)上述指導(dǎo)方針，有效劑量一般在大約0.001到大約1.0mg/kg、更優(yōu)選大約
0.01-1.0mg/kg、最優(yōu)選大約 0.01-0.lmg/kg 的范圍內(nèi)。
EGFL8拮抗劑施用的路徑依照已知方法，例如通過注射或輸注，經(jīng)由靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、大腦內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面或吸入路徑，或者通過下文所述持續(xù)釋放系統(tǒng)。也適當(dāng)?shù)氖?，EGFL8拮抗劑通過腫瘤內(nèi)、腫瘤周圍、損傷內(nèi)/病灶內(nèi)、或損傷周圍/病灶周圍路徑施 用，以發(fā)揮局部以及全身治療效果。腹膜內(nèi)路徑預(yù)期是特別有用的，例如在卵巢腫瘤的治療中。
如果采用肽或小分子作為拮抗劑，那么它優(yōu)選以液體或固體的形式口服的或非口服的施用給哺乳動(dòng)物。
形成鹽且可用于下文的分子的藥學(xué)可接受鹽的例子包括堿金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽)、銨鹽、有機(jī)堿鹽(例如吡啶鹽、三乙胺鹽)、無機(jī)酸鹽(例如鹽酸、硫酸、硝酸)、和有機(jī)酸鹽(例如乙酸鹽、草酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽)。
組合療法
EGFL8拮抗劑在預(yù)防或治療所討論病癥中的效力可以通過系列施用活性劑或聯(lián)合另一種對(duì)那些目的有效的藥劑(或是在同一組合物中或是作為分開的組合物)施用活性劑來提聞。
例如，用于治療血管發(fā)生相關(guān)狀況諸如癌癥或眼病的EGFL8拮抗劑可以聯(lián)合上文所述細(xì)胞毒劑、化療劑、或抗血管發(fā)生劑。希望與另一種抗血管發(fā)生劑聯(lián)合來使用EGFL8拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，EGFL8拮抗劑與VEGF拮抗劑，例如抗體，例如貝伐單抗(bevacizumab)聯(lián)合使用。在一些實(shí)施方案中，EGFL8拮抗劑與EGFL7拮抗劑聯(lián)合使用。
與EGFL8拮抗劑聯(lián)合施用的治療劑的有效量取決于醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷。完成劑量施用和調(diào)整以實(shí)現(xiàn)對(duì)待治療疾患的最大控制。例如，為了治療高血壓，這些量理想的是考慮了利尿劑或洋地黃的使用，及諸如高血壓或低血壓、腎病損、等狀況。劑量還取決于諸如待使用的治療劑的類型和所治療的特定患者等因素。典型的是，所采用的量與所給予的治療劑在沒有EGFL8時(shí)施用所使用的劑量相同。
EGFL8 抗體
依照本發(fā)明的一些最有希望的藥物候選物是可抑制EGFL8生成和/或降低EGFL8活性的抗體和抗體片段。
多克隆抗體
用于制備多克隆抗體的方法是技術(shù)人員已知的。多克隆抗體可在哺乳動(dòng)物中生成，例如通過一次或多次注射免疫劑和根據(jù)需要的佐劑。通常，免疫劑和/或佐劑將通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射而注射到哺乳動(dòng)物中。免疫劑可包括EGFL8多肽或其融合蛋白。將免疫劑與已知在所免疫哺乳動(dòng)物中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。此類免疫原性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于匙孔i戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑?？刹捎玫淖魟┑睦影ǜナ贤耆魟┖蚆PL-TDM佐劑(單磷?；|(zhì)A或合成的二棒分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多實(shí)驗(yàn)做出選擇。[0131]單克隆抗體
或者，抗EGFL8抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以使用雜交瘤法制備，諸如Kohler和Milstein，Nature 256:495(1975)所記載的。在雜交瘤法中，小鼠、倉鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物通常用免疫劑免疫以引發(fā)生成或能夠生成將特異性結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。
免疫劑將通常包括EGFL8多肽或其融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)，若希望人起源的細(xì)胞，或是使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞，若希望非人哺乳動(dòng)物來源。然后，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,New Your,AcademicPress (1986)，pp.59-103)。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人起源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的永生化細(xì)胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培養(yǎng)基”)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。
優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是那些高效融合、支持選定的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平的表達(dá)抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞系。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，可從例如索爾克研究所細(xì)胞分配中心(Salklnstitute Cell DistributionCenter, San Diege, California, USA)和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection,Manassas,Virginia,USA)獲得。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor, J.1mmunol.133:3001 (1984) ；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker,Inc.，New York(1987)pp.51-63)。
然后可對(duì)雜交瘤細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)EGFL8多肽的單克隆抗體的存在。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由`雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類技術(shù)和測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson和Pollard, Anal.Biochem.107:220(1980)的 Scatchard 分析來測(cè)定。
在鑒定得到期望的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，見上文)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基和RPM1-1640培養(yǎng)基。或者，雜交瘤細(xì)胞可在哺乳動(dòng)物中作為腹水進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。
可通過常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體自培養(yǎng)基或腹水分離或純化。
單克隆抗體還可通過重組DNA技術(shù)來生成，諸如美國專利N0.4，816，567中所述。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞充當(dāng)此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。還可以修飾DNA，例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換同源鼠源序列(美國專利N0.4，816，567 ；Morrison等，見上文)，或者通過共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列?？捎么祟惙敲庖咔虻鞍锥嚯奶娲景l(fā)明抗體的恒定域，或者可用它替代本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體。
抗體可以是單價(jià)抗體。用于制備單價(jià)抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾重鏈的重組表達(dá)。重鏈通常在Fe區(qū)中的任何點(diǎn)截短，從而防止重鏈交聯(lián)?；蛘撸嚓P(guān)半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基替代或者刪除，從而防止交聯(lián)。
體外方法也適于制備單價(jià)抗體。消化抗體以生成其片段，特別是Fab片段，可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
人抗體和人源化抗體
抗EGFL8抗體還可以包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠)抗體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或家兔的CDR殘基替換的抗體。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體還可包含在受體抗體和輸入CDR或框架序列中都沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有CDR對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗體優(yōu)選還會(huì)包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones 等,Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann 等,Nature332:323-329(1988) ；Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596(1992))。
用于人源化非人抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。通常，人源化抗體中引入了一個(gè)或多個(gè)來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，Nature321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332:323-327(1988) ;Verhoeyen 等，Science239:1534-1536(1988)),即用嚙齒類⑶R或⑶R序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因而，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利N0.4，816，567)，其中基本上少于整個(gè)人可變域用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。
人抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來生產(chǎn)，包括噬菌體展示庫(Hoogenboom 和 Winter, J.Mol.Biol.,227:381 (1991) ；Marks 等，J.Mol.Biol.,222:581 (1991)) Xole等和Boerner等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p.77 (1985)及 Boerner 等，J.Tmmunol.,147(1):86-95(1991))。類似地，可以如下生成人抗體，即將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的小鼠。在攻擊后，觀察到人抗體的生成在所有方面與在人中看到的密切相似，包括基因重排、裝配、和抗體全集。這種方法記載于例如美國專利 N0.5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;和 5，661，016,及下列科學(xué)出版物:Marks 等,Bio/Technology, 10:779-783 (1992) ；Lonberg等，Nature, 368:856-859(1994) ；Morrison, Nature, 368:812-813(1994) ；Fishwild 等，Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology,14:826 (1996) ；Lonberg和 Huszar, Intern.Rev.Tmmunol.，13:65-93(1995)。
雙特異性抗體
雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一是針對(duì)EGFL8多肽，結(jié)合特異性之另一是針對(duì)任何其它抗原，優(yōu)選細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞基。
用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello，Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物,其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟來進(jìn)行正確分子的純化。類似的規(guī)程披露于1993年5月13日公布的WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)。
可以將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的重鏈第一恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh等，Methods in Enzymology 121:210(1986)。
異源偶聯(lián)抗體
異源偶聯(lián)抗體由兩種共價(jià)連接的抗體構(gòu)成。此類抗體建議例如用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美 國 專利N0.4，676，980)及用于治療HIV感染(W0 91/00360 ；W092/200373 ；EP 03089)。涵蓋可在體外使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法制備抗體，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可使用二硫鍵交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國專利 N0.4, 676, 980 中所公開的。
免疫偶聯(lián)物
本發(fā)明還關(guān)于包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑諸如化療齊U、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin) A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAP1、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴阜草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酌.霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括212B1、m1、mIn、90Y 和 186Re0
抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6_ 二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(例如親合素)。
免疫脂質(zhì)體
本文中所公開的抗體還可配制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法來制備，諸如參見 Epstein 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:3688(1985) ;Hwang 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:4030 (1980);及美國專利 N0.4，485，045 和 4，544，545。循環(huán)時(shí)間延長的脂質(zhì)體披露于美國專利N0.5，013，556。
可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin等，J.Biol.Chem.257 =286-288(1982)中所述，將本發(fā)明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑(諸如多柔比星(Doxorubicin))?！⒁?Gabizon 等，J.National Cancer Inst.81 (19):1484(1989)。
抗體的藥用組合物
本文所述特異性結(jié)合EGFL8多肽的抗體以及通過上文公開的篩選測(cè)定法鑒定的其它分子，可以藥用組合物的形式施用以治療上文和下文所述各種病癥。
本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的?；蛘?另外，組合物還可包含增強(qiáng)其功能的藥劑，諸如例如細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、化療劑或生長抑制劑。合適的是，此類分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合存在。
活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences,見上文。
用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易地通過使用無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。
可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利N0.3，773，919)、L_谷氨酸和L-谷氨酸、-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT ‘⑧(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達(dá)100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)長時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37°C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過修飾巰基、自酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。_5] 使用抗體的治療方法
涵蓋EGFL8多肽的抗體可用于治療上文所述多種血管發(fā)生相關(guān)狀況。
依照已知方法將本發(fā)明的抗體施用于哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類)，諸如靜脈內(nèi)施用(像推注或持續(xù)一段時(shí)間的連續(xù)輸注)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑。抗體的靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的。
可以將其它治療方案與如上所述本發(fā)明抗體的施用組合。例如，如果抗體用于治療癌癥，那么有待用此類抗體治療的患者還可接受放療?；蛘?另外，可以將化療劑施用于患者?？梢勒罩圃焐痰恼f明書使用此類化療劑的制備和服藥時(shí)間表，或者憑熟練技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)確定。此類化療劑的制備和服藥時(shí)間表還可參見Chemotherapy Service,M.C.Perry編，Williams & Wilkins:Baltimore，MD，1992?；焺┛梢栽诳贵w施用之前或之后，或者可以同時(shí)給予。
如果抗體用于治療癌癥，可能希望還施用針對(duì)其它腫瘤相關(guān)抗原的抗體，諸如結(jié)合ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或VE GF受體中的一種或多種的抗體。這些還包括上文所列藥齊U。而且，合適的是，抗體系列施用，或者聯(lián)合放射治療，無論涉及照射或施用放射性物質(zhì)。或者/另外，兩種或多種結(jié)合本文中所公開的同一抗原或者兩種或多種不同抗原的抗體可以共施用于患者。有時(shí)，還對(duì)患者施用一種或多種細(xì)胞因子可能是有益的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文中的抗體與生長抑制劑共施用。例如，可以首先施用生長抑制劑，接著是本發(fā)明的抗體。然而，也涵蓋同時(shí)施用或首先施用本發(fā)明的抗體。生長抑制劑的合適劑量就是當(dāng)前所用的那些，而且可以由于生長抑制劑與本文抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同)而降低。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在組合療法中攻擊腫瘤的血管形成。將抗EGFL8抗體和另一種抗體(例如抗VEGF)以治療有效劑量施用于攜瘤患者，所述治療有效劑量是通過例如觀察到腫瘤或其轉(zhuǎn)移灶(如果有的話)的壞死而確定的?？梢赃M(jìn)一步施用別的抗腫瘤劑，諸如α-、β-或Y-干擾素、抗HER2抗體、調(diào)蛋白、抗調(diào)蛋白抗體、D-因子、白介素-1 (IL-1)、白介素-2 (IL-2)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、或促進(jìn)腫瘤中微血管凝結(jié)(coagulation)的藥劑(諸如抗蛋白C抗體、抗蛋白S抗體、或C4b結(jié)合蛋白，參見1991年2月21日公布的WO 91/01753)、或者加熱或輻射。
在其它實(shí)施方案中，將FGF或TOGF拮抗劑(諸如抗FGF或抗TOGF中和性抗體)與抗EGFL8抗體一起施用于患者。用抗EGFL8抗體進(jìn)行的治療優(yōu)選可以在傷口愈合或想要新血管形成期間暫停。
為了預(yù)防或治療心血管、內(nèi)皮、和血管發(fā)生病癥，本發(fā)明的抗體的合適劑量取決于所要治療的病癥的類型(如上文所限定的)、疾病的嚴(yán)重程度和病程、施用抗體是出于預(yù)防目的還是治療目的、之前的治療、患者的臨床史和對(duì)抗體的應(yīng)答、以及主治醫(yī)師的判斷。抗體適合于在一次或一系列的治療中施用于患者。
例如，取決于病癥的類型和嚴(yán)重程度，約I μ g/kg-50mg/kg(例如0.l_20mg/kg)抗體是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開的施用或通過連續(xù)輸注。取決予上述因素，典型的日劑量或周劑量可在約1μ g/kg-100mg/kg或更多的范圍內(nèi)。對(duì)于持續(xù)數(shù)天或更長時(shí)間的重復(fù)施用，取決于病情，治療重復(fù)或持續(xù)直至出現(xiàn)病癥癥狀得到期望的抑制為止。然而，可使用其它劑量方案。通過常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法(包括例如放射線照相腫瘤成像)易于監(jiān)測(cè)該治療的進(jìn)展。
提供以下實(shí)施例僅出于例示目的，并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
通過述及將本說明書中引用的所有專利和參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整收入本文。
實(shí)施例
除非另有說明，實(shí)施例中提及的商品化試劑依照制造商的說明書使用。以ATCC 編號(hào)所鑒別的那些細(xì)胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection, Manassas, VA 20108)。
通過述及將本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)收入本文。
實(shí)施例1:Egfl8在脈管系統(tǒng)中表達(dá)
我們實(shí)施了實(shí)驗(yàn)來確定Egf 18的表達(dá)樣式及特別是將它的表達(dá)與Egf 17的表達(dá)比較。用于原位雜交的反義核糖核酸探針如下:
用于 Egf 17:
GTAGGGCTCTGCCGGGACCTGGGTCTTCCCTCTCCTGGAGCTGCAGAGGCCAGAAGTTCAGTGGTGAGGGGTCCAAGGAGAGTCCGGGGAGACCAGGGAGGCTCTGTCCATCCCCTGTCCCTGTCCCTGTGGGAAGCCCCCGGCAGCAGCAAGACGCTGGCTGTTCCACCTGCCCACAAGAACAGCCACCACCAGTACCCAGGGGATGACAAGCGGCCGGACCACAGGCCACAAAAAGAAGAAGGCTACCCCACTTACAGATGCAGACCATGTGGGGCTCCGGAGAACTGCTTGTAGCATGGTTTCTAGTGTTGGCAGCAGATGGTACTACTGAGCATGTCTACAGACCCAGCCGTAGAGTGTGTACTGTGGGGATTTCCGGAGGTTCCATCTCGGAGACCTTTGTGCAGCGTGTATACCAGCCTTACCTCACCACTTGCGACGGACACAGAGCCTGCAGCACCTACCGAACCATCTACCGGACTGCCTATCGCCGTAGCCCTGGGGTGACTCCCGCAAGGCCTCGCTATGCTTGCTGCCCTGGTTGGAAGAGGACCAGTGGGCTCCCTGGGGCTTGTGGAGCAGCAATATGCCAGCCTCCATGTGGGAATGGAGGGAGTTGCATCCGCCCAGGACACTGCCGCTGCCCTGTGGGATGGCAGGGAGATACTTGCCAGACAGATGTTGATGAATGCAGTACAGGAGAGGCCAGTTGTCCCCAGCGCTGTGTCAATACTGTGGGAAGTTACTGGTGCCAGGGATGGGAGGGACAAAGCCCATCTGCAGATGGGACGCGCTGCCTGTCTAAGGAGGGGCCCTCCCCGGTGGCCCCAAACCCCACAGCAGGAGTGGACAGCATGGCGAGAGAGGAGGTGTACAGGCTGCAGGCTCGGGTTGATGTGCTAGAACAGAAACTGCAGTTGGTGCTGGCCCCACTGCACAGCCTGGCCTCTCGGTCCACAGAGCATGGGCTACAAGATCCTGGCAGCCTGCTGGCCCATTCCTTCCAGCAGCTGGACCGAATTGATTCACTGAGTGAGCAGGTGTCCTTCTTGGAGGAACATCTGGGGTCCTGCTCCTGCAAAAAAGATCTGTGATAACCTCTCACCACCCAGGCTGGATAGAGCAGTCATCCCTAGATCCCTTGTAGCCAGAGTTCAGGCGCTGTCTGGTGGTGCCTATGAGCAGAAGGCCCTGCCTCATTGTCCCTCTTTCTTAGGAGGTTCCTAGGACTTGGGCATGGGGAGTGGGGTCTTGTGTGACTCTTCAGTGGGGCTCCCTGTCTAAGTGGTAAGGTGGGGATTGTCTCCATCTTTGTCA TAATAAAGCTGAGACTT(SEQ IDNO:3)[0182]用于Egf 18:
GGAGGATCTTTCAAAGAGAGTTTGGGAGTGTGCTCCAAGCAGACGCTGCTGGTTCCTCTCCGTTACAACGAGTCCTATAGTCAACCGGTGTACAAACCCTACCTGACCTTGTGTGCGGGGAGGCGCATATGTAGCACCTACAGGACCACATACCGTGTGGCCTGGCGGGAGGTGAGGCGGGAGGTACCACAGACACACGTGGTGTGCTGTCAGGGCTGGAAGAAGCCACACCCAGGAGCTCTCACCTGTGATGCCATCTGCTCCAAGCCTTGTCTTAATGGAGGTGTCTGCACTGGACCAGACCGGTGCGAGTGTGCCCCAGGCTGGGGAGGAAAGCATTGCCACGTGGATGTCGATGAATGCAGGGCCAGCCTTACCCTCTGCTCTCATGGCTGCCTCAACACACTGGGCAGCTTCTTGTGCAGCTGTCCACACCCCCTGGTGCTGGGTCTCGATGGACGCACCTGTGCAGGAGGCCCACCGGAGAGTCCAACCAGCGCG(SEQ ID NO:4)。
將小鼠胚胎自子宮解剖出來并在PBS (不含RNA酶)中清洗。將E10.5CD1小鼠胚胎在新鮮制備的含4%低聚甲醛的PBS中于室溫(RT)固定4小時(shí)，用PBT(PBS+0.1 % Tween 20)清洗2x5分鐘，并在冰上經(jīng)由PBT中的25 %、50 %、75 %、2x100 %甲醇來脫水，每次5_10分鐘。將胚胎在甲醇/H202 (4: I)中于RT漂白I小時(shí)，在冰上用100%甲醇清洗2x10分鐘，并在100%甲醇中保持于_20°C，直至準(zhǔn)備好雜交。
將胚胎序貫地在下述培養(yǎng)基中在冰上溫育:含75%、50(%、25(%甲醇的？81'，每次5-10分鐘。將胚胎在冰上在PBT中清洗3x5分鐘，然后在溫和搖動(dòng)中在含20μ g/ml蛋白酶K的PBT中于RT清洗30分鐘，用冷的PBT小心漂洗兩次，在溫和搖動(dòng)中用含0.2%戊二醛+4% PFA的PBS于RT固定20分鐘，在PBT中于RT清洗3x5分鐘。然后將它們?cè)?0%PBT+50%預(yù)雜交混合液(25ml超純?nèi)ルx子甲酰胺；12.5ml 20x SSC(最終5X) ；40μ I 50mg/ml 肝素；500 μ I lOmg/ml 鮭魚精 DNA ; 125 μ I 20mg/ml 酵母 tRNA ；500 μ I 10% Tween 20 ；約2-4ml IM無水檸檬酸，直至pH = 4.5-5 ;不含RNA酶的水至50ml)中溫育5分鐘，然后在預(yù)雜交混合液中溫育5分鐘。除去溶液，然后將它們?cè)趽u動(dòng)中在預(yù)雜交混合液中于68-70°C預(yù)雜交3-6小時(shí)，然后在搖動(dòng)中在下述溶液中于70°C雜交過夜:含50 μ I甲酰胺和I μ g/mldig-核糖核酸探針(在添加至預(yù) 雜交混合液之前將核糖核酸探針于80°C變性5-10分鐘)的2ml預(yù)雜交混合液。
雜交后，將胚胎清洗多次:用預(yù)熱的溶液I (125ml甲酰胺；62.5ml 20xSSC(最終5x) ；2.5ml 10% Tween 20 ;水，至250ml)于68_70°C漂洗兩次；然后在搖動(dòng)中用預(yù)熱的溶液I于68-70°C清洗2x30分鐘；然后在搖動(dòng)中用溶液II (125ml甲酰胺；25ml 20x SSC (最終2X) ；2.5ml 10% Tween 20 ;水，至 250ml)于 68_70°C清洗 3x60 分鐘；在搖動(dòng)中用 TBST (8gNaCl ；0.2g KCl ；2.5ml IM Tris pH7.4 或 7.5 ；IOml 10% Tween 20 ;加水至 I 升)于室溫清洗3x5分鐘；然后在搖動(dòng)中用TBST/10%熱滅活的綿羊(或羔羊)血清于RT清洗60分鐘。然后添加在TBST/1%熱滅活的綿羊血清中1/2000稀釋的綿羊抗Dig抗體(RocheMolecular Diagnostics)并在搖動(dòng)中于4°C溫育過夜。
然后將胚胎在搖動(dòng)中用TBST于RT清洗3x5分鐘，在搖動(dòng)中于RT清洗一整天，每個(gè)小時(shí)更換TBST，然后在搖動(dòng)中在TBST中于4°C清洗過夜。然后將它們?cè)趽u動(dòng)中在新鮮制備的 AP 緩沖液(2ml 5M NaCl.0.2g KC1、2.5ml IMTris ρΗ7.4 或 7.5、IOml 10% Tween
20、水，至100ml)中于RT清洗2x20分鐘。然后通過添加IOml AP緩沖液+200 μ I NBT/BCIP溶液、在金屬箔中包裹管并搖動(dòng)來顯色。用PBT/lmM EDTA清洗3次來終止反應(yīng)，將胚胎在含4% PFA的PBS中于RT后固定20分鐘，用PBT清洗幾次并將胚胎在含80%甘油的PBS+0.1 % NaN3 中保存于 4°C。[0188]我們觀察到雖然Egf 17在多數(shù)顱脈管(包括動(dòng)脈和靜脈)中表達(dá)，但是只有一部分顱動(dòng)脈表達(dá)Egfl8(圖1A和圖1B)。具體而言，Egfl8表現(xiàn)出局限在分級(jí)分枝的動(dòng)脈的某些區(qū)段中。另外，我們使用體內(nèi)小鼠腫瘤模型實(shí)施了相似的實(shí)驗(yàn)并觀察到EgflS在腫瘤中的某些脈管中表達(dá)。
實(shí)施例2:Egfl8敲除小鼠展現(xiàn)血管發(fā)生缺陷
通過用LacZ和新霉素抗性基因替換Egf 18的外顯子2_7制備了一種構(gòu)建物，并使用標(biāo)準(zhǔn)同源重組法用該構(gòu)建物生成EgflS敲除小鼠(見圖2)。所得敲除等位基因只編碼EGFL8的前35個(gè)氨基酸，其中28個(gè)編碼信號(hào)序列。將Egf 18雜合敲除小鼠(Egf 18+/-)與Egfl7+/_ 小鼠(記載于 Schmidt et al.,Development, 134(16):2913-23.(2007))雜交以生成雙重純合小鼠(Egfl7-/-Egfl8-/_)。
我們首先進(jìn)行了全封固片染色以確定Egfl7和/或EgflS中的突變對(duì)視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的影響。我們處死了出生后8天的小鼠(不同基因型的)，解剖出眼球，并將它們用含4% PFA的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4)于4°C固定過夜。然后我們?cè)赑BS中清洗3次，解剖出視網(wǎng)膜，并取出玻璃狀膜脈管(hyaloid vessel)，并將它們放置在48或96孔板中供染色。我們用PBST(PBS+0.5% Triton X100)透化I小時(shí)，并將視網(wǎng)膜與封閉緩沖液(含5%正常山羊血清 +0.5% Triton Χ100+0.01% NaN3 的 PBS) —起于 4°C溫育 2-16 小時(shí)。我們除去封閉緩沖液，然后在旋轉(zhuǎn)器上與第一染料一起于4°C溫育過夜(第一染料是生物素化異凝集素B4，Sigma，產(chǎn)品目錄編號(hào)L2140。異凝集素B4特異性結(jié)合血管內(nèi)皮)。如下制備生物素化異凝集素B4儲(chǔ)備溶液:在0.9% (0.15MNaCl)中溶解至lmg/ml的濃度，將小份保存于_20°C。作為50x使用儲(chǔ)備溶液(工作濃度=20 μ g/ml)。我們于4°C用PBST清洗至少6次，每次I小時(shí)，然后與第二染料(鏈霉親合素Alexa 488 (I: 150)，MolecularProbes) 一起在PBST+10%山羊血清中溫育，將板于4°C旋轉(zhuǎn)過夜。然后我們?cè)谛D(zhuǎn)器上于4°C用PBST清洗至少6次，每次I小時(shí)，然后用含有DAPI的PBS清洗I次。我們將組織固定I次用含4%低聚甲醛的PBS，不超過5分鐘，然后用PBS漂洗至少4次，直至PFA被完全漂洗離開組織(約30分鐘至I 小時(shí))。
我們將每個(gè)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至裝有PBS的小皮氏皿，沿徑向軸自邊緣至半徑的約2/3切4-5個(gè)切口。我們將視網(wǎng)膜放置在玻璃載玻片上，玻璃體側(cè)朝上，盡可能多地除去液體，然后使用一對(duì)鑷子來弄平載玻片上的視網(wǎng)膜。然后我們迅速添加1-2滴FluOTomount-G并將蓋玻片放在樣品上。如果視網(wǎng)膜中有小折痕，那么我們溫和地移動(dòng)蓋玻片直至視網(wǎng)膜完全平整。我們還確保在組織中找不到氣泡。我們使用Zeiss共焦顯微鏡拍照，拍攝連續(xù)光學(xué)圖像以覆蓋每個(gè)視網(wǎng)膜的整個(gè)厚度，然后使用Zeiss軟件自連續(xù)單幀圖像重建3D圖像。
在野生型和Egfl7-/_視網(wǎng)膜(數(shù)據(jù)未顯示)以及Egfl7+/-、Egfl8-/_視網(wǎng)膜(圖3，左邊小圖)中，我們觀察到各垂直萌芽(它們是通過來自NFL脈管的萌芽血管發(fā)生形成的)的正常分布和形態(tài)。然而，在Egfl7-/-、Egfl8/_視網(wǎng)膜(圖3，右邊小圖)中，垂直萌芽聚簇到一起以形成異常大的萌芽。如此，這些結(jié)果指示Egfl7和EgflS —起作用以控制視網(wǎng)膜深層中的萌芽血管發(fā)生。任一基因單獨(dú)的缺失不足以引起血管畸形。
接著，我們?cè)谛∈蠼悄ぱ馨l(fā)生模型(參見例如Kenyon et al., Invest.0phthalmol.Vis.Sc1.37:1625-32(1996))中分析了 Egf 18突變體的表型。整個(gè)規(guī)程中使用無菌技術(shù)。通過腹膜內(nèi)注射2.51^Avertin 來麻醉介于7-10周齡之間的成年小鼠。在全身麻醉之外，還用0.5%丙對(duì)卡因(Allergan, Irvine,CA)局部麻醉眼。在外科示波器下操作，用手術(shù)刀片實(shí)施一中央基質(zhì)內(nèi)線性角膜切開術(shù)，與外直肌插入平行。使用改良的vonGraefe刀，解剖一薄層狀口袋，朝向顳緣。用眼科鑷將含有bFGF(40_50ng/團(tuán)粒)的Hydron團(tuán)粒放置在角膜表面上，位于口袋的基部，并使用鑷子的一條臂將團(tuán)粒推進(jìn)至口袋的顳端，距邊緣脈管1mm。對(duì)眼應(yīng)用抗生素軟膏(0.5%紅霉素；E.Fougera & Co),不僅為了預(yù)防感染，而且還為了降低由不規(guī)則眼表面引起的刺激。在我們的研究中利用小鼠的雙眼。
植入團(tuán)粒后6天，使用稱聯(lián)數(shù)碼照相機(jī)(AxioCam MRc5, Zeiss)的解剖顯微鏡(Stemi 2000-C, Zeiss)對(duì)小鼠眼照相。在安樂死時(shí)，給小鼠灌注IOmlHBSS-肝素，然后灌注IOml FITC-右旋糖苷/5.5mg/ml聚L-賴氨酸溶液。制作摘出的眼的角膜全封固片。在顯微鏡下拍攝攝取熒光素的新脈管的圖像。使用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析(Image-Pix) Plus 6.0,MediaCybernetics)測(cè)量FITCh標(biāo)記的新血管面積以及角膜大小。依照下述公式計(jì)算血管面積的百分比:(新血管面積/角膜大小)xl00。
我們觀察到小鼠中的角膜血管密度EgflS-/-略低于野生型小鼠的一半(圖4)。這些結(jié)果證實(shí)單獨(dú)的EgflS在血管形成中發(fā)揮了作用。
認(rèn)為前述書面說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。然而，根據(jù)上面的描述，在本文所顯示和描述之外，本發(fā)明的多種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，而且在所附權(quán)利要求
的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.EGFL8拮抗劑在制備用于在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理性狀況的受試者中降低或抑制血管發(fā)生的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求
1的用途，其中所述EGFL8拮抗劑是抗EGFL8抗體。
3.權(quán)利要求
1的用途，其中所述病理性狀況是贅生物。
4.權(quán)利要求
3的用途，其中所述贅生物是癌。
5.權(quán)利要求
4的用途，其中所述藥物與化療劑聯(lián)合施用。
6.權(quán)利要求
1的用途，其中所述病理性狀況與眼有關(guān)。
7.權(quán)利要求
6的用途，其中所述病理性狀況是眼內(nèi)新血管疾病。
8.權(quán)利要求
1的用途，其中對(duì)所述受試者施用所述藥物與第二抗血管發(fā)生劑。
9.權(quán)利要求
8的用途，其中所述第二抗血管發(fā)生劑在所述EGFL8拮抗劑的施用之前或之后施用。
10.權(quán)利要求
8的用途，其中所述第二抗血管發(fā)生劑與所述EGFL8拮抗劑同時(shí)施用。
11.權(quán)利要求
8的用途，其中所述第二抗血管發(fā)生劑是EGFL7的拮抗劑或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的拮抗劑。
12.權(quán)利要求
11的用途，其中所述EGFL7拮抗劑是抗EGFL7抗體。
13.權(quán)利要求
11的用途，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
14.權(quán)利要求
13的用途，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
專利摘要
本發(fā)明提供使用EGFL8拮抗劑來抑制血管發(fā)育和治療相關(guān)病癥的方法。
文檔編號(hào)C07K16/22GKCN101970670 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200980108996
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2009年1月14日
發(fā)明者葉偉蘭, 盧漢 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),