專利名稱:微生物乙醇生產(chǎn)的增強的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵過程和其中使用的微生物，特別是涉及微生物乙醇 生產(chǎn)的增強。更具體地說，本發(fā)明涉及利用來源于生物質水解的混合糖 由嗜熱細菌(比如芽孢桿菌)生產(chǎn)乙醇的增強。特別地是，本發(fā)明設計
了一種新的乙醇生產(chǎn)途徑，這是通過將編碼NAD連接型曱酸脫氫酶的 基因克隆到微生物中，該微生物具有編碼丙酮酸-甲酸裂合酶復合物但 缺乏乳酸脫氫酶活性的功能基因。
背景技術：
目前，生物乙醇從葡萄糖、麥芽糖或蔗糖來制取，這些糖來源于谷 類淀粉、甘蔗或甜菜，它們都具有食用價值。纖維素和半纖維素形成了 農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的主要部分，原則上可以是低成本、可再生的生物乙醇的主 要來源。然而，從纖維素來生成可發(fā)酵糖很困難而且昂貴。相比較而言， 半纖維素幾乎與纖維素一樣豐富，而且易于水解，但是其產(chǎn)生的是以戊 糖為主的混合物，而酵母菌無法發(fā)酵戊糖。
由于這個原因，Hartley (見國際公開號WO88/09379 )提出在高達 70r的溫度下由嗜熱芽孢桿菌的突變體生產(chǎn)乙醇，這種嗜熱細菌能夠非 常迅速地發(fā)酵來源于生物質的所有糖類。然而，只能在應激和瀕死細胞 中實現(xiàn)高乙醇產(chǎn)率。
許多微生物含有丙酮酸-甲酸裂合酶(pyruvate-formate lyase, PFL)途徑，能夠將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A和甲酸(圖1A)。異乳酸 發(fā)酵微生物是其中一類。這些微生物首先將輸入糖轉化為丙酮酸(通常 通過糖酵解的EMP途徑)，然后根據(jù)生長條件可通過多種途徑產(chǎn)生不同 比例的乳酸、甲酸、乙酸、乙醇和C02。
在完全需氧的細胞中，丙酮酸一般通過丙酮酸脫氫酶(PDH )途徑、 三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈被代謝為H20和C02。然而，在許多這類生 物中，特別是嗜熱芽孢桿菌中，糖攝入和糖酵解似乎不受調控，即使在 有氧環(huán)境下，在高糖濃度時乳酸仍是主要產(chǎn)物。這說明，PDH流量已 經(jīng)飽和了，多出的丙酮酸被轉到溢流的乳酸脫氫酶途徑。這并不是用于生長，而是用于產(chǎn)熱，結果導致環(huán)境溫度升高并殺死嗜溫(mesophilic) 竟爭者，正如新鮮草放在堆肥堆上時所見的情形。
如果/d/i基因(編碼乳酸脫氫酶)失活，例如WO02/2卯30中所述， 乳酸產(chǎn)生即停止，多出的丙酮酸主要被轉入生長關聯(lián)型PFL途徑，(圖 1A)。但是，在糖濃度非常高和/或酸性PH值時，PFL途徑流量下降， 多出的丙酮酸溢出到厭氧PDH途徑，該途徑只產(chǎn)生乙醇和C02(圖1B)。 因此，獲得高乙醇產(chǎn)量的優(yōu)選條件是減少通過PFL途徑的流量以及增 加通過PDH途徑的流量(Hartley, B.S.和Shama, G. Proc. Roy. Soc. Lond. 321, 555-568(1987))。不幸的是，在這種條件下，細胞將經(jīng)受代 謝應激，ATP產(chǎn)生隨之減少，以及NAD/NADH和輔酶A/乙酰輔酶A 比例的潛在失衡(圖1C)。
已經(jīng)提出各種不同的發(fā)酵方案以試圖避免或盡量減少此問題，比如 Hartley, B.S.所討論的那些(見國際7>開號WO88/09379 )。
有兩種類型的曱酸脫氫酶。 一類(由/《//lF基因編碼)將甲酸轉化 為C02+H2，典型代表是腸桿菌，如大腸桿菌E. coli。另一類(由力傷7 基因編碼)將甲酸和NAD轉化為C02+NADH2，其存在于許多兼性厭 氧生物中。Berrios-Rivera等人(Metabolic Engineering 4， 217-219
(2002))用酵母菌/i/Zii基因替換E. coli中的/i/7LF基因，結果發(fā)現(xiàn)， 相對于氧化產(chǎn)物如乙酸，還原的厭氧產(chǎn)物如乙醇、乳酸和琥珀酸增加。 基于該觀察結果，San， K-Y.Berrios-Rivers， S.J.和Bennett, G.N.等人
(見國際公開號WO 2003/0406卯)提出將引入NAD連接型甲酸脫氫酶 基因作為一般方法來增加細胞中的還原能力，其涉及廣泛的生物轉化。 接著，San， K隱Y. Bennett, G.N.和Sanchez, A.等人(美國專利申請US 2005/0042736 Al)提出了將這種概念用于生產(chǎn)琥珀酸的具體應用。這些 研究在大腸桿菌中進行，這是一種典型的嗜溫細菌，它的糖攝入是受調 節(jié)的。這些實驗研究的目的是為了增加細胞內NADH水平，從而為各 種生物轉化提供增強的還原能力。
Sen等人(2004)推薦的酵母菌甲酸脫氫酶在時無活性，而對 于生物乙醇生產(chǎn)中可能采用的嗜熱細菌，這個溫度是最低生長溫度。目 前為止發(fā)現(xiàn)的最耐熱的甲酸脫氫酶是假單胞菌屬101 (尸wm^附o"m ，)酶(A. Rojkova， A. Galkin, L. Kulakova, A. Serov， P. Savitsky, V. Fedorchuk， V. Tishkov FEBS Letters, 445巻，第1期，第183-188頁， 1999 )。
發(fā)明內容
本發(fā)明試圖解決從生物質生產(chǎn)高產(chǎn)量乙醇的問題。具體來說，本文 首次描述了一種新的代謝途徑，可以使嗜熱微生物尤其是細菌(如芽孢 桿菌)產(chǎn)生最大的乙醇產(chǎn)量。
本發(fā)明依靠缺乏乳酸脫氫酶活性并因此需要替代途徑來重新氧化
由糖酵解產(chǎn)生之過量NADH的微生物。通過將編碼NAD連接型曱酸脫 氫酶的基因(如/rf/17基因)導入所述微生物來提供這種途徑。與嗜溫 細菌如大腸桿菌不同，在嗜熱微生物中糖攝入不受調節(jié)，這導致在存在 高水平糖時的NADH積聚。這將最終導致代謝崩潰和所謂的"氧化還 原死亡"，如圖1C所示。將編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因導入所 述微生物中，可以通過導致NADH水平降低和NAD水平升高輔助防止 在高濃度糖時的細胞死亡。該過程部分是通過恢復經(jīng)丙酮酸脫氫酶
(PDH)途徑的流量，但更重要的是，導入編碼NAD連接型曱酸脫氫 酶的基因為乙醇生產(chǎn)創(chuàng)建了一個新的途徑，即丙酮酸曱酸裂合酶(PFL)
- NAD連接型曱酸脫氫酶(FDH )途徑。圖1D顯示了這種PFL-FDH 途徑恢復氧化還原平衡的潛力，這是通過將高糖水平存在時經(jīng)快速糖酵 解產(chǎn)生的所有丙酮酸轉化為乙醇和二氧化碳實現(xiàn)的，尤其是在中性pH 條件下。重要的是，這種途徑在適合細胞生長的條件下工作，導致快速 的乙醇產(chǎn)生和高產(chǎn)量，因為PFL途徑是嗜熱微生物中主要的生長連接 型厭氧途徑。
因此，在本發(fā)明的第一個方面中提供了一種缺乏乳酸脫氫酶(W/O 活性的微生物，特別是嗜熱微生物，其特征在于，這種微生物(優(yōu)選地 嗜熱微生物)含有編碼NAD連接型曱酸脫氫酶的基因(力/Zi )。
在一個實施方案中，所述微生物通過適當?shù)幕蛉笔Щ蛉コ樗崦?氫酶活性的其它突變而缺乏乳酸脫氫酶活性。因此，優(yōu)選地缺失所述似/i 基因或者以其它方式使之無功能。基因敲除和缺失的方法是本領域眾所 周知的，在此詳細描述優(yōu)選的實例。另外，缺乏乳酸脫氫酶活性的已知 細菌林可以適用于本發(fā)明(例如保藏號為NCIMB 41075的TN-T9和保 藏號為NCIMB 41115的TN-TK)。
本發(fā)明的微生物通常包含有活性的丙酮酸甲酸裂合酶途徑。特別 是，所述微生物優(yōu)選含有編碼丙酮酸甲酸裂合酶的基因，如/7_/7基因。 本發(fā)明的微生物通常還包含有活性的丙酮酸脫氫酶(PDH)途徑。
7在一個優(yōu)選的實施方案中，所述編碼NAD連接型曱酸脫氫酶的基 因被整合到嗜熱微生物的基因組中。然而，無需整合例如通過導入合適 的質粒也有可能實現(xiàn)穩(wěn)定的表達。整合的一個優(yōu)選方法是重組。編碼 NAD連接型甲酸脫氫酶的基因可以操作性連接到任何合適的調節(jié)元件， 以指導NAD連接型甲酸脫氫酶的表達。"操作性連接"是指調節(jié)元件和 編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因之間存在功能性連接。例如，編碼 NAD連接型甲酸脫氫酶的基因可以連接到合適的啟動子上，例如所述 啟動子可以是組成型或誘導型啟動子。"啟動子"在本文中定義為包括 參與RNA聚合酶結合以啟動轉錄的DNA區(qū)域。通常，所述啟動子是原 核啟動子，因此包含適當?shù)?10和-35序列，其共有序列是本領域中明確 定義的。該基因還可以操作性連接到其它合適的調節(jié)序列，如終止子。 "終止子，，定義為導致RNA聚合酶終止轉錄的核苷酸序列。在一個實 施方案中，編碼NAD連接型甲酸脫氳酶的基因從其自身啟動子表達。 在一個替代實施方案中，編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因從嗜熱微 生物的啟動子表達(因為該基因整合到了基因組中的適當位置上)。還 可以設想其它結構，其中由外來啟動子驅動編碼NAD連接型甲酸脫氫 酶的基因表達。例如由此可以實現(xiàn)最大表達水平或誘導型表達。例如， 可以利用噬菌體啟動子如T7并聯(lián)合合適的噬菌體聚合酶(它可以在分 離的或同一 DNA構建體中提供)。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述編碼NAD連接型曱酸脫氫酶 的基因被操作性連接到編碼乳酸脫氫酶的基因的適當調節(jié)區(qū)，尤其是上 游調節(jié)區(qū)。所述調節(jié)區(qū)優(yōu)選地包含乳酸脫氫酶編碼基因的啟動子。該啟 動子可以定義為包含適當?shù)?10和-35序列作為最小功能單元。因此，根 據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述編碼NAD連接型曱酸脫氫酶的基 因被插入嗜熱微生物的乳酸脫氫酶基因中，從而使嗜熱微生物的乳酸脫 氫酶活性失活。該實施方案是特別優(yōu)選的，因為產(chǎn)生本發(fā)明嗜熱微生物 所需的兩種修飾在同一步驟中完成。在此詳細描述用于實現(xiàn)此目的的合 適構建體。
通過嗜熱細菌生產(chǎn)乙醇是有利的，因為它可以在高溫下進行。盡管 嗜熱微生物比酵母菌對乙醇耐受力較低，但通過膜和/或輕度真空蒸發(fā) 可將乙醇從高溫發(fā)酵中連續(xù)且方便地移出。在適宜的厭氧生長條件下， 芽孢桿菌LLD-R菌林在70匸時生長非常迅速，幾乎完全通過PFL途徑 (Hartley和Shama, 1982)?？梢詉殳想，通過新的PFL-FDH途徑的生 長可以同樣旺盛，然而最大生長溫度將受到導入嗜熱微生物中NAD連接型甲酸脫氫酶耐熱性的限制。由此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)
明的嗜熱微生物并入了編碼耐熱的NAD連接型甲酸脫氳酶的基因和/ 或這種基因，其核苷酸序列已經(jīng)密碼子優(yōu)化以促進由嗜熱微生物表達。 在此詳細描述這種耐熱的NAD連接型甲酸脫氫酶的生產(chǎn)。在一個具體 實施方案中，所述編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因包含如SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列、或者基本上由其組成或由其組成。在進一步 的實施方案中，本發(fā)明的嗜熱微生物并入了針對在芽孢桿菌中表達而優(yōu) 選了密碼子的編碼耐熱的NAD連接型甲酸脫氫酶的基因，該基因包含 如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列、或者基本上由其組成或由其組成。 除了基本的耐熱NAD連接型脫氫酶序列以外，該序列還包括啟動子和 終止子區(qū)以及Xbal位點，以便將該基因克隆到合適的DNA構建體中。
在更進一步的實施方案中，所述編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基 因是/《幼/基因。所述力//^基因可以來自任何合適的來源，優(yōu)選地針對 在相應的嗜熱微生物中表達而進行了密碼子優(yōu)化。
可以通過用本文進一步詳述的本發(fā)明的任何DNA構建體進行轉化 來產(chǎn)生本發(fā)明的嗜熱微生物。由此，經(jīng)適當修改，其中所作的討論適用 于本發(fā)明的該實施方案。
本發(fā)明的嗜熱微生物可以是任何適于從生物質生產(chǎn)乙醇的微生物。 所述嗜熱微生物優(yōu)選地是異乳酸發(fā)酵微生物。更優(yōu)選地，所述嗜熱微生 物是嗜熱細菌，更優(yōu)選是芽孢桿菌屬，甚至更優(yōu)選是嗜熱脂肪芽孢桿菌 (fifl"7/MS s^w^/^f7wop/i,7ws )。在一個實施方案中，本發(fā)明的嗜熱微生 物來自(嗜熱脂肪芽孢桿菌的)已知菌林LLD-R或LLD-15。在另一個 實施方案中，所述嗜熱微生物是熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(( m/^"7/m
本發(fā)明促進的發(fā)酵過程優(yōu)選利用合成的NAD連接型甲酸脫氫酶， 通過使用適當嗜熱微生物如芽孢桿菌LLD-R菌林的密碼子偏好，該脫 氫酶被設計為表達耐熱的氨基酸序列。所述合成基因優(yōu)選地包含工程化 的限制性位點，以幫助插入乳酸脫氫酶基因中。從而通過單一操作實現(xiàn) 缺失LDH途徑并創(chuàng)建PFL-FDH途徑。由此，在第二方面，本發(fā)明提 供了耐熱的NAD連接型甲酸脫氬酶。優(yōu)選地，所述耐熱NAD連接型甲 酸脫氫酶在60"C或以上溫度時仍然保留功能。優(yōu)選地，所述耐熱酶通過 已針對在嗜熱微生物中表達而優(yōu)化了密碼子的核苷酸序列來表達。在一 個實施方案中，所述甲酸脫氫酶可以包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或者基本上由其組成或由其組成。
根據(jù)假單胞菌屬物種101 (尸seM釦附o腳s ^ 101 )甲酸脫氫酶的氨基 酸序列(SEQ ID NO:3)，并通過使用針對熱葡糖苷酶地芽孢桿菌 (G Afl"7/ws ^^7wog/McowV/fls/ws)優(yōu)化了的密碼子(下文將更詳細討 論)，已經(jīng)設計了一種特定的耐熱的NAD連接型曱酸脫氫酶。技術人員 將會理解，這種基本序列的衍生物將保持其功能性。例如，保守性和半 保守性替換可以得到耐熱的NAD連接型甲酸脫氫酶，這些衍生物也落
入本發(fā)明的范圍內，只要它們保留了有效的催化活性和耐熱性，使得它 們可以用于使用嗜熱微生物的乙醇生產(chǎn)中。與之相似，較小的氨基酸缺 失和/或添加可以產(chǎn)生保留適當功能的衍生物。
第三方面，本發(fā)明涉及編碼耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶的合成基 因。該基因優(yōu)選包含如SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列，或者基本上 由其組成或由其組成。該序列代表一個新的力狄基因序列，其中密碼子 針對產(chǎn)生耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶進行了優(yōu)化。在一個更具體的實 施方案中，所述編碼耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶的基因包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。該序列引 入了耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶的編碼區(qū)以及合適的芽孢桿菌啟動子 和rho-非依賴性終止子。該序列還引入了合適的限制性位點以幫助克 隆，特別是Xbal位點。技術人員很容易理解，對所述核苷酸序列進行 較小的修飾不會改變所得酶的功能或耐熱性，例如，通過將優(yōu)化密碼子 替換為在適當嗜熱微生物的翻譯系統(tǒng)中優(yōu)選的其它密碼子。
本發(fā)明還涉及DNA構建體，其包含編碼NAD連接型甲酸脫氫斷特 別是耐熱的NAD連接型甲酸脫氫酶)的基因，其中該基因側翼有限制 性位點，以輔助將該基因克隆到合適的DNA構建體比如表達載體或質 粒中。
在一個相關的方面，本發(fā)明還提供了一種DNA構建體，其包含操 作性連接到編碼耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶之基因上的調節(jié)序列。因 此該DNA構建體促進嗜熱微生物的轉化，特別是那些缺乏乳酸脫氫酶 活性的嗜熱微生物的轉化，以產(chǎn)生能夠有效發(fā)酵而得到最大乙醇產(chǎn)量的 嗜熱微生物。如前所述，本文所用的術語"操作性連接"是指調節(jié)序列 和編碼NAD連接型甲酸脫氫酶基因之間的功能性連接，使得所述調節(jié) 序列能夠影響基因表達。例如， 一種優(yōu)選的調節(jié)序列是啟動子。如前所 述，所述編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因優(yōu)選地包含如SEQ INO:l所示的核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。 一種優(yōu)選 的調節(jié)序列是啟動子，盡管該DNA構建體可以額外地引入合適的終止 子序列。在一個具體實施方案中，所述啟動子包含如SEQ ID NO:4所 示的核苷酸序列。如上所述，其它啟動子可以用于高水平和/或誘導型 表達。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種包含編碼NAD連接型甲酸脫 氫酶之基因和插入序列的DNA構建體，其中所述插入序列有助于所述 編碼NAD連接型甲酸脫氬酶的基因整合到用該DNA構建體轉化的嗜熱 微生物的基因組中。"插入序列"是指可轉位的DNA片段，它能夠整合 到適當嗜熱微生物的基因組中。插入序列還可以表示為插入序列元件 (IE)，并可以是天然存在的。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述 插入序列來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌LLD-R或LLD-15菌林。
在一個更具體的實施方案中，所述插入序列包含如SEQ ID NO:5 所示的核普酸序列，或者基本上由其組成或由其組成(圖3)。所述優(yōu)選 的插入序列可以通過用引物擴增產(chǎn)生，所述引物包含如SEQ ID NO:6 和7所示的核苷酸序列，或者基本上由其組成或由其組成。在此情況下， 來自已知嗜熱脂肪芽孢桿菌LLD-15菌林的基因組DNA可以作為模板 使用。 一個特別優(yōu)選的DNA構建體是質粒pUB-ISFl (如下文試驗部分 及圖5所述)。
在另一個方面，本發(fā)明涉及包含編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的 (fdh )基因的DNA構建體，該基因操作性連接到編碼乳酸脫氫酶基因 的適當?shù)恼{節(jié)區(qū)，特別是上游調節(jié)區(qū)。所述調節(jié)區(qū)優(yōu)選地包含編碼乳酸 脫氫酶基因(/《狄)的啟動子。該啟動子可以定義為包括適當?shù)?10和-35 序列作為最小功能單元，以使RNA聚合酶有效結合。所述乳酸脫氫酶 基因啟動子適于在嗜熱微生物如芽孢桿菌中驅動高水平的表達，還可以 有利地將其用作克隆策略的一部分，以在同一步驟中實現(xiàn)既缺失乳酸脫 氫酶活性又導入NAD連接型甲酸脫氫酶活性。因此，該DNA構建體也 可以定義為包含操作性連接到一種核酸分子的編碼NAD連接型甲酸脫 氫酶的基因，所述核酸分子包含編碼乳酸脫氫酶(ldh)基因的啟動子。
所述DNA構建體優(yōu)選地還包含宿主乳酸脫氫酶基因之編碼序列的 一部分，其在編碼NAD連接型甲酸脫氫酶基因的下游。這有利于在用 該DNA構建體轉化的微生物中進行基因整合。"至少一部分"意思是指 該基因的一部分，其長度足以容許基因通過重組(優(yōu)選經(jīng)雙交換(double述乳酸脫氫酶基因的微生物的基因組中。所 述編碼序列部分優(yōu)選地引入所述乳酸脫氫酶基因的末端。在一個實施方 案中，所述乳酸脫氫酶基因的至少100、 200、 300、 400、 500、 600、 700 或750個核苷酸被引入到編碼NAD連接型曱酸脫氫酶基因的下游。這 樣，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述DNA構建體包含編碼NAD連接 型曱酸脫氫酶的基因，其中編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因的側翼 有來自編碼乳酸脫氫酶基因的核苷酸序列(來源于目標嗜熱微生物)。 所述側翼序列具有足夠的長度，足以容許將編碼NAD連接型甲酸脫氫 酶的基因整合到編碼乳酸脫氫酶的宿主基因中，從而在單一克隆步驟中 導入NAD連接型甲酸脫氫酶活性并敲除乳酸脫氫酶活性。優(yōu)選地，編 碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因在上游側翼至少有編碼乳酸脫氫酶基 因的啟動子區(qū)，使得在經(jīng)重組而整合之后所述編碼NAD連接型甲酸脫 氫酶的基因操作性連接所述啟動子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所 述乳酸脫氫酶基因的下游部分可以通過用引物擴增ldh基因而獲得，其 中所述引物包含如SEQ ID NO:8和9所示的核苷酸序列、或者基本上 由其組成或由其組成，并使用LLD-R菌林作為模板。上游側翼區(qū)優(yōu)選 引入了ldh啟動子，其優(yōu)選地包含適當ldh上游區(qū)域的至少100、 200、 300、 400、 500、 600、 700或750個核普酸，以l吏通過與宿主基因組重 組進行整合的效率最大化。該上游區(qū)域可以依賴于感興趣的具體嗜熱微 生物中l(wèi)dh基因的序列環(huán)境，技術人員很容易確定這種序列環(huán)境。由此， 具有l(wèi)dh基因序列知識的技術人員容易確定合適的側翼區(qū)以允許經(jīng)重組 進行整合。例如，可以研究公開的基因組序列，進行測序反應，或使用 來自ldh基因序列的引物通過PCR擴增側翼區(qū)。這樣，所述fdh基因 便插入到源自所述ldh基因的兩個核苷酸序列之間，使得所述fdh基因 讀框一致地(in frame)替換了所述ldh基因的至少一部分。
這樣一來，所述DNA構建體通常包含基因整合盒(gene integration cassette),其中目標基因(編碼NAD連接型甲酸脫氬酶的基因)被插 入到整合期間待敲除基因(在此是乳酸脫氫酶基因)的編碼序列(ORF ) 中。通過重組發(fā)生整合時，在被敲除基因的控制下實現(xiàn)了目標基因的表 達。在為表達異源基因而需要敲除一個基因的情況下，這種構建體可能 具有普遍適用性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述編碼NAD連接型甲 酸脫氫酶的基因編碼耐熱的NAD連接型甲酸脫氫酶。因此，在此提供 的關于耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶的討論經(jīng)適當變動也可應用于本發(fā) 明的這個方面。具體來"^兌，在一個實施方案中，所述編碼耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶的基因包含如SEQ ID NO:l或2所示的核苷酸序列， 或者基本上由其組成或由其組成。 一種特別優(yōu)選的DNA構建體是質粒 pUCK-LFl (如下文試驗部分和圖8所述)。
對于本發(fā)明的所有DNA構建體， 一種優(yōu)選的形式是表達載體。這 樣，所述DNA構建體可以容許所述編碼耐熱NAD連接型甲酸脫氫酶的 基因在用該構建體轉化的微生物中穩(wěn)定表達。在一個特別優(yōu)選的實施方 案中，該DNA構建體是質粒。優(yōu)選地，該DNA構建體只有在與宿主嗜 熱微生物基因組發(fā)生重組后才能在宿主嗜熱微生物中進行復制。
本發(fā)明的DNA構建體優(yōu)選地還并入合適的報告基因作為成功轉化 的指示。在一個實施方案中，報告基因是抗生素抗性基因，如卡那霉素 或氨芐青霉素抗性基因。其它報告基因，如綠色熒光蛋白(GFP)和P 畫半乳糖苷酶(lacZ)可以被適當利用。如果適當，該DNA構建體可以 整合多個報告基因。在隨后的傳代中，報告基因功能喪失指示了編碼耐 熱NAD連接型甲酸脫氫酶的基因與適當側翼區(qū)的整合。
在另一個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明之DNA構建體的微生物。 優(yōu)選的受體微生物為異乳酸發(fā)酵微生物。特別的是，本發(fā)明優(yōu)選涉及嗜 熱細菌，如芽孢桿菌屬的細菌，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌。例如，所述 細菌可以來自LLD-R或LLD-15菌林。在一個進一步的實施方案中， 嗜熱微生物是熱葡糖普地芽抱軒菌(Ge"Afl"7"s幼e簡og/"casiV/fls/"s )。
在另一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的微生物或本發(fā)明的嗜熱微生物 在發(fā)酵中的應用，特別是在乙醇生產(chǎn)中的應用。
與之相似，本發(fā)明涉及用于乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵方法，其包括為本發(fā)明 的嗜熱微生物或本發(fā)明的微生物供應糖。根據(jù)本發(fā)明構建的微生物尤其 適合在適宜生長條件下的高乙醇產(chǎn)量和體積生產(chǎn)率(volumetric productivity).由此，本發(fā)明的任何微生物可以用于任何發(fā)酵罐類型中， 諸如分批、補料(fed-batch)或連續(xù)發(fā)酵工藝。在一個優(yōu)選的實施方案 中，發(fā)酵工藝是補料型工藝。
使用諸如嗜熱細菌的微生物生產(chǎn)生物乙醇的主要益處之一是，與酵 母菌不同，它們能夠發(fā)酵來源于農(nóng)業(yè)廢棄物的廣泛的糖，如半纖維素。 因此，在一個實施方案中，用于本發(fā)明發(fā)酵方法的糖來源于生物質。在 另一個實施方案中，發(fā)酵是混合糖發(fā)酵。在一個具體實施方案中，所述 混合糖包括戊糖，優(yōu)選主要是戊糖。在另一個實施方案中，所述發(fā)酵方法保持氧化還原平衡。這一點對 于嗜熱生物特別重要，因為與嗜溫生物不同，這些微生物中糖攝入似乎 是不受調控的。優(yōu)選地，通過使用反饋傳感器實現(xiàn)此點。
盡管嗜熱細菌的乙醇耐受性低，但是在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，通過 定時或連續(xù)地移出乙醇可以方便地克服這個問題。這樣確保發(fā)酵過程中 保持乙醇濃度低于本發(fā)明的嗜熱微生物或微生物的乙醇耐受濃度。通過 蒸發(fā)或蒸餾，諸如膜和/或輕度真空蒸發(fā)，可以連續(xù)和方便地從高溫發(fā) 酵中移出乙醇。
接下來將參考下面非限制性說明和附圖來描述本發(fā)明。


圖l顯示了不同條件對嗜熱微生物中代謝途徑的影響，其中乳酸脫 氫酶途徑已經(jīng)被失活。箭頭的暗度和粗度指示各個代謝途徑的相對優(yōu) 勢。
A. 在中性pH和低糖存在下活躍的代謝途徑。此時，丙酮酸甲酸裂合 酶途徑占優(yōu)。
B. 在低pH和低糖存在下活躍的代謝途徑。此時，厭氧的丙酮酸鹽脫氫 酶途徑占優(yōu)。
C. 在低pH和高糖存在下活躍的代謝途徑。此時，細胞遭受代謝應激 并失去氧化還原平衡，導致所謂的"氧化還原死亡"。
D. 在中性pH和高糖存在下在本發(fā)明嗜熱微生物中活躍的代謝途徑。 此時，新的PFL-FDH途徑占優(yōu)，乙醇和二氧化碳是僅有的厭氧產(chǎn)物。
圖2列出合成基因的核苷酸序列，該基因已經(jīng)過密碼子優(yōu)化以 最大化其耐熱性。/i///開放讀碼框的DNA序列的側翼有啟動子和終止子 (斜體)區(qū)。啟動子的-35和-10盒用下劃線標出。為了在合適的載體中 克隆該構建體，在該序列的兩側都引入了 X6fll位點。
圖3顯示嗜熱脂肪芽孢桿菌LLD-15菌林的插入序列(IS)的核苷 酸序列。9bp的反向重復末端用粗體顯示。
圖4是pCR-Blunt衍生質粒pCR-Fl的圖示。該質粒包含在啟 動子控制下的經(jīng)密碼子優(yōu)化的/i//^基因，該基因在獨有X6fll位點克隆到pCR-Blunt中。
圖5是pUB110衍生質粒pUB-ISFl的圖示。該質粒包含來源于 pCR-Fl質粒的在WA啟動子控制下的經(jīng)密碼子優(yōu)化的/rfW基因，還包 含來源于已知芽孢桿菌LLD-15菌林的插入序列(IS)。
圖6是pUC18衍生質粒pUCK的圖示。該質粒包括卡那霉素抗性 基因，它從質粒pUB110克隆到pUC18中的獨有限制性位點。
圖7是pUCK衍生質粒pUCK-LC的圖示。該質粒攜帶一個/W基 因，該基因在ORF中間缺失363 bp。
圖8是pUCK衍生質粒pUCK-ldhB的圖示。該質粒包含W/i基因 的750 bp，包括該基因的下游區(qū)域。
圖9是pUCK-LFl質粒的圖示。該質粒是pUCK衍生物，并入了 在/W啟動子控制下的含/W基因的基因整合盒。
發(fā)明詳述 材料
培養(yǎng)基和緩沖液
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g;酵母提取物5g; NaCl 10g;去離子水加至 調整pH值至7，高壓滅菌
對于平板培養(yǎng)基，在高壓滅菌之前將20g/l的瓊脂加入培養(yǎng)基中，冷卻 至55X:，然后倒入無菌皮氏培養(yǎng)皿中(大約20ml/板)。
對于LB-amp平板，倒入皮氏培養(yǎng)臟之前加入過濾除菌的氨節(jié)青霉素溶 液，使最終濃度達到50 jig/ml。
SOC培養(yǎng)基:胰蛋白胨2.0g;酵母提取物0.5g; NaCl 0.05g; MgCl2'6H20 0.204g;
MgS04*7H20 0.247g;葡萄糖0.36g;去離子水加至100ml。 溶解，調整pH值至7.0，過濾除菌。
TGP培養(yǎng)基:胰蛋白胨17g;大豆蛋白胨3g; K2HP04 2.5g; NaCl 5g;丙酮酸鈉4g;甘油4ml;去離子水加至1L。調整pH值至7，然后高壓 滅菌。
對于平板培養(yǎng)基，在高壓滅菌之前將20g/l的瓊脂加入到培養(yǎng)基中，冷 卻至55X:，然后倒入無菌皮氏培養(yǎng)皿中(大約25ml/板)。
對于TGP-kan平板，倒入皮氏培養(yǎng)皿之前加入過濾除菌的卡那霉素溶 液，使最終濃度達到10 ng/ml。
TH緩沖液:海藻糖272mM; HEPES (用KOH調至pH 7.5) 8mM; 雙蒸水加至1L
微生物菌株
大腸桿菌(E. coli ) DH5-a-化學感受態(tài)細胞，購自Invitrogen (Cat.18265-017 )。
枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp. Subtilis ) —德國培養(yǎng)物 保藏中心，DSMZ (DSM No.10)
嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus.) LLD-R菌林一保藏 號NCIMB 12403
嗜熱脂肪芽胞桿菌LLD-15菌林一保藏號NCIMB 12428 質粒
質粒pCR隱Blunt和pCR-TOP02來自Invitrogen
質粒pUB110—攜帶該質粒的枯草芽孢桿菌BD170菌林來自德國培養(yǎng)物 保藏中心DSMZ (DSM No. 4514)。
質粒pUC18來自Sigma-Aldrich。
實施例1.合成曱酸脫氫酶基因的構建(圖2)
假單胞菌(尸w"rfo附卵"s /。7 )甲酸脫氫酶的氨基酸序列(NCBI 蛋白質數(shù)據(jù)庫登記號P33160162 )。該新序列與已知力狄基因序列相似性低于40% (與已知fdhl基因 的一致性為37%)。該構建體的兩側都設計了 Xbal位點，以協(xié)助克隆 到合適的載體中。
采用Gao等人的方法(見Xinxin Gao, Peggy Yo, Andrew Keith, Timothy J. Ragan和Thomas K. Harris (2003). Nucleic Acids Research, 31(22), e143 )合成需要的序列，并克隆到pCR-Blunt中的獨特Xbal位 置。所得載體pCR-Fl (圖4 )導入大腸桿菌DH5a細胞中，通過PCR 和限制性分析驗證陽性克隆。
在靶標芽孢桿菌的基因組中插入和表達此合成fdh基因有兩種替代 策略可供應用，如以下實施例所示。
實施例2.將fdh基因插入多個(IS)位點
該策略適用于一些菌抹，如嗜熱脂肪芽孢桿菌LLD-R菌林，它們 含有經(jīng)常在多個插入位點重組的插入序列(IS)。預期攜帶力/Zi基因和 該IS序列的載體將在一個或多個這樣的位置穩(wěn)定地整合。
質粒pUB-ISFl的構建(圖5 )
首先，以嗜熱脂肪芽孢桿菌LLD-15為模板，使用正向引物
( AGTACTGAAATCCGGATTTGATGGCG知插入序列(SEQIDNO:5和圖3)。在該序列兩端都引入限制位 點。PCR產(chǎn)物首先克隆到質粒pCR-TOP02.1中，然后將所得質粒 pCR-IS導入大腸桿菌DH5a細胞，并用于通過Soil限制性消化作用分 離所述IS區(qū)。然后，將分離的IS克隆到pUB110中的獨特Soil位點上， 將所得質粒pUB-IS導入枯草芽孢桿菌。
然后使用X6fll限制酶從pCR-Fl質粒中消化得到包含WA啟動子和 基因的1.5kb片段，然后將其克隆到已經(jīng)用相同酶線性化的質粒 pUB-IS中。然后將所得質粒pUB-ISFl (圖5)導入枯草芽孢桿菌中， 在TPG-kan平板上選擇陽性克隆，并通過PCR和限制性分析驗證陽性 克隆。
似/i基因整合到LLD-R菌株中
然后將質粒pUB-ISFl在體外用H^III甲基化酶進行曱基化，然后 用甲基化的pUB-ISFl質粒轉化嗜熱脂肪芽孢桿菌LLD-R菌林或其ldh缺失菌株(見實施例3 )的細胞。在50"C在TGP-kan平板上48小時后 選擇陽性克隆，并通過/W基因的PCR擴增進行分析。
通過將轉化克隆在60-65t:在TGP-Kan培養(yǎng)基中生長幾代并在 TGP-Kan平板上選擇，將力狄基因整合到染色體中。分析陽性克隆以 確認存在/i/Zi基因，然后在搖瓶和發(fā)酵罐中針對乙醇生產(chǎn)以及C5 (戊 糖)和C6 (己糖)利用來篩選所述陽性克隆。
實施例3. ldh-缺失菌抹的構建。
第一步是將芽孢桿菌卡那霉素抗性標記(kan)和嗜熱脂肪芽孢桿 菌LLD-R菌林ldh基因的基因盒克隆到質粒pUC18中，該質粒只能在 革蘭氏陰性微生物中復制。
芽孢桿菌克隆載體質粒pUCK的構建(圖6 )。
卡那霉素抗性基因(kan)克隆到質粒pUC18中的獨特Zml位點， 該位點位于質粒中任何編碼區(qū)和報告基因(lacZ)之外。為了克隆kan 基因，使用質粒pUB110為模板，用以下引物經(jīng)PCR擴增含卡那霉素 抗性基因的1.13kb片段
kan-BsZ-F (ACACAGACGTCGGCGATTTGATTCATAC通過引物將Zml位點導入kan基因的兩端。然后，PCR產(chǎn)物用Zml 限制性核酸內切酶進行消化，并與先前經(jīng)Znil消化并去磷酸化的質粒 pUC18相連接。然后將所得質粒pUCK (圖6 )導入大腸桿菌DH5cx細 胞。在LB-amp平板上選擇陽性克隆，并通過PCR和限制性分析確認 陽性克隆。
攜帶缺失/rf/i基因的質粒DUCK-LC (圖7)的構建
設計長度為1.36kb的/rf/i基因盒，其中含有LLD-R菌林的整個ldh 基因，從中缺失掉其ORF的363 bp并附加側翼。使用LLD-R菌林為 模板，通過PCR擴增W/i基因的上區(qū)和下區(qū)來構建該基因盒。然后連 接這些區(qū)域被并克隆到質粒pUCK中。5g瓜位點導入到內部引物中。 用以下引物PCR擴增所述上區(qū)
LC-U-Fl (AGGGCAMCTGAAAGGAAGGGAAAATTCCLC-DB-F1 (TTGAGCAGATCTTGATGCAAAACGATAAC (TAAAGCCGATGAGCAGCAGTTGAAGPCR產(chǎn)物使用B^II限制性核酸內切酶進行消化，并使用T4 DNA 連接酶進行連接。然后用連接產(chǎn)物作為模板，用以下引物PCR擴增/W 基因盒
LC-UX-F2 (ATATTATCTAGACATTACGGAAATGATAATGGC通過引物在所述基因盒兩側引入位點。然后用J^fli酶消化
PCR產(chǎn)物并克隆到用相同酶預消化和去磷酸化的質粒pUCK中。然后 將所得質粒pUCK-LC導入大腸桿菌DH5a中。在LB-amp平板上選擇 陽性克隆，并通過PCR和限制分析確認。
/幽缺失菌抹的構建
質粒pUCK-LC在體外用曱基化酶進行甲基化，并將甲基化 質粒通過電穿孔(1000V, 201歐姆，25微法和5毫秒)轉化到野生型 嗜熱細胞(如LLD-R菌林)中。在65n在TTG-Kan平板上選擇陽性 克隆，通過kan基因的PCR擴增確認單交換事件。
為了通過雙交換實現(xiàn)基因缺失，將陽性克隆在TGP培養(yǎng)基上生長 幾代(約5次傳代)，選擇能在TGP平板上生長但不能在TGP-kan平 板上生長的克隆。然后通過PCR分析確認陽性克隆為/^//i基因缺失并 且沒有卡那霉素基因。然后在搖瓶和發(fā)酵罐中表征這些克隆的乙醇生產(chǎn) 以及C5和C6糖利用。
實施例4.同時插入似/i基因和缺失/^i基因。
這個替代策略可廣泛應用于寬范圍類型的異乳酸發(fā)酵微生物以及 嗜熱芽孢桿菌，然而將使用后者作為舉例說明。
質粒pUCK-LF (圖9 )的構建
將包含/W基因加上整個WA基因以及約300 bp的上游和下游側翼 區(qū)的基因整合盒克隆到質粒pUCK中。在這個構建體中，ldh開放讀碼 框的前450 bp被替換為/rf/i基因，使得該基因的表達受基因啟動子的控制。
為了達到此目的，使用
LDHB-X-F1 (GAACGATTCTAGATACAGCAAGATTCCGC 二 SEQ工D NO:8) 和 LDHB-E-Rl (GTTTGCGAATTCATAGACGGACGCAG脂肪芽孢桿菌LLD-R菌林作為模板經(jīng)PCR擴增含有l(wèi)dh基因下游區(qū)的 約750bp的DNA片段。將AT6fll和五"J 1位點導入該PCR片段的末端。 然后消化該PCR片段并定向克隆到質粒pUCK中JVT6fll和位點 之間。將所得質粒pUCK-ldhB (圖8 )導入大腸桿菌DH5a,在LB國amp 平板上選擇陽性克隆，并通過PCR和限制性分析確認。
然后，使用AT6al限制酶從pCR-Fl質粒中消化得到含有啟動子 和/W基因的1.5kb片段，并將其克隆到已預先用相同酶線性化的質粒 pUCK-ldhB (圖8)中。將所得質粒pUCK-LFl (圖9)導入大腸桿菌 DH5a細胞，在LB-Amp平板上選擇克隆。通過PCR和限制性分析確 認陽性克隆和該構建體的正確定向。
通過新PFL-FDH途徑生產(chǎn)乙醇的菌抹的構建。
質粒pUCK-LFl在體外用甲基化酶進行甲基化，用甲基化 質粒轉化野生型靶細胞(如LLD-R菌株細胞)，并在60C在TPG-Kan 平板上進行選擇。陽性克隆代表單交換事件，并通過基因的PCR 擴增來確認。
為了實現(xiàn)雙交換基因整合，選擇在TGP平板上生長但不在TGP-kan 平板上生長的克隆。然后確認陽性克隆中存在/i/Zi基因并且缺少卡那霉 素基因。最后，在搖瓶和發(fā)酵罐中根據(jù)乙醇生產(chǎn)以及C5和C6糖利用 來篩選這些克隆。
所有參考資料均以其全部內容并入本文。
權利要求
1. 缺乏乳酸脫氫酶活性的嗜熱微生物，其特征在于所述嗜熱微生物包含編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因。
2. 權利要求
l的嗜熱微生物，其表達丙酮酸甲酸裂合酶。
3. 權利要求
1或2的嗜熱微生物，其中所述編碼NAD連接型甲i^ 氫酶的基因整合到所述嗜熱微生物的基因組中。
4. 權利要求
1至3中任一項的嗜熱微生物，其中所述編碼NAD連接 型甲酸脫氫酶的基因從其自身啟動子或從所述嗜熱微生物的啟動子表達。
5. 權利要求
1至4中任一項的嗜熱微生物，其中所述編碼NAD連接 型甲,氫酶的基因插入到所述嗜熱微生物的乳^氫酶基因中，從而滅 活所述嗜熱微生物的乳i^t氫酶活性。
6. 權利要求
1至5中任一項的嗜熱微生物，其中所述編碼NAD連接 型甲酸脫氫酶的基因編碼耐熱的NAD連接型甲酸脫氬酶。
7. 前述任一項權利要求
的嗜熱微生物，其中所述編碼NAD連接型甲 ^氳酶的基因包含如SEQ ID NO:l或2所示的核苷#列。
8. 前述任一項權利要求
的嗜熱微生物，其已被包含調節(jié)序列的DNA 構建體所轉化，所述調節(jié)序列操作性連接至編碼耐熱NAD連接型甲i^ 氫酶的基因，所述編碼耐熱NAD連接型曱^氬酶的基因包含如SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列。
9. 權利要求
1至7中任一項的嗜熱微生物，其已被包含編碼NAD連 接型甲,氬酶基因和插^J^列的DNA構建體所轉化，其中所述插A^ 列促進所述編碼NAD連接型甲自氫酶的基因整合入被該DNA構建體轉 化的所述嗜熱微生物的基因組中。
10. 權利要求
1至7中任一項的嗜熱微生物，其已被包含編碼NAD連 接型甲酸脫氫酶之基因的DNA構建體所轉化，所述編碼NAD連接型甲酸 脫氫酶的基因操作性連接到編碼乳酸脫氫酶基因的上游區(qū)，其中所述上游 區(qū)包含啟動子。
11. 權利要求
10的嗜熱微生物，其中在所述編碼NAD連接型甲自 氫酶基因的下游，所述DNA構建體還包含編碼所述乳酸脫氬酶基因的至 少一部分，使得所述編碼NAD連接型曱酸脫氫酶的基因介于在任一側上 所述乳酸脫氫酶基因的充分部分之間，以促進將所述編碼NAD連接型甲 自氫酶的基因通過與乳,氫酶基因重組而整合到所述嗜熱微生物的 基因組中。
12. 前述任一項權利要求
的嗜熱微生物，其是嗜熱細菌。
13. 權利要求
12的嗜熱微生物，其屬于芽孢桿菌屬。
14. 權利要求
13的嗜熱微生物，其是嗜熱脂肪芽胞桿菌(fi""7/"s 他flrafto歸/^,7ws)或熱葡糖香酶地芽孢桿菌(G^6fl"7/ws 幼mwo^/mwV/"s/"51 )。
15. 權利要求
14的嗜熱微生物，其中所述的嗜熱脂肪芽胞桿菌來源于 菌林LLD-R或LLD-15。
16. 編碼耐熱NAD連接型甲i^氫酶的基因，其包* SEQ ID NO:l 所示的核苷酸序列。
17. 包含調節(jié)序列的DNA構建體，所述調節(jié)序列操作性連接到編碼耐 熱NAD連接型甲酸脫氫酶的基因，所述編碼基因包含如SEQ ID NO:l所 示的核苷酸序列.
18. 權利要求
17的DNA構建體，其中所述調節(jié)序列是啟動子。
19. 權利要求
18的DNA構建體，其中所述啟動子包含如SEQ ID NO:4 所示的核苦酸序列。
20. 包含編碼NAD連接型曱Wt氫酶基因和插A^列的DNA構建 體，其中所述插入序列促進將編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因整合入 用該DNA構建體轉化的嗜熱微生物的基因組中。
21. 權利要求
20的DNA構建體，其中所述插入序列來源于嗜熱脂肪 芽胞桿菌菌林LLD-R或LLD-15。
22. 權利要求
21的DNA構建體，其中所述插入序列包含如SEQID NO:5所示的核苷酸序列。
23. 權利要求
22的DNA構建體，其中所述插入序列通過用引物擴增 而產(chǎn)生，所述引物包含如SEQIDNO:6和7所示的核苦酸序列，并以嗜熱 脂肪芽胞桿菌菌株LLD-15為模板。
24. 包含編碼NAD連接型甲酸脫氫酶基因的DNA構建體，所述編碼 NAD連接型曱自氬酶的基因操作性連接了編碼乳,氫酶的基因的上 游區(qū)，其中所述上游區(qū)包含啟動子。
25. 權利要求
24的DNA構建體，其中在所述編碼NAD連接型甲酸 脫氳酶基因的下游，所述DNA構建體還包含所述乳酸脫氫酶基因的至少 一部分，使得所述編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因介于在任一側上所 述乳酸脫氬酶基因的充分部分之間，以促進將所述編碼NAD連接型曱酸 脫氫酶的基因通過與乳^氫酶基因重組而整合到嗜熱微生物的基因組 中。
26. 權利要求
17至25中任一項的DNA構建體，其中所述編碼NAD連接型甲自氫酶的基因是編碼耐熱的NAD連接型曱i^氫酶的基因。
27. 權利要求
26的DNA構建體，其中所述編碼耐熱NAD連接型曱 酸脫氫酶的基因包含如SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列。
28. 權利要求
17至27中任一項的DNA構建體，其是表達栽體。
29. 權利要求
17至28中任一項的DNA構建體，其是質粒。
30. 包含權利要求
17至29中任一項所定義之DNA構建體的微生物。
31. 權利要求
30的微生物，其是嗜熱細菌。
32. 權利要求
31的微生物，其屬于芽孢桿菌屬。
33. 權利要求
32的微生物，其是嗜熱脂肪芽胞桿菌或熱葡糖苷酶地芽 孢桿菌。
34. 權利要求
1至15任一項的嗜熱微生物或權利要求
30至33任一項 的孩t生物用于生產(chǎn)乙醇的用途。
35. 用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法，其包括為權利要求
1至15任一項的嗜 熱微生物或權利要求
30至33任一項的微生物供應糖。
專利摘要
嗜熱微生物缺乏乳酸脫氫酶活性，優(yōu)選地包含有活性的丙酮酸甲酸裂合酶途徑。所述嗜熱微生物含有編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因。所述編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因優(yōu)選地是所述耐熱的NAD連接型甲酸脫氫酶編碼基因的經(jīng)密碼子優(yōu)化的形式。DNA構建體允許在所述嗜熱微生物中穩(wěn)定地表達所述編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因。這種DNA構建體基于使用實現(xiàn)穩(wěn)定表達或重組的插入序列，將編碼NAD連接型甲酸脫氫酶的基因插入到乳酸脫氫酶基因中，從而通過單一步驟實現(xiàn)基因敲除和獲得新功能。這類微生物可用于糖發(fā)酵來生產(chǎn)乙醇。
文檔編號C12P7/06GKCN101448948SQ200780018582
公開日2009年6月3日 申請日期2007年3月26日
發(fā)明者穆罕默德·賈韋德, 納姆達爾·巴格哈伊-亞茲迪 申請人:生物轉化技術有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan