專利名稱:人乳頭瘤病毒基因芯片、制備方法、應用及檢測用試劑盒與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片及包含該基因芯片的檢測用試劑盒，尤其是涉及一種檢測人乳頭瘤病毒25種不同型別的基因芯片、制備方法、應用及檢測用試劑盒與應用。
背景技術(shù)：
乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是無包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒， 1949年Straus等首先在電鏡下觀察到病毒顆粒。HPV顆粒呈球形，二十面體對稱，直徑約 45-55nm，基因組全長 7. 8_8kb。
HPV基因組有8個開放閱讀框(ORF)和一個非翻譯調(diào)控區(qū)，包含早期、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)和上游調(diào)控區(qū)(URR) 3個功能區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))由4500bp組成，分別編碼E1-E7等7個早期蛋白參與病毒的DNA復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和細胞轉(zhuǎn)化等功能。晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(L區(qū))分Ll 和L2區(qū)，其功能是編碼病毒的衣殼蛋白。Ll蛋白為病毒的主要衣殼蛋白，L2則為次要成分。 HPV基因組DNA在宮頸癌細胞中大多以整合狀態(tài)存在，E6和E7中大量表達，而E6和E7蛋白能抑制P53和視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白的功能，使宮頸細胞失去抑制癌變的功能，細胞分化失調(diào)，產(chǎn)生突變、發(fā)展為癌前病變，繼而發(fā)生宮頸癌。大多數(shù)HPV感染者都可以自發(fā)清除其感染的HPV，而不會出現(xiàn)任何繼發(fā)病癥，只有持續(xù)性HPV感染才與宮頸病變密切相關(guān)。HPV的分型主要是依據(jù)Ll基因的序列進行，如果其Ll序列與以前發(fā)現(xiàn)的序列差異性大于10%則認為是一種新的型別，2-10%差異的認為是亞型，小于2%差異的可確認為變異株(Molijn A， Kleter B, Quint W, van Doorn LJ. Molecular diagnosisof human papillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol. ,2005,32 Suppll :S43_51.)?；蚪M內(nèi)重組事件很少發(fā)生。目前，已經(jīng)確定的HPV型別大約有100余種，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，大約35種型別可感染泌尿生殖道，約20種與腫瘤相關(guān)。依據(jù)不同型別HPV與腫瘤發(fā)生的危險性高低分為低危險型別和高危險型別HPV，低危險型別HPV包括HPV6、11、42、 43、44等型別，常引起外生殖器濕疣等良性病變，包括宮頸上皮內(nèi)低度病變(CIN I)。高危險型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型別，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CIN II/III)的發(fā)生相關(guān)，尤其是HPV16和18型。HHPV26、53和66型則為可疑 ^IL (MunOZ N, Bosch FX, de SanjoseS, Herrero R, CastellsagueX, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ ；Epidemiologic classificationof human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med.，2003，348(6) :518_27)。
越來越多的證據(jù)表明，人類乳頭瘤病毒感染與人類多種腫瘤特別是宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切有關(guān)，而宮頸癌為女性最常見的癌癥之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。HPV感染與宮頸癌的關(guān)系最初在19世紀70年代提出，此后許多流行病學和分子學研究均毫無疑問
的證實了 HPV與宮頸癌的病因?qū)W聯(lián)系。Manos等(:Mufioz N, Bosch FX, de SanjoseS, et
al :The causal linkbetween human papillomavirus and invasive cervical cancer apopulation-based case-control study in Colombia and Spain. Int J Cancer. 1992Nov 11 ；52(5) :743-9)通過收集來自22個國家的宮頸癌活檢標本作PCR檢測，發(fā)現(xiàn)99. 7%的宮頸癌中都可以檢測到HPV DNA,而且各國間無顯著差異。這是迄今為止所報道人類腫瘤致病因素中的最高檢出百分數(shù)，同時表明HPV感染與宮頸癌的相關(guān)具有普遍意義。此外，在細胞學和分子生物學方面也獲得了人乳頭狀瘤病毒致癌的有力證據(jù)。1995年WHO和IARC已將 HPV確定為是宮頸癌的病因
世界衛(wèi)生組織(WHO)指出全球每年有25萬婦女因罹患宮頸癌死亡，目前全球共有 4. 4億HPV感染者。美國疾病預防與控制中心2007年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2000萬15歲-49 歲的美國人正遭受HPV的感染，約占美國總?cè)丝诘?5%。在我國，每年宮頸癌的新發(fā)病例數(shù)超過13萬，死于宮頸癌的人數(shù)約有2萬人。
對乳頭瘤病毒感染的診斷應引起足夠的重視。由于HPV不能在體外培養(yǎng)，加之血清學試驗又不能區(qū)別近期和遠期感染且受其準確性的限制，因此，HPV感染的診斷完全依賴于臨床標本中HPV-DNA的檢測。
1.免疫組織化學法
取少量病變組織制涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。該法特異性、靈敏性均較差，操作比較繁瑣，僅能提供有限的病毒感染信息，所以開展的醫(yī)院也較少。
2.原位雜交或Southern印跡雜交或斑點雜交法
宮頸刮片或活檢標本的HPV可通過原位雜交來檢測，該法或與其它標志物一起能對感染樣品中的HPV進行單獨或共同定位，但HPV分型鑒定仍需不同型特異性探針進行多次的原位雜交分析。另外一種方法就是把HPV-DNA從臨床標本中直接分離出來，通過 Southern印跡或斑點雜交進行檢測。然而該法不能達到臨床所需的靈敏度，且操作繁瑣，費時耗力，不適合于大通量臨床樣品的篩查，目前較少使用。
3. HPV-DNA直接捕捉法
如Hybrid Capture Systems (HC，DigeneCorp.，USA)它是利用一種非同位素信號放大系統(tǒng)并基于HPV-DNA雜交到溶液中標記的RNA探針的方法。結(jié)合后的DNA-RNA雜交體被微孔板所捕獲并被隨后所加的特異性單克隆抗體和化學發(fā)光底物所檢測。該法可對 HPV-DNA進行定量分析。此系統(tǒng)應用兩組不同的混合探針(即所謂的雞尾酒探針)，一組含有 HPV26、11、42、43 和 44 型 5 種 LR 探針，而另一組則含有 HPV16、18、31、33、35、39、45、55、 56、58、59和68型13種HR探針。HC為目前唯一以商品形式提供的且有足夠的科學證據(jù)支持其應用于臨床的檢測系統(tǒng)。但HC的檢測下限約為5000個基因組HPV-DNA，且只能進行分組鑒定而不能進行個體基因分型，兩組混合探針間存在的交叉反應也影響其檢測的準確性。由于HPV感染的狀態(tài)要求對特定基因型HPV進行鑒定，故該法不能用于諸如型特異性疫苗或型特異性藥物的研究和療效觀察。
4.實時 PCR(real-timePCR)
實時PCR用于HPV-DNA的定量檢測，即型特異PCR引物與型特異的熒光標記探針相結(jié)合用于實時監(jiān)測。PCR產(chǎn)物可通過通用的熒光染料如SYBRGreen進行檢測，但其特異性不高且易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。因為序列的異質(zhì)性，單個熒光探針無法檢出廣譜PCR擴增產(chǎn)物中不同的HPV基因型而需要一組探針；加之這些探針各自都有不同的特性，故對它們不易進行標準化?；谕瑯拥脑?，通過實時PCR對HPV-DNA進行定量也只局限于個別HPV的檢測。
5.共有或通用引物PCR
基于應用共有或通用的PCR引物來擴增廣譜基因型HPV-DNA。PCR引物常設(shè)計在不同基因型HPV最保守的Ll區(qū)，有的也設(shè)計在El區(qū)，常用的通用引物有CPI/II、MY09/11、 GP5+/GP6+、SPFlO 等(Hildesheim A, Schiffman MH, Gravitt PE, Glass AG, Greer CE, Zhang Τ, Scott DR, Rush BB, Lawler P, Sherman ME. Persistence of type-specific human papillomavirusinfection among cytologically normal women. J Infect Dis 1994 ；169 235-40 Jacobs MV,Snijders PJ, van den Brule AJ, Helmerhorst TJ, Meijer CJ, Walboomers JM. A general primer GP5+/GP6(+)-mediated PCRenzyme immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and 6low-risk human papillomavirus genotypes in cervical scrapings. J ClinMicrobiol 1997 ；35 :791_5 ；Kleter B, van Doorn LJ,ter Schegget J,SchrauwenL,van Krimpen K,Burger M,ter Harmsel B,Quint W. Novel short-fragmentPCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital humanpapillomaviruses. Am J Pathol. 1998 Dec ；153 (6) 1731-9) 計在 Ll 區(qū)，見圖 l(Molijn A, Kleter B, Quint W, van Doom LJ. Molecular diagnosis of humanpapillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol. , 2005, 32 Suppl 1:S43_51)。通用引物檢測可提供的信息較少，只能提供HPV存在的信息。其核酸序列測定后直接進行核酸序列分析是檢測產(chǎn)物特異性的最可靠方法，這種方法在確定目前尚未知道的型別感染以及突變研究時尤其有用，但該技術(shù)不適用于混合感染的臨床樣品，作為體外診斷方法應用有限。
6. PCR-RFLP 法
該方法用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，從而產(chǎn)生大小不同的DNA片段，再通過凝膠電泳分離這些片段，根據(jù)電泳的帶型與標準株比較區(qū)別不同的HPV基因型。該法操作繁瑣且需要適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，不適于對混合感染的臨床標本分析，同時也不易檢出含拷貝數(shù)少的某些基因型。
7.基因芯片及其相關(guān)方法
目前，用于檢測HPV的診斷技術(shù)有的耗時長，有的費用高，不利于進行多種型別的同時檢測，因此難以達到快速、準確、高通量的目的。目前發(fā)展起來的芯片技術(shù)可以彌補以上方法的不足。采用基因芯片法或與之相關(guān)的技術(shù)對乳頭瘤病毒的檢測也是芯片技術(shù)運用研究的熱點?；蛐酒纸蠨NA芯片、DNA微陣列(DNA microarray)，是在面積不大的基片表面上以點陣的方式有序排列一系列固定于一定位置的可尋址的識別分子(DNA或RNA片段)，并以此作為探針，在一定條件下與樣品中待測的靶基因片段進行結(jié)合或反應，反應結(jié)果用同位素法、化學發(fā)光法或酶標法顯示，然后用精密的掃描儀或CCD攝影技術(shù)記錄，通過計算機軟件分析，綜合成可讀信息，最終實現(xiàn)對靶基因的存在、含量及變異等信息的快速檢測。檢測芯片集集約化、微型化、自動化于一體，擁有簡單、快速、準確、靈敏、高通量的特點。
在國外，Gravitt等(Gravitt PE, Peyton CL, Apple RJ, Wheeler CM. Genotyping of 27 human papillomavirus types by using Ll consensus PCRproducts by a single-hybridization, reverse line blot detection method. J ClinMicrobiol. 1998 Oct ；36 (10) 3020-7)采用反向雜交技術(shù)結(jié)合改良的PGMYprimers通用引物檢測27型HPV ；Kim 等(Kim KH, Yoon MS, Na YJ, etal !Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirusgenotyping DNA chip.Gynecol Oncol.2006 Jan ； 100 (1) :38-43)研制Ll和E6/E7擴增的芯片方法其檢測型別可達42種Jacobs等 (Jacobs MV, SnijdersPJ, van den Brule AJ, Helmerhorst TJ, Meijer CJ, Walboomers JM. A generalprimer GP5+/GP6(+)-mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapiddetection of 14 high-risk and 6 low-risk human papillomavirus genotypes incervical scrapings. J Clin Microbiol. 1997 Mar ；35 (3) :791_5)運用 GP5+/6+擴增產(chǎn)物進行檢測的可區(qū)分20種常見的HPV ；Han等(Han J，Swan DC, SmithSJ, Lum SH, Sefers SE, Unger ER, Tang Yff. Simultaneous amplification andidentification of 25 human papillomavirus types with Templex technology. JClin Microbiol. 2006 Nov ；44(11) 4157-62)運用Templex Technology技術(shù)——一種新的液相芯片技術(shù)檢測可檢測25種 HPV ;Wallace 等(Wallace J,Woda ΒΑ,Pihan G. Facile,comprehensive,high-throughput genotyping ofhuman genital papillomaviruses using spectrally addressable liquid beadmicroarrays. J Mol Diagn. 2005 Feb ；7(1) :72_80)將液相芯片與 PGMY primers 技術(shù)相結(jié)合，其檢測的HPV可達45種。
在國內(nèi)，已有HPV分型芯片的相關(guān)專利的申請，如劉玉玲(公開號CN1544654，
公開日2004. 11. 10)檢測 HPV6、11、16、31、33、35、45、39、51、52、56、58、32、34、13、40、41、 42、44、53、54、55、74、66和69共25個型別，但高危型18. 59. 73. 82未檢測。亞能生物技術(shù) (深圳)有限公司的人乳頭瘤病毒分型基因芯片檢測系統(tǒng)(公開號CN1690223，
公開日2005. 11. 02)共檢測 6、11、31、33、35、16、18、42、45、39、51、52、53、56、58、59、66 和 68 共 18 個型別，凱普生物公司可檢測21型HPV的試劑盒的試劑盒更是得到了 SFDA的認證。所以， 目前HPV的檢測是芯片技術(shù)運用于臨床的研究熱點之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測人乳頭瘤病毒25種不同型別的新型基因芯片，以彌補傳統(tǒng)HPV分型檢測技術(shù)存在的費時、耗力、分型能力差的缺陷，擴展病原體檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強度，縮短檢測周期。
本發(fā)明所述的人乳頭瘤病毒基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種
1)從人乳頭瘤病毒(HPV)的Ll基因中所選取的DNA片段；
2)從人類(Homo sapiens)的 β 珠蛋白((beta globin protein)基因(簡稱BGP 基因)中選取的DNA片段；
3) 1)或2)中選取的DNA片段的互補DNA片段。
上述寡聚核苷酸探針優(yōu)選為具有SEQ ID NO 1_SEQ ID NO :37所示核苷酸序列，或 SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :37的核苷酸序列的互補序列，具體的優(yōu)選序列及功能如下所示
SEQ ID 探針編序列(5' -3')
NO 1 NO 1 CTACAGACGTKCGATTTCCACTACCC 用于檢測 HPV-6 型；
NO 2 NO 2 TTAACATATATACTACTCCCTACAG 用于檢測 HPV-6 型；
NO 3 NO 3 TATTACCCCCTTTTACCAACAGGT 用于檢測 HPV-11 型；[0033]NO 4 NO :4 GTACATAAATACTACTAGCTACAGA 用于檢測 HPV-11 型；
NO 5 NO :5 TGTATAAATCGTCTGGTACATTTTC 用于檢測 HPV-16 型；
NO 6 NO 6 GGCTAAATTTGCAGTAGRCCCAGAG 用于檢測 HPV-16 型；
NO 7 NO 7 ATAAGGATTGAGGCACAGTGTCACC 用于檢測 HPV-18 型；
NO 8 NO 8 GCTGCCAGGTGAAGCACGCATACCT 用于檢測 HPV-18 型；
NO 9 NO 9 CAGTAGGGACCGATTCACCAACCGT 用于檢測 HPV-31 型；
NO 10 NO 10 AGTATGTACTGTTAGCTAAAGTAGC 用于檢測 HPV-31 型；
NO 11 NO 11 ATCGGGAACAGCCTCTCCTAATGTA 用于檢測 HPV-33 型；
NO 12 NO 12 TGAATAGAGGCAGTAGTTCCTGAAC 用于檢測 HPV-33 型；
NO 13 NO 13 CGGAAGGCACAACGTCGCCAGTT 用于檢測 HPV-43 型；
NO 14 NO 14 CAATTTTGGACCTGGTATTAGAGCC 用于檢測 HPV-43 型；
NO 15 NO 15 AGTACTAGGCAATGTGCCAGTGGTA 用于檢測 HPV-35 型；
NO 16 NO 16 ACAAAGTGGTGGGTATAGCATCCCC 用于檢測 HPV-26 型；
NO 17 NO 17 GCATTATTAGCAGCCTTGGTATACA 用于檢測 HPV-42 型；
NO 18 NO 18 ATAGGTCCGTAGGTACTGTGTCACC 用于檢測 HPV-45 型；
NO 19 NO 19 CAGGGGTTTCACGCATATTAGCGCT 用于檢測 HPV-45 型；
NO 20 NO 20 TATAATAATCGTTAGGAATGTCTTC 用于檢測 HPV-51 型；
NO 21 NO 21 CTACTAGGAGTTTCACGAATGTCAG 用于檢測 HPV-68 型；
NO 22 NO 22 ATACATGTCAGTGGGAATAGTGTCC 用于檢測 HPV-68 型；
NO 23 NO 23 TAAGTCATTAGGTATTTCCTCACCA 用于檢測 HPV-53 型；
NO 24 NO 24 ACTGTCARGGTTACCTGAGGATTTC 用于檢測 HPV-54 型；
NO 25 NO 25 AACTGTACTTTTAGTAGCACCTTTA 用于檢測 HPV-55 型；
NO 26 NO 26 AAATGCACTACTTTGGATAACTGCA 用于檢測 HPV-58 型；
NO 27 NO 27 GATTCAGGAAGTTGATCACCCATAG 用于檢測 HPV-59 型；
NO 28 NO 28 TGTAACTGCCCGGCATTTGTCTGTC 用于檢測 HPV-62 型；
NO 29 NO 29 CAGAACTACCGGTGTTTGCACGT 用于檢測 HPV-39 型；
NO 30 NO 30 TATACAATTGGGCAGGAATGGCGTC 用于檢測 HPV-39 型；
NO 31 NO 31 TCCAATACAAATCTGTAGGAATGGC 用于檢測 HPV-66 型；
NO 32 NO 32 GCATTGGCAAGTGTACCACGTGTAG 用于檢測 HPV-74 型；
NO 33 NO 33 TGCCTGCAGCACCCTTCATATATA 用于檢測 HPV-81 型；
NO 34 NO 34 ATAAGCCTTGTCTGGAATGGCATCA 用于檢測 HPV-82 型；
NO 35 NO 35 GCAGGTATTGTTTCCCCAACTTTAC 用于檢測 HPV-56 型；
NO 36 NO 36 ATATAACTCTGCAGGTATTGTTTC 用于檢測 HPV-56 型；
NO 37 NO 37 CTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGA 用于檢測 BGP 基因，為陽性對照；
NO: 38 NO :38 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 用于檢測芯片雜交 特異性，負對照探針；
NO 39 NO 39
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_Cy_3 熒光探針，用于探針點的定 位。[0070]其中的M表示A或C ;R表示A或G ;W表示A或T。50% DMSO為空白陣。
本發(fā)明所述的人乳頭瘤病毒基因芯片，還包括陽性對照探針、陰性對照探針、熒光探針中的至少一種。其中上述的陽性對照探針優(yōu)選具有SEQID NO :37所示的核苷酸序列， 當檢測樣品時，結(jié)果陽性說明檢測體系工作正常，結(jié)果陰性則可能為檢測體系中有PCR抑制物或臨床樣品取樣量較少；陰性對照探針優(yōu)選具有SEQ ID NO :38所示的核苷酸序列；熒光探針優(yōu)選具有SEQ ID NO :39所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供上述的人乳頭瘤病毒基因芯片的制備方法，其主要包括以下步驟
1)獲取人乳頭瘤病毒的Ll基因或人類的β珠蛋白基因的序列；
2)根據(jù)步驟1)獲得的人乳頭瘤病毒的Ll基因或人類的β珠蛋白基因的序列設(shè)計寡聚核苷酸探針；
3)合成步驟2)中設(shè)計的寡聚核苷酸探針；
4)篩選步驟3)中合成的寡聚核苷酸探針；
5)制備陽性對照探針、陰性對照探針或熒光探針；
6)將步驟4)中篩選的寡聚核苷酸探針和步驟5)中制備的陽性對照探針、陰性對照探針或熒光探針固定到固相載體上，制得人乳頭瘤病毒基因芯片。
其中，步驟2)中包括將步驟1)獲取的Ll基因序列導入Glustal X軟件中，選取一條代表序列在公共數(shù)據(jù)NCBI中作blastn比對，以確定特異靶點的位置，其中使用Glustal X 軟件時參數(shù)設(shè)定如下-n 20 ；-1 30 ；-L40 ；-D 3000 ；_t 79 ；-T 90 ；-s 65°C ；-χ 65°C ；-N 2；-ρ 33，-P 65 ；-m GGGGGCCCCC TTTTT AAAAA ；-g 15 ；
步驟3)中合成步驟2)中設(shè)計的寡聚核苷酸探針所應用的引物包括用于擴增人乳頭瘤病毒基因的SEQ ID NO :40-SEQ ID NO :41所示核苷酸序列的表示引物和/或用于擴增 β珠蛋白基因的SEQ ID NO :42-SEQ IDNO :43所示核苷酸序列表示的引物的至少一種。各條引物探針的寡核苷酸序列由5’端至3’端組成，其對應擴增作用是
Pl AYHTGYAAATATCCWGAYTA 用于擴增 HPV Ll 基因的上游引物(SEQ ID NO 40)；
P2 TGYARCCAATADGGYTTRTT 用于擴增 HPV Ll 基因的下游引物(SEQ ID NO 41)；
P3 ACACAACTGTGTTCACTAGC 用于擴增 BGP 的上游引物(SEQID NO 42)；
P4 CATCAGGAGTGGACAGATCC 用于擴增 BGP 的下游引物(SEQID NO 43)
其中的B表示C或G或T ;R表示A或G ;S表示C或G ;W表示A或T ;Y表示C或 Τ。
步驟6)中制得的基因芯片包括點樣區(qū)和標簽區(qū)域，其中點樣區(qū)內(nèi)規(guī)則分布有點陣區(qū)。
本發(fā)明的另一目的是提供上述的上述的人乳頭瘤病毒基因芯片的應用，其可用于檢測人乳頭瘤病毒，所述的人乳頭瘤病毒包括6、11、42、43、54、81、16、18、31、33、35、39、45、 51、56、58、59、68、82、26、53、62、66、74 型中的至少一種。
上述的人乳頭瘤病毒基因芯片還可以用于制備檢測用試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測用試劑盒，其包括上述的人乳頭瘤病毒基因芯片。
本發(fā)明提供的檢測用試劑盒，還包括從待測樣品中用于擴增人乳頭瘤病毒基因的SEQ ID NO :40-SEQ ID NO :41所示核苷酸序列表示的PCR引物，或用于擴增β珠蛋白基因的SEQ ID NO :42-SEQ ID NO :43所示核苷酸序列表示的引物。本發(fā)明提供的檢測用試劑盒，還可以包括下列試劑中的至少一種 從待檢樣品中提取DNA的樣品處理試劑；
PCR擴增試劑；
雜交試劑；
顯色試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供上述的檢測用試劑盒的應用，其可用于檢測人乳頭瘤病毒。所述的人乳頭瘤病毒包括6、11、42、43、54、81、16、18、31、33、35、39、45、51、56、58、59、 68、82、26、53、62、66、74 型中的至少一種。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述技術(shù)方案的有益效果在于
現(xiàn)有芯片技術(shù)研究所設(shè)計的引物和探針基本都位于Ll基因末端(Molijn A， Kleter B, Quint W, van Doorn LJ. Molecular diagnosis of humanpapillomavirus(HPV) infections. J Clin Virol. ,2005,32 Suppl 1 :S43_51)，本發(fā)明將在 Ll 基因新位置 (837-1096bp之間)設(shè)計特異探針和引物。引物的擴增產(chǎn)物長度為260bp，遠小于目前常用芯片檢測引物MY09/11的擴增產(chǎn)物(450bp)，保證了擴增的敏感性，尤其適用于經(jīng)液體石蠟或福爾馬林浸泡病理樣品，此類樣品中HPV DNA序列易遭破壞，從而大大提高了樣品制備的效率。同時較小的擴增產(chǎn)物在芯片雜交過程中由于空間位阻較小，雜交效率更高。經(jīng)序列分析該簡并引物可以擴增目前已知的絕大多數(shù)生殖道易感HPV。在相對較為保守的兩引物間為一長度約150bp的高變區(qū)，比較適合設(shè)計特異性探針。隨著克隆HPV型別的增加和增加相應特異探針的設(shè)計，其檢測范圍還可以進一步擴大。
該芯片可特異地檢測25型HPV，包括低危型6、11、42、43、54和81共6型；高危型:16、18、31、33、35、39、45、51、56、58、59、68 和 82 共 13 型；其他 26、53、62、66 和 74 共 6
型。該檢測方法大約需8小時。在一張片基上可同時檢測6個樣品，減少了成本，實現(xiàn)高通量，同時檢測多個樣品的目的，特別適合于檢測那些多重感染的樣品。
由上述的技術(shù)方案可見，本發(fā)明將芯片技術(shù)引入到HPV的分型檢測中，建立了一種快速、靈敏、高通量、準確性高、重復性強的全新的HPV分型檢測基因芯片及其檢測方法， 利用本發(fā)明的基因芯片可以達到對25種不同的HPV型別進行檢測的目的，且操作簡便，準確性高，能一次完成多種型別的檢測，重復性強。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下面特舉較佳實施例，并配合
，作詳細說明如下。


圖IHPV的基因組結(jié)構(gòu)及通用引物的設(shè)計(MufiOZ N, Bosch FX, deSanjoseS, et al :The causal link between human papillomavirus and invasivecervical cancer -.a population-based case-control study in Colombia and Spain. Int J Cancer. 1992 Nov 11；52 (5) 743-9)；
圖2為本發(fā)明的基因芯片結(jié)構(gòu)外形示意圖；
圖3為本發(fā)明芯片的單一點陣結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4為二重PCR對臨床樣品的擴增。各個泳道分別為1，F(xiàn)160(陽性)；2，F(xiàn)159(陰性)；3，F(xiàn)158(陰性)；4，F(xiàn)157(陽性)；5，F(xiàn)156(陽性)；6，F(xiàn)155(陰性)；7，F(xiàn)154(陰性)； 8，F(xiàn)153(陰性)；M, DL2000 ；
圖5為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV-6型的一個實施例的雜交結(jié)果示意圖；
圖6為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV-Il型的一個實施例的雜交結(jié)果示意圖；
圖7為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV-16型的雜交結(jié)果示意圖；
圖8為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV-18型的雜交結(jié)果示意圖；
圖9為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV-26型的雜交結(jié)果示意圖；
圖10為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--31型的雜交結(jié)果示意圖；[0110]圖11為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--33型的雜交結(jié)果示意圖；[0111]圖12為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--35型的雜交結(jié)果示意圖；[0112]圖13為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--42型的雜交結(jié)果示意圖；[0113]圖14為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--43型的雜交結(jié)果示意圖；[0114]圖15為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--45型的雜交結(jié)果示意圖；[0115]圖16為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--53型的雜交結(jié)果示意圖；[0116]圖17為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--54型的雜交結(jié)果示意圖；[0117]圖18為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--55型的雜交結(jié)果示意圖；[0118]圖19為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--56型的雜交結(jié)果示意圖；[0119]圖20為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--58型的雜交結(jié)果示意圖；[0120]圖21為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--59型的雜交結(jié)果示意圖；[0121]圖22為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--62型的雜交結(jié)果示意圖；[0122]圖23為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--66型的雜交結(jié)果示意圖；[0123]圖24為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--68型的雜交結(jié)果示意圖；[0124]圖25為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--39型的雜交結(jié)果示意圖；[0125]圖26為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--56型的雜交結(jié)果示意圖；[0126]圖27為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--74型的雜交結(jié)果示意圖；[0127]圖28為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--81型的雜交結(jié)果示意圖；[0128]圖29為利用本發(fā)明的基因芯片檢測HPV--82型的雜交結(jié)果示意圖；[0129]圖30A-圖30D為臨床樣品F44和臨床樣品C27的HPV測序和芯片檢測結(jié)果，圖
30A，F(xiàn)44測序結(jié)果；圖30B, F44芯片檢測結(jié)果；圖30C, C27測序結(jié)果；圖30D, C27芯片檢測結(jié)果。
具體實施方式
實施例一探針的設(shè)計和制備
1.序列獲得
(I)HPV:從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到HPV全部Ll基因序列及其近緣菌的全部 Ll基因序列。
(2)人BGP基因中序列的獲得方法與(1)相同。
2.探針設(shè)計舉例
(I)HPV探針將HPV各型別的Ll基因序列導入Glustal X軟件中，選取一條代表序列在公共數(shù)據(jù)NCBI中作blastn比對，確定可否作為特異靶點以及特異靶點的位置。將序列導入 01igoArray2. 0 軟件中。參數(shù)設(shè)定如下_n 20 ；-1 30 ；-L 40 ；-D 3000 ；_t 79 ；-T 90 ；-S 65 0C ；-χ 65 0C ；-N 2 ；-ρ 33，-P 65 ；_m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA ；-g 15。運行程序在線設(shè)計探針。
3.探針合成將下表1中的探針序列的5’端延長16T并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備用。
4.探針篩選將合成好的探針溶解并適量稀釋后用基因芯片點樣儀點在玻璃片基上制成基因芯片，通過1^￥-6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、42、43、45、51、53、54、55、 56、58、59、61、62、66、67、68、74、81、82、87和91共30型HPV，多次雜交實驗進行探針篩選， 最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異的探針，得到的優(yōu)選的探針如表1所示
表1 本發(fā)明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測出的病原體
權(quán)利要求
1.一種人乳頭瘤病毒基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于該寡聚核苷酸探針為SEQ ID NO=I-SEQID NO :36所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的人乳頭瘤病毒基因芯片，其特征在于還包括陽性對照探針、 陰性對照探針和熒光探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的人乳頭瘤病毒基因芯片，其特征在于所述的陽性對照探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :37所示；所述的陰性對照探針的核苷酸序列如SEQ ID N0:38所示；所述的熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 39所示。
4.權(quán)利要求
1-3任一項所述的人乳頭瘤病毒基因芯片的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)獲取人乳頭瘤病毒的Ll基因或人類的β珠蛋白基因的序列；2)根據(jù)步驟1)獲得的序列設(shè)計寡聚核苷酸探針； 3)合成步驟2)中設(shè)計的寡聚核苷酸探針；4)篩選步驟3)中合成的寡聚核苷酸探針，篩選到的探針序列如SEQIDNO=I-SEQ ID NO :36所示；5)制備陽性對照探針、陰性對照探針和熒光探針；6)將步驟4)中篩選的寡聚核苷酸探針和步驟5)中制備的陽性對照探針、陰性對照探針和熒光探針固定到固相載體上，制得人乳頭瘤病毒基因芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的人乳頭瘤病毒基因芯片的制備方法，其特征在于步驟2)中包括將步驟1)中獲取的Ll基因序列導入Glustal X軟件中，選取一條代表序列在公共數(shù)據(jù) NCBI中作blastn比對，以確定特異靶點的位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的人乳頭瘤病毒基因芯片的制備方法，其特征在于使用 Glustal X 軟件時參數(shù)設(shè)定如下-n 20 ；-1 30 ；-L 40 ；-D 3000 ；-t 79 ；-T 90 ；-s 65 0C ；-χ 65 0C ；-N 2 ；-ρ 33，-P 65 ；_m GGGGG CCCCC TTTTTAAAAA ；-g 15。
7.權(quán)利要求
1所述的人乳頭瘤病毒基因芯片在制備檢測用試劑盒中的應用。
8.—種檢測用試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求
1所述的人乳頭瘤病毒基因芯片。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的檢測用試劑盒，其特征在于還包括從待測樣品中用于擴增人乳頭瘤病毒基因的SEQ ID NO :40-SEQ ID NO :41所示的PCR引物，或用于擴增β珠蛋白基因的 SEQ ID NO :42-SEQ ID NO :43 所示的引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的檢測用試劑盒，其特征在于還包括下列試劑中的至少一種從待檢樣品中提取DNA的樣品處理試劑；PCR擴增試劑；雜交試劑；顯色試劑。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種人乳頭瘤病毒檢測的基因芯片、制備方法、應用及檢測用試劑盒與應用。其中該基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，上述寡聚核苷酸探針包含從人乳頭瘤病毒的L1基因中、或從人類的β珠蛋白基因中選取的DNA片段或其互補DNA片段；本發(fā)明還提供上述基因芯片的制備方法和包含該基因芯片的檢測用試劑盒，利用本發(fā)明的基因芯片及試劑盒具有操作簡便，高通量，準確性高，重復性強等特點，可以達到檢測25種不同型別的人乳頭瘤病毒目的，可用于醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)的臨床檢測、流行病學分析等。
文檔編號C12Q1/70GKCN101624632 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810133503
公開日2012年4月11日 申請日期2008年7月8日
發(fā)明者曹勃陽, 王磊, 胡品良 申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責任公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (3),