專利名稱:增強腺相關(guān)病毒載體功能的方法
增強腺相關(guān)病毒載體功能的方法
發(fā)明背景
腺相關(guān)病毒(AAV)是細小病毒科(Parvovirus)家族的一個成員，它是小的無包膜、二十面體病毒，具有4. 7千堿基(kb)到6kb的單鏈線性DNA基因組。由于該病毒是作為純化的腺病毒原種的污染物被發(fā)現(xiàn)的，AAV指定為依賴病毒屬(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潛伏期(AAV基因組在感染后位點特異性整合入宿主染色體)，感染期(腺病毒或單純皰疹病毒感染后，整合的基因組接著得到拯救、復制并包裝入感染的病毒)。非致病性、寬宿主范圍(包括非分裂細胞)感染性以及潛在的位點特異性染色體整合的特性使得AAV成為用于基因轉(zhuǎn)移的有吸引力的工具。
已經(jīng)描述AAV載體用于治療用和免疫原性分子的運載工具。迄今為止，已從人或非人靈長類(NHP)中分離了幾種表征良好的不同AAV。
最近，研究者描述了不同序列的大量AAV[G. Gao等人，Proc Natl Acad SciUSA, 100 (10) =6081-6086 (2003 年 5 月 13 日)；US-2003-0138772-Al (2003 年 7 月 24 日)]，并且將這些AAV表征為不同的血清型和分化體[G. Gao等人，J. Virol. ,78(12) :6381-6388(2004年6月)；國際專利公開號WO 2005/033321]。已報道不同的AAV表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率，也表現(xiàn)出對不同細胞或組織的趨性。
想要得到用于向不同細胞類型遞送異源分子的基于AAV的構(gòu)建體。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種用于改善無功能和/或功能弱的AAV載體的方法。
一方面，該方法提供了ー種在選定的腺相關(guān)病毒(AAV)序列中校正單現(xiàn)突變(singleton)以提高選定AAV的包裝產(chǎn)量、轉(zhuǎn)導效率和/或基因轉(zhuǎn)移效率的方法。該方法包括改變親代AAV衣殼中的一個或多個單現(xiàn)突變使所述單現(xiàn)突變與用來比對的功能性AAV衣殼序列中對應位點的氨基酸相一致。
另ー方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修正的AAV序列，即除去一個或多個單現(xiàn)突變的序列。
又一方面，本發(fā)明提供了具有根據(jù)本發(fā)明修正的AAV衣殼的AAV載體。
下述發(fā)明詳述容易地表現(xiàn)出本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點。

附圖簡述
圖I顯示經(jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV載體的體外293轉(zhuǎn)導。在載體名稱之后標明了單現(xiàn)突變的校正(如果存在的話)，數(shù)字表示突變的數(shù)目。
圖2A-2C顯示用293細胞測定的AAV載體在感染復數(shù)范圍為IO1到IO4的滴度，其中，圖2A比較親代rh. 8和經(jīng)單現(xiàn)突變校正的rh. 8 (rh. 8R)，圖2B比較親代rh. 37和經(jīng)修正的rh. 37，圖2C比較AAV2和AAV8。作為對照，還給出了 AAV2和AAV2/8eGFP表達載體的相似滴定的結(jié)果。Y軸表示以流式細胞計數(shù)法測定的eGFP陽性細胞百分比(％)。
圖3是AAV序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，顯示了它們的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和所屬分化體
圖 4A-4K 是 AAV2 [SEQ ID NO 7]、cy. 5[SEQ ID NO 8]、rh. 10 [SEQ ID NO 9]、rh.13[SEQ ID NO:10]、AAVl[SEQ ID NO :11]、AAV3[SEQ ID NO12],AAV6[SEQID NO :13]、AAV7 [SEQ ID NO : 14]、AAV8 [SEQ ID NO :15]、hu. 13 [SEQ ID NO : 16]、hu. 26 [SEQ ID NO:17]、hu. 37 [SEQ ID NO : 18]、hu. 53 [SEQ ID NO : 19]、rh. 39 [SEQ IDNO :20]、rh. 43 [SEQ IDNO 21]和rh. 46[SEQ ID NO :22]的衣殼蛋白(vpl)核酸序列的比對。
圖 5A-5D 是 AAV2 [SEQ ID NO 23]、cy. 5 [SEQ ID NO 24]、rh. 10 [SEQ IDNO 25]、rh. 13[SEQ ID NO :26]、AAVI[SEQ ID NO :27]、AAV3[SEQ ID NO :28]、AAV6[SEQ ID NO :29]、AAV7[SEQ ID NO :30]、AAV8[SEQ ID NO :31]hu.13 [SEQID NO :32]、hu. 26[SEQ ID NO :33]、hu. 37 [SEQ ID NO :34]、hu. 53 [SEQ ID NO :35]、rh. 39 [SEQ ID NO :36]、rh. 43 [SEQ ID NO:37]和rh.46[SEQ ID NO :38]的衣殼蛋白(vpl)氨基酸序列的比對。
圖 6A-6B 是 rh. 13[SEQ ID NO :26]、rh. 2 [SEQ ID NO :39]、rh. 8 [SEQ ID NO :41]、hu. 29[SEQ ID NO :42] rh. 64[SEQ ID NO :43]的衣殼蛋白(vpl)氨基酸序列的比對
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了ー種改善AAV載體功能的方法。本發(fā)明尤其適合于改善衣殼含ー個 或多個單現(xiàn)突變的AAV載體的包裝產(chǎn)量、轉(zhuǎn)導效率和/或基因轉(zhuǎn)移效率。本發(fā)明進ー步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定和制備的新AAV衣殼序列。
本說明書與權(quán)利要求
書使用的術(shù)語“包含/含有”和“包括”包括其他成分、元素、數(shù)值、步驟等等在內(nèi)。相反，術(shù)語“由...組成”和其變體不包括其他成分、元素、數(shù)值、步驟等等在內(nèi)。
本發(fā)明的單現(xiàn)突變方法
如本文中所用的術(shù)語“單現(xiàn)突變(singleton) ”指在選定的(即親代)AAV衣殼序列中的給定位點上的可變氨基酸。通過將親代AAV衣殼序列與功能性AAV衣殼序列文庫比對來確定可變氨基酸的存在。然后分析序列來確定親代AAV衣殼中所有這樣的可變氨基酸序列功能性AAV文庫中的AAV序列在此氨基酸位置完全保守。然后改變親代AAV序列，將單現(xiàn)突變改變?yōu)榻?jīng)鑒定功能性AAV衣殼序列在該位點上的保守氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，親代AAV序列可能具有1-6、1-5、1-4、1-3或2個單現(xiàn)突變。親代AAV序列也可能具有超過6個單現(xiàn)突變。
一旦修正后，經(jīng)修正的AAV衣殼可用于構(gòu)建具有經(jīng)修正衣殼的AAV載體。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來構(gòu)建載體。
根據(jù)本發(fā)明方法所選擇的用于修正的AAV是想要與親代AAV相比增強其下列三種功能特性之一或多種的AAV，所述的三種功能特性即包裝成具有選定AAV序列的衣殼的病毒粒子，提高轉(zhuǎn)導效率或増加基因轉(zhuǎn)移效率。例如，與密切相關(guān)的其他AAV相比，親代AAV的特征可能在于具有較低的包裝效率。在另ー個實例中，與密切相關(guān)的AAV相比，親代AAV可能具有較低的轉(zhuǎn)導效率。在另ー個實例中，與密切相關(guān)的AAV相比，親代AAV可能具有較低的基因轉(zhuǎn)移效率(即體內(nèi)遞送靶分子的能力較低)。在其他的實例中，親代AAV的上述各項功能都合格，但有待進ー步提高其中ー項或多項功能。
因此，本發(fā)明提供了一種功能性AAV的文庫，其中AVV的序列與選定的(親代)AAV形成對照。適宜的是，該文庫包含具有目標功能的AAV,該目標功能正是欲在選定親代AAV實現(xiàn)的改善。換句話說，該功能性AAV文庫的每一序列的特征在于具有目標水平的包裝能力、目標水平的體外轉(zhuǎn)導效率或目標水平的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率(即在對象中向選定靶組織或細胞的遞送能力)。組成文庫的功能性AAV可分別具有這些功能性特征中的ー種、兩種或全部。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定文庫的其他目標功能。[0027]在一個實施方案中，功能性AAV是能產(chǎn)生具有與AAV1、AAV2、AAV7、AAV8或AAV9同等或更強包裝和轉(zhuǎn)導效率的病毒粒子的AAV。可用含AAV2 r印和AAV2 ITR的假型包裝設(shè)定(pseudotype setting)來測評功能。因此，可使用常規(guī)技術(shù)構(gòu)建改變的親代AAV,并且，當與AAV2的產(chǎn)量相比，如果由所屬親代AAV產(chǎn)生病毒的滴度為至少50%吋，則認為該AAV載體是功能性的。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定AAV轉(zhuǎn)導細胞的能力。例如，可構(gòu)建親代AAV使其包含易于測知病毒的標記基因。例如,讓AAV包含eGFP或另一可進行突光檢測的基因。如果AAV包含CMV-eGFP，當將由改變的親代AAV衣殼產(chǎn)生的病毒以感染復數(shù)IO4轉(zhuǎn)導293細胞時，轉(zhuǎn)導效率大于全部細胞GFP熒光的5%時表示有功能，其中，所述細胞以感染復數(shù)20用野生型人5型腺病毒預處理2小吋。
適宜的是，文庫由至少三種或至少四種功能性AAV衣殼序列組成，所述序列代表至少兩種不同的分化體。優(yōu)選地，文庫包含各代表性分化體的至少兩個序列。在某些實施方案中提供了三個、四個、五個、六個或更多的分化體。
“分化體”指基于AAV vpl氨基酸序列比對,經(jīng)鄰接算法、自展值(Bootstrapvalue) 為至少75% (至少1000次復制)確定，并且泊松校正距離不大于O. 05的在系統(tǒng)發(fā)生上彼此相關(guān)的ー組AAV。
文獻中有關(guān)于鄰接算法(Neighbor-jioning algorithm)的詳細描述。參見,例如M. Nei 與 S. Kumar,《分子進化與系統(tǒng)發(fā)生學》(Molecular Evolution andPylogenetics)(牛津大學出版社，紐約(2000))。已有現(xiàn)成用于執(zhí)行該算法的計算機程序。例如，MEGA v2. I程序執(zhí)行改進的Nci-Goiobori方法。使用這些技術(shù)與計算機程序，以及AAV vpl衣殼蛋白序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定所選定的AAV是否包含在本文所鑒定的ー個分化體內(nèi)、另ー個分化體內(nèi)、或在這些分化體之外。
雖然分化體主要基于天然存在的AAV vpl衣殼，但并不限于天然存在的AAV。分化體可包括非天然存在的AAV，包括但不限于重組、修飾或改變、嵌合、雜交、合成、人工即其他AVV，只要這些AVV是基于AAV vpl氨基酸序列比對、用鄰接算法(自展值至少75% (至少I 000次復制))確定且泊松校正距離測量值不大于O. 05的系統(tǒng)發(fā)生上彼此相關(guān)的AAV。
所描述的AAV分化體包括分化體A (以AAVl和AAV6為代表)、分化體B (以AAV2為代表)、分化體C(以AAV2-AAV3雜交體為代表)、分化體D (以AAV7為代表)、分化體E (以AAV8為代表)與分化體F (以人AAV9為代表)。這些分化體以各自的成員一一種已知AAV血清型ー為代表。已知的AAVl和AAV6同屬于ー個分化體(分化體A)，其中包括回收自3人的4種分離株。已知的AAV3和AAV5血清型彼此顯著不同，但在本文所述的篩選中未檢測到，沒有包括于這些分化體中。
AAV 分化體的進ー步討論可見于 G. Gao 等人，J. Virol. ,78(12) :6381-6388(2004年6月)和國際專利公開號WO 2004/028817和WO 2005/033321中。后一文件還提供了新的人AAV序列,此處引用作為參考。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的文庫不包括AAV5。在另ー個實施方案中,用于本發(fā)明方法的文庫不包括AAV4。然而，在某些實施方案中，例如當親代AAV類似于AAV5時，在比對中可能需要包括該序列。
雖然可構(gòu)建包含最小數(shù)目序列的文庫，但是可通過利用包含較多序列的文庫來優(yōu)化鑒定單現(xiàn)突變的效率。適宜的是，所述文庫包含最少四個序列，代表至少兩個分化體。優(yōu)選地，該文庫中，各分化體各自有至少兩種代表序列。在一個實施方案中，該文庫包含超過100個AAV序列。在另ー個實施方案中，該文庫包含至少3到100個AAV序列。在又ー個實施方案中，該文庫包含至少6到50個AAV序列。
適用于本發(fā)明功能性文庫的AAV包含，例如AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其他已描述的序列，[G. Gao 等人，Proc Natl. Acad Sci. , 100(10) :6081-6086 (2003 年 5月13日)；國際專利公開號WO 2004/042397和W02005/033321)]。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇其他AAV，例如使用國際專利公開號WO 03/093460Α1(2003年11月13日)和美國專利申請公開號2003-0138772A1 (2003年7月24日)描述的方法所分離的AAV。
根據(jù)本發(fā)明，所述文庫內(nèi)的所述至少三個序列在衣殼序列全長比對中至少有85%同一,I"生。
蛋白質(zhì)全長或其片段的氨基酸序列的“同一性百分比) ”可容易地確定。適宜的是，片段長度至少為大約8個氨基酸，也可長達大約700個氨基酸。通常，當提及兩種不同的腺相關(guān)病毒之間的“同一性”、“同源性”或“相似性”吋，“同一性”、“同源性”或“相似性”是參照進行“比對”的序列確定的?！氨葘Α毙蛄谢颉氨葘Α敝高@樣的多核酸序列或蛋白 質(zhì)(氨基酸)序列，它們與參考序列相比通常包含堿基或氨基酸缺失或增加的校正。
可使用各種公知或市售的多序列比對程序進行比對。用于氨基酸序列比對的程序有例如:“Clustal X，，、“MAP”、“PMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME” 和“ Match-Box” 程序。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可視需要改變設(shè)置，但通常這些程序都以默認設(shè)置使用?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員也可采用能夠象上述算法和程序一祥得出同一性述評或進行比對的其他算法和計算機程序。參見，例如J. D. Thomson等人，Nucl. Acids. Res.多序列比對的綜合比較(A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignmentsノ，，, 27 (13)2682-2690(1999)。
也有用于核酸序列的多序列比對程序。這種程序的實例包括通過因特網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器可得的“W串(Clustal W)”、“CAP序列組件”、“MAP”和“MEME”。這些程序的其他來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的?；蛘撸部墒褂肰ector NTI實用程序。還有許多本領(lǐng)域已知的算法也可用于測量核苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的算法。作為另ー個實例，可使用GCG 6. I版中的程序Fasta 來比較多核苷酸序列。Fasta 可得出查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區(qū)域的對比和序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6. I版提供的默認參數(shù)(字長為6和用于計分矩陣的NOPAM系數(shù))用Fasta 來確定核酸序列之間的序列同一性百分比，該程序此處引用作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，將被疑包含單現(xiàn)突變的靶或親代AAV衣殼序列與文庫的AAV衣殼序列進行比較。使用AAV衣殼的全長vpl蛋白序列比對進行該比較。
當AAV序列對齊時，對于選定的氨基酸位點，如果文庫中所有AAV在此具有相同的氨基酸殘基(即是完全保守的)而親代AAV具有與此不同的氨基酸殘基，則鑒定到單現(xiàn)突變。
一般地，當以AAV衣殼vpl蛋白為基礎(chǔ)來進行比對時，該比對包含了如此測得的與參比AAV序列(例如AAV2)相比的插入和缺失，氨基酸殘基的編號是基于該比對產(chǎn)生的基準標度(reference scale)。但是，任何給定的AAV序列都可能比基準標度少如干氨基酸殘基。在本發(fā)明中，當描述親代AAV和參考文庫的序列吋，術(shù)語“相同的位點”或“相應的位點”指相對于比對所用的基準標度，各序列氨基酸內(nèi)相同編號殘基處的氨基酸。但是，在比對之外，各AAV vpl蛋白質(zhì)內(nèi)的這些氨基酸可能在不同編號的殘基處。
可選地，可用核酸比對進行本發(fā)明方法，并將編碼不同氨基酸的密碼子(即非同義密碼子)鑒定為單現(xiàn)突變。當親代AAV中給定密碼子的核酸序列雖然與文庫中該密碼子的序列不同，但編碼的氨基酸相同時，這些不同的密碼子序列是同義密碼子而非單現(xiàn)突變。
根據(jù)本發(fā)明，包含單現(xiàn)突變的親代AAV被改變?yōu)槠渲械膯维F(xiàn)突變殘基被替換為文庫中AAV的保守氨基酸殘基。
可使用常規(guī)的定點誘變技術(shù)對可變氨基酸的密碼子進行上述置換。一般地，使用僅包括必須步驟的定點誘變來獲得想要的保守氨基酸殘基的密碼子。這樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可使用公開的方法和/或市售的試劑盒來實行(例如可以從Stratagene和Promega獲得)?？稍贏AV基因組序列上實行定點誘變。為了方便起見可用載體(例如質(zhì)粒骨架)攜帯AAV序列?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)來改變親代AAV?！?br>親代AAV可具有多于ー個的單現(xiàn)突變，例如兩個、三個、四個、五個、六個或更多。但是，可能在ー個單現(xiàn)突變校正之后就觀察到功能上的改善。在親代AAV攜帯多個單現(xiàn)突變的實施方案中，可以每次改變ー個單現(xiàn)突變，隨后測定修正AAV是否最強了想要的功能?；蛘?，可在改變多個單現(xiàn)突變后測定想要的功能是否增強。
當親代AAV包含多個單現(xiàn)突變時，即使第一個單現(xiàn)突變改變后就觀察到了功能的改善，仍可以通過改變其余的單現(xiàn)突變來優(yōu)化功能。
一般地，根據(jù)本發(fā)明的方法改變了一個或多個單現(xiàn)突變的親代AAV通過將AAV包裝成AAV顆粒來測定其功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些方法，參見，例如如上引用的G. Gao等人,Proc Natl Acad Sci. ;Sambrook 等人,分子克隆實驗室手冊' (Molecular Cloning A Laboratory Manual),冷泉港出版社(冷泉港，紐約)。
這些改變的AAV具有根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的新的衣売，并就其功能接受測定。本文描述了測定AAV功能的適當方法，包括，例如產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶(DNAse)保護顆粒能力、體外細胞轉(zhuǎn)導效率和/或體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。適宜的是，與親代AAV的功能相比，本發(fā)明改變的AAV具有足夠數(shù)目的單現(xiàn)突變被改變從而增強了這些特征性功能中ー項或全部。
II.本發(fā)明的新AAV
本發(fā)明進一歩提供了預測新AAV是否有功能的方法。該方法包含使用本發(fā)明的單現(xiàn)突變方法和鑒定選定AAV序列中單現(xiàn)突變的缺失，即沒有單現(xiàn)突變的AAV
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了選擇AAV用于產(chǎn)生載體的方法。該方法包括選擇待分析的親代AAV衣殼序列，并在親代AAV衣殼序列和功能性AAV衣殼序列文庫的比對中鑒定親代AAV衣殼上單現(xiàn)突變的缺失。一旦確定選定AAV衣殼沒有單現(xiàn)突變，則該AVV可根據(jù)已知技術(shù)用來產(chǎn)生載體。
當術(shù)語“基本同源性”或“基本相似性”用于核酸或其片段時意味著當與另ー核酸(或其互補鏈)進行包含適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔У淖罴驯葘r，比對序列的至少約95%到99%具有核苷酸序同一性。優(yōu)選在全長序列、或其開放讀碼框、或其他至少長15個核苷酸的合適片段上具有上述同源性。本文描述了合適片段的實例
文中用于核酸序列吋，術(shù)語“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指在最佳匹配比對中，兩條序列的殘基相同。序列同一性比較的長度可以是基因組全長、基因編碼序列的全長，或需要至少約500到5000個核苷酸的片段。然而，也可能要求較小片段之間的同一性，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20到24個核苷酸、至少約28到32個核苷酸、至少約36或更多核苷酸的片段。
當術(shù)語“基本同源性”或“基本相似性”用于描述氨基酸或其片段時意味著當與另一氨基酸(或其互補鏈)進行包含適當?shù)陌被岵迦牖蛉笔У淖罴驯葘r，對比序列的至少約95%到99%具有氨基酸序列同一性，在某些實施方案中，對比序列中的約97%具有同一性。優(yōu)選在全長序列，或其蛋白(例如，cap蛋白、rep蛋白)或其至少8個氨基酸、或更理想至少15個氨基酸長度的片段上具有上述同源性。本文描述了合適片段的實例。
術(shù)語“高度保守的”表示至少80%的同一性，優(yōu)選至少90%的同一性，更優(yōu)選超過97%的同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域已知的算法和程序容易地確定同一性。
術(shù)語“血清型”是指具有衣殼的AAV在血清學上不同于其他AAV血清型區(qū)別。血 清學區(qū)別是基于該AAV的抗體與其他AVV沒有交叉反應來確定的。交叉反應性通常用中和抗體試驗測定。為了進行該試驗，使用腺相關(guān)病毒在兔子或其他合適動物模型中產(chǎn)生抗特定AAV的多克隆血清。在該試驗中，隨后測試所產(chǎn)生的特定AAV的抗血清中和相同(同源)或異源AAV的能力。將達到50%中和作用的稀釋度作為中和抗體滴度。如果就兩種AAV而言，異源滴度除以同源滴度之商的倒數(shù)小于16，則此兩種載體被認為是相同的血清型。相反，如果異源滴度與同源滴度之比的倒數(shù)是16或更大，則這兩種AAV被認為是不同的血清型。
在另外的的實施方案中，本發(fā)明提供了具有新的衣殼的AAV，包括rh. 20、rh. 32/33、rh. 39、rh. 46、rh. 73 和 rh. 74。rh. 20 的序列具有 SEQ ID NO 1 的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO 1具有95-99%同一性的序列。rh. 32/33的衣殼具有SEQ IDNO 2的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO :2具有95-99%同一性的序列。rh. 39的衣殼具有SEQ IDNO 3的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO 3具有95-99%同一性的序列。rh. 46的衣殼具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO :4具有95-99%同一性的序列。rh. 73的衣殼具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列或與全長SEQ IDNO :5具有95-99%同一性的序列。rh. 74的衣殼具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO 6具有95-99%同一性的序列。優(yōu)選地，這些新AAV衣殼序列的同一性達到使它們沒有任何單現(xiàn)突變的程度。新AAV序列見序列表。
在又一個實施方案中，本發(fā)明的新AAV序列包括經(jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV衣殼蛋白和編碼這些衣殼蛋白的序列。適當?shù)慕?jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV序列的實例包括AAV6. I、AAV6. 2、AAV6. I. 2、rh. 8R、rh. 48. I、rh. 48. 2、rh. 48. I. 2、hu. 44R1、hu. 44R2、hu. 44R3、hu. 29R、ch. 5Rl、rh. 67,rh. 54,hu. 48Rl、hu. 48R2 和 hu. 48R3。例如，經(jīng)單現(xiàn)突變校正的 AAV6包括AAV6. I、AAV6. 2和AAV6. 12，它們顯示了與親代AAV6序列相比明顯的功能改善。
特別理想的蛋白質(zhì)包括由如前所述鑒定的核苷酸序列所編碼的AAV衣殼蛋白。所述AAV衣殼由vpl、vp2和vp3這三種蛋白質(zhì)組成，它們互為剪接變體。衣殼蛋白的其他理想的片段包括位于高變區(qū)(HVR)之間的恒定區(qū)和可變區(qū)。衣殼蛋白的其他理想的片段包括HVR本身。
一種開發(fā)用于確定AAV2中序列歧變區(qū)域的算法得出了 12個高變區(qū)(HVR)，其中的5個與先前所述的四個可變區(qū)重疊或是其一部分(Chiorini等人，J. Virol. , 73 1309-19(1999) ;Rutledge等人，J. Virol. ,72 :309-319)。使用該算法和/或本文所描述的比對技術(shù)，確定了新AAV血清型的HVR。例如，HVR位于如下位置HVR1，aal46_152 ；HVR2,aal82-186 ；HVR3, aa262_264 ；HVR4, aa381_383 ；HVR5, aa450_474 ；HVR6, aa490_495 ；HVR7,aa500-504；HVR8, aa514-522；HVR9, aa534_555；HVR10, aa581-594；HVRlI, aa65 8-667 ;以及HVR12，aa705-719 [該編號系統(tǒng)是基于使用AAV2vpl作為參考點的比對]。使用ClustalX程序及其默認設(shè)置，或使用其他市售或公知的比對程序及其默認設(shè)置(如本文所述的那些)來進行本文的比對，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定本發(fā)明的新AAV衣殼的相應片段。
適宜的是，片段至少長8個氨基酸。但是，也可方便地采用其他所需長度的片段?？赏ㄟ^重組或其他合適的方法例如化學合成來產(chǎn)生這樣的片段。
本發(fā)明進一歩提供了使用本文所提供的序列信息鑒定的其他AAV序列。例如，鑒于本文所提供的序列，可使用基因組步移技術(shù)(genome walkingtechnology) (Siebert等人，1995, Nucleic Acid Research, 23 :1087-1088, Friezner-Degen 等人，1986, J.Biol.Chem. 261 :6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)來分離感染性序列?；?因組步移技術(shù)尤其適合于鑒定和分離與本發(fā)明方法所鑒定的新序列鄰近的序列。基于本文所提供的新AAV衣殼序列和rep序列，該技術(shù)還可用于分離新AAV的反向末端重復(ITR)。
可由本發(fā)明的AAV核酸序列來表達新的AAV氨基酸序列、肽和蛋白質(zhì)。另外，也可通過本領(lǐng)域已知的其他方法來產(chǎn)生這些氨基酸序列、肽和蛋白質(zhì)，所述方法包括例如化學合成、其他合成方法或其他方法?？墒褂枚喾N方法容易地產(chǎn)生本文提供的任一 AAV衣殼序列。
合適的生產(chǎn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參見，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊' (Molecular Cloning A Laboratory Manual),冷泉港出版社(冷泉港，紐約)?；蛘?，還可通過眾所周知的固相肽合成法(Merri fie Id, J. Am. Chem. Soc, 85 2149(1962) ;Stewart 和 Young,固相妝合成(Solid Phase PeptideSynthesis) (Freeman,舊金山，1969)，第27-62頁)來合成肽。這些及其他適當?shù)纳a(chǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
可通過各種合適的方法生產(chǎn)本發(fā)明的序列、蛋白質(zhì)和片段，包括重組生產(chǎn)、化學合成或其他合成方法。這種生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
III.具有新AAV衣殼的rAAV的生產(chǎn)
本發(fā)明包括在按照本發(fā)明方法鑒定單現(xiàn)突變后通過突變產(chǎn)生的新的AAV衣殼序列。本發(fā)明進ー步包括新的AAV rh. 20,rh. 32/33,rh. 39,rh. 46,rh. 73和rh. 74衣殼序列(SEQ ID No :1-6)。
在另ー個方面，本發(fā)明提供了利用了本發(fā)明的新AAV序列(包括其片段)的用于產(chǎn)生將異源基因或其他核酸序列遞送至靶細胞的病毒載體的分子。
本發(fā)明含有AAV序列的分子包括有可遞送至宿主細胞的各種遺傳元件(載體)，例如能夠傳送所帶序列的裸DNA、質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、附加體、非病毒遞送載體中的蛋白質(zhì)(如基于脂質(zhì)的運載體)、病韋等。
選定載體可通過各種合適的方法遞送，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體遞送、膜融合技術(shù)、高速DNA包被小球、病毒感染與原生質(zhì)體融合。用于構(gòu)建本發(fā)明這一方面實施方式的方法是核酸操作領(lǐng)域(包括遺傳工程、重組工程與合成技木)的技術(shù)人員已知的。參見，例如Sambrook 等，分子克隆實驗室手冊' (MolecularCloning A Laboratory Manual),冷泉港出版社，冷泉港，紐約。
在一個實施方案中，本發(fā)明的載體含有編碼本發(fā)明的AAV衣殼或其片段的序列及其他元件。在另ー個實施方案中，本發(fā)明的載體至少含有編碼AAV rep蛋白或其片段的序列。任選地，本發(fā)明的載體可含有AAV cap和rep蛋白。在既有AAVrep又有cap的載體中，AAV rep和AAV cap序列可來源于同一分化體的AAV?；蛘?，本發(fā)明提供含有來自不同AAV的rep序列和cap序列載體。在一個實施方案中，rep和cap序列由彼此獨立的來源(例如分開的載體，或宿主細胞和載體)表達。在另ー個實施方案中，:rep序列與來自不同AAV的cap序列框內(nèi)融合形成嵌合AAV載體。任選地，本發(fā)明的載體是包裝在本發(fā)明的AAV衣殼中的載體。這些載體與本文所述的其他載體可進ー步包含含有選定轉(zhuǎn)基因的小基因，轉(zhuǎn)基因兩側(cè)是AAV5, ITR和AAV3, ITR0
因此,在一個實施方案中,本文所述的載體含有編碼來自同一 AAV序列的完整AAV 衣殼的核酸序列?；蛘?，這些載體含有編碼人造衣殼的序列，所述人造衣殼含有與異源AAV或非AAV衣殼蛋白(或其片段)融合的經(jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV衣殼的ー個或多個片段。這些人造衣殼蛋白選自經(jīng)單現(xiàn)突變校正的衣殼的非連續(xù)部分或選自其他AAV衣殼。這些改變的目的是為了増加表達、產(chǎn)量和/或改善選定表達系統(tǒng)中的純化，或為了其他目的(例如改變趨性或修改中和抗體表位)。
本文所描述的載體例如質(zhì)粒可用于各種目的，但特別適用于產(chǎn)生含有衣殼的rAAV,所述衣殼包含AAV序列或其片段。本文詳細描述了這些載體,包括rAAV、它們的元件、構(gòu)建體和應用。
在一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生具有本發(fā)明新AAV衣殼的重組腺相關(guān)病毒(AAV)的方法。該方法涉及培養(yǎng)宿主細胞,該宿主細胞含有如本文所定義的編碼本發(fā)明新AAV衣殼蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重復(ITR)和轉(zhuǎn)基因組成的小基因；與足夠的輔助功能因子以將小基因包裝進AAV衣殼蛋白。
在宿主細胞內(nèi)培養(yǎng)將AAV小基因包裝進AAV衣殼所必需的成分可以瞬時性地(intranse)提供給宿主細胞。或者，由已經(jīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法改造而含有一種或多種必需成分的穩(wěn)定宿主細胞來提供ー種或多種必需成分(例如小基因、rep序列、cap序列和/或輔助因子功能)。更適宜的是，這種穩(wěn)定的宿主細胞含有在誘導型啟動子控制下的所需成分。然而，必需成分也可在組成型啟動子的控制下。在關(guān)于適合與轉(zhuǎn)基因聯(lián)用的調(diào)節(jié)元件的討論中，本文提供了合適的誘導型和組成型啟動子的實例?；蛘?，選定的穩(wěn)定宿主細胞可含有在組成型啟動子控制下的選定成分和在一個或多個誘導型啟動子控制下的其他選定成分。例如可由293細胞(含有在組成型啟動子控制下的El輔助因子)制造穩(wěn)定的宿主細胞，但所述穩(wěn)定的宿主細胞含有在誘導型啟動子控制下的rep和/或cap蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可制備其他穩(wěn)定的宿主細胞。
產(chǎn)生本發(fā)明的rAAV所需的小基因、rep序列、cap序列和輔助因子可以各種能夠傳遞所帯序列的遺傳元件的形式遞送至包裝宿主細胞。選定的遺傳元件可通過任何適當?shù)姆椒?，包括本文所述的方法來遞送。用于構(gòu)建本發(fā)明這一方面的實施方案的方法是核酸操作(包括遺傳工程、重組工程與合成技術(shù))領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。參見，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊' (Molecular Cloning ALaboratory Manual),冷泉港出版社，冷泉港，紐約。類似地，產(chǎn)生AAV病毒粒子的方法也是眾所周知的，并且適當方法的選擇不限制本發(fā)明。參見，例如K. Fisher等人，J. Virol.，70 :520-532 (1993)與美國專利號5，478，745。
除非另有規(guī)定，本文所述的AAV ITR與其他選定AAV成分可容易地選自任一 AAV，所述AVV包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9和本發(fā)明的其他新AAV序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)容易地從AAV序列中分離這些ITR或其他AAV成分。所述AAV可分離獲得或得自學術(shù)、商業(yè)或公共來源(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas, VA)。或者，所述AAV序列可參考例如文獻或數(shù)據(jù)庫(例如，GenBank-、PubMed-等)中的已公開序列通過合成或其他適當?shù)姆椒ǐ@得。
A、小基因
小基因至少由轉(zhuǎn)基因及其調(diào)節(jié)序列和5’和3’反向末端重復(ITR)組成。在ー個 理想的實施方案中，使用了 AAV血清型2的ITR。然而，也可選擇其他適當來源的ITR。正是該小基因?qū)⒈话b進衣殼蛋白并遞送至選定的宿主細胞。
I.轉(zhuǎn)基因
轉(zhuǎn)基因是編碼感興趣的多肽、蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物，并與其側(cè)翼的載體序列異源的核酸序列。核酸編碼序列以允許轉(zhuǎn)基因在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達的方式操作性地與調(diào)節(jié)組件相連。
轉(zhuǎn)基因序列的組成取決于所得到的載體的用途。例如ー類轉(zhuǎn)基因序列包含報道序列，該序列在表達后產(chǎn)生可檢測的信號。這種報道序列包括但不限于編碼以下物質(zhì)的DNA序列β -內(nèi)酰胺酶、β -半乳糖苷酶(LacZ)、堿性磷酸酶、胸腺激酶、緑色熒光蛋白(GFP)、增強型GFP(EGFP)、氯霉素こ酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶、膜結(jié)合蛋白(如CD2、CD4、CD8)、流感血凝素蛋白和本領(lǐng)域熟知的存在高親和カ抗體或可通過常規(guī)方法產(chǎn)生所述抗體的其他物質(zhì)，以及含有膜結(jié)合蛋白的融合蛋白，該膜結(jié)合蛋白適當?shù)嘏c血凝素或Myc等物質(zhì)的抗原標記區(qū)融合。
當這些編碼序列與驅(qū)動其表達的調(diào)節(jié)元件相關(guān)聯(lián)時，可提供由常規(guī)方法檢測的信號，所述常規(guī)方法包括酶法、放射顯影法、比色法、熒光法或其他光譜測定、熒光激活細胞分選測定與免疫測定，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)和免疫組織化學。例如當標記序列是LacZ基因時，通過測定β_半乳糖苷酶的活性來檢測攜帯信號的載體的存在。當轉(zhuǎn)基因是綠色熒光蛋白或熒光素酶時，攜帯信號的載體可用光度計通過顏色或光的產(chǎn)生來觀測。
然而，理想地，轉(zhuǎn)基因是編碼具有生物或醫(yī)藥用途的產(chǎn)物的非標記序列，所述產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)、肽、RNA、酶、顯性陰性突變體或催化性RNA。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化性RNA、siRNA、小發(fā)夾RNA、反式剪接RNA和反義RNA。有用的RNA序列的ー個例子是抑制或消除靶核酸序列在經(jīng)處理的動物中表達的序列。通常，合適的靶序列包括腫瘤靶點和病毒疾病。例如后文免疫原部分所述的腫瘤靶點和病毒。
轉(zhuǎn)基因可用于校正或減少基因缺陷，包括正?；虻谋磉_低于正常水平的缺陷或功能基因產(chǎn)物不表達的缺陷?；蛘?，轉(zhuǎn)基因可為細胞提供本來不在該細胞類型或該宿主中表達的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因序列的優(yōu)選類型編碼在宿主細胞中表達的治療性蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明進ー步包括使用多種轉(zhuǎn)基因。在某些情況下，可采用不同的轉(zhuǎn)基因編碼ー個蛋白質(zhì)的各個亞基，或編碼不同的肽或蛋白質(zhì)。當編碼蛋白質(zhì)亞基的DNA很大時這尤其適合，所述蛋白質(zhì)例如免疫球蛋白、血小板衍生的生長因子或抗肌萎縮蛋白。為使細胞產(chǎn)生多亞基蛋白質(zhì)，用各自含有各不同亞基的重組病毒感染細胞?；蛘?，蛋白質(zhì)的不同亞基可由同一轉(zhuǎn)基因編碼。在這種情況下，單個轉(zhuǎn)基因包含編碼所有亞基的DNA，而各亞基的DNA由內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)隔開。當編碼每個亞基的DNA較小時，例如編碼亞基的DNA與IRES的總體積小于5千堿基對(5kb)時，這尤其適合。作為IRES的替代，DNA可用編碼在翻譯后階段自我切割的2A肽的序列隔開。參見，例如M. L. Donnelly等人，J. Gen. Virol.，78(第一部分):13-21 (1997 年 I 月)；Furler, S.等人，Gene Ther. ,8(11) :864-873 (2001 年 6 月)；Klump H.等人，Gene Ther. ,8(10) :811-817 (2001 年 5 月)。該 2A 肽明顯小于 IRES，使得其非常適合用于當空間成為制約因素的時候。更常見的是，當轉(zhuǎn)基因較大、由多個亞基組成、或兩個轉(zhuǎn)基因共遞送時，允許共用攜帯所需轉(zhuǎn)基因或亞基 的rAAV以使得它們在體內(nèi)多聯(lián)化形成単一的載體基因組。在這種實施方案中，第一 AAV可攜帯表達ー個轉(zhuǎn)基因的表達盒，第二 AAV可攜帯用于在宿主細胞中共表達的不同轉(zhuǎn)基因的表達盒。然而，選定的轉(zhuǎn)基因可編碼任何生物活性產(chǎn)物或其他產(chǎn)物，例如研究所需的產(chǎn)物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇適當?shù)霓D(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的選擇不限制本發(fā)明。
2.調(diào)節(jié)元件
除了以上就小基因而言的主要元件以外，載體還包含常規(guī)控制元件，所述常規(guī)控制元件以允許轉(zhuǎn)基因在以下所述細胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達的方式操作性地與轉(zhuǎn)基因相連，所述細胞為本發(fā)明產(chǎn)生的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或病毒所感染。本文的“操作性相連”的序列包括與感興趣的基因毗連的表達控制序列和以反式(in trans)起作用或在一定距離開外控制感興趣基因的表達的控制序列。
表達控制序列包括適宜的轉(zhuǎn)錄起始子、終止子、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信號；穩(wěn)定細胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(即=Kozak共有序列)；增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及在需要時增強編碼產(chǎn)物分泌的序列。許多表達控制序列，包括天然的、組成型的、誘導型的和/或組織特異性的啟動子是本領(lǐng)域已知并可利用的。
組成型啟動子的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒Rous肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子(任選連有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選連有CMV增強子)[參見，例如Boshart等人，Cell, 41 :521-530 (1985) ]、SV40啟動子、ニ氫葉酸還原酶啟動子、β _肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EFl啟動子(Invitrogen)。誘導型啟動子能調(diào)節(jié)基因表達，并可由外源提供的化合物、環(huán)境因素(例如溫度)、或特定生理狀態(tài)調(diào)節(jié)，所述狀態(tài)例如例如急性期、細胞的特定分化狀態(tài)，或僅在正在復制的細胞中起效。誘導型啟動子和可誘導系統(tǒng)可從多種商業(yè)來源獲得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已知的還有許多其他系統(tǒng)，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。受外源化合物調(diào)節(jié)的誘導型啟動子的實例包括鋅-誘導的金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-誘導的小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(tǒng)[國際專利公開號WO 98/10088]、蛻皮素昆蟲啟動子[No等人，Proc. Natl. Acad. Sci.美國，93 :3346-3351 (1996)]、四環(huán)素阻抑系統(tǒng)[Gossen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.美國，89 :5547-5551 (1992)]、四環(huán)素誘導系統(tǒng)[Gossen 等人,Science, 268 :1766-1769 (1996),也參見 Harvey 等人，Curr. Opin. Chem.Biol.，2 :512-518 (1998)]、RU486-誘導系統(tǒng)[Wang 等人，Nat. Biotech.，15 :239-243(1997)與Wang等人，Gene Ther.，4 :432-441 (1997)]和雷帕霉素-誘導系統(tǒng)[Magari等人，J. Clin. Invest. ,100 :2856-2872 (1997)]。可用于本發(fā)明的其他誘導型啟動子類型是由特定的生理狀態(tài)調(diào)節(jié)的那些，所述狀態(tài)例如溫度、急性期、細胞的特定分化狀態(tài)，或僅在正在復制的細胞中起效。
在另ー個實施方案中使用了轉(zhuǎn)基因的天然啟動子。當需要轉(zhuǎn)基因的表達模擬天然表達時，可優(yōu)選天然啟動子。當轉(zhuǎn)基因的表達必須暫時性或發(fā)展性方式調(diào)節(jié)、或以組織特異性的方式調(diào)節(jié)或響應特定的轉(zhuǎn)錄刺激時，可使用天然啟動子。在另外的實施方案中，也可使用其他天然表達控制元件，例如增強子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列以模擬天然表達。
轉(zhuǎn)基因的另ー實施方案包含操作性連接于組織特異性啟動子的基因。例如，如果需要在骨骼肌中表達，應該使用在肌肉中有活性的啟動子。這包括編碼以下產(chǎn)物的基因的啟動子骨骼β_肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、抗肌萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性 高于天然啟動子的合成肌肉啟動子(參見=Li等人，Nat. Biotech. , 17 :241-245 (1999))。已知的組織特異性啟動子的實例有肝特異性的(白蛋白，Miyatake等人，J. Virol. ,71 5124-32(1997);こ肝病毒核心啟動子，Sandig 等人，Gene Ther.，3 :1002-9 (1996) :α-胎蛋白(AFP), Arbuthnot 等人，Hum. GeneTher. , 7 :1503-14 (1996))、骨的骨·丐蛋白(Stein 等人，Mol. Biol. Rep.，24 185-96 (1997));骨唾液蛋白(Chen 等人，J. Bone Miner. Res.，11 :654-64(1996))、淋巴細胞特異性的(CD2, Hansal 等人，J. Immunol. 161 :1063-8(1998);免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈)、神經(jīng)元特異性的(例如神經(jīng)元-特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Andersen 等人,Cell. Mol. Neurobiol. ,13 :503-15 (1993))、神經(jīng)絲輕鏈基因(Piccioli等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，美國，88 :5611-5 (1991))，以及神經(jīng)元-特異性 vgf 基因(Piccioli 等人，Neuron, 15 :373-84(1995)))等。
任選地，攜帯有治療用途的轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒還可含有可選擇標記基因或報道基因，例如編碼遺傳霉素抗性、潮霉素抗性或嘌呤霉素(purimycin)抗性等的序列。這種可選擇的報道基因或標記基因(優(yōu)選位于有待本發(fā)明方法拯救的病毒基因組之外)，例如氨芐青霉素抗性，可用來指示細菌細胞中存在質(zhì)粒。質(zhì)粒的其他成分可包括復制起點?？赏ㄟ^常規(guī)方法選擇這些和其他啟動子與載體元件，許多這種序列可獲得[參見，例如Sambrook等人，以及本文引用的參考文獻]。
為援引方便，轉(zhuǎn)基因、啟動子/增強子與5'和3' AAV ITR的組合在此稱為“小基因”。鑒于本發(fā)明的教導，憑借常規(guī)技術(shù)即可設(shè)計這種小基因。
3.將小基因遞送至包裝宿主細胞
可用任何遞送至宿主細胞的適當載體例如質(zhì)粒來攜帯小基因。用于本發(fā)明的質(zhì)?？筛脑鞛檫m合于在原核細胞、哺乳動物細胞或這ニ種細胞中復制和整合(任選)的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒(或其他攜帶5' AAV ITR-異源分子-3' AAV ITR的載體)含有允許小基因在真核細胞和/或原核細胞中復制的序列和用于這些系統(tǒng)的選擇標記?？蛇x擇標記基因或報道基因可包括編碼遺傳霉素抗性、潮霉素抗性或嘌呤霉素抗性等的序列。這些質(zhì)粒還可含有可用來指示細菌細胞中存在載體的某些可選擇報道基因或標記基因，例如氨芐青霉素抗性。質(zhì)粒的其他成分可包括復制起點和擴增子，例如使用Epstein Barr病毒核抗原的擴增子系統(tǒng)。該擴增子系統(tǒng)或其他類似的擴增子成分允許細胞中高拷貝附加型復制。攜帯小基因的分子優(yōu)選轉(zhuǎn)染入其可暫時存在的細胞中。或者，小基因(攜帯5' AAV ITR-異源分子-3' AAV ITR)可穩(wěn)定地整合進宿主細胞的基因組，或進入染色體或作為附加體。在某些實施方案中，小基因可以任選地以頭-對-頭、頭-對-尾或尾-對-尾的多聯(lián)體形式多拷貝存在。合適的轉(zhuǎn)染技術(shù)是已知的，并可容易地用于將小基因遞送至宿主細胞。
通常，當通過轉(zhuǎn)染遞送含有小基因的載體時，通常將約5yg-100yg DNA、約10 μ g-50 μ g DNA遞送約I X IO4-I X IO13個細胞或約I X IO5個細胞。然而，考慮到諸如所選擇的載體、遞送方法和所選擇的宿主細胞等因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)整載體DNA量與宿主細胞之比。
B. R印與Cap序列
除了小基因以外，宿主細胞還含有在宿主細胞中驅(qū)動本發(fā)明的新AAV衣殼蛋白 (或含有其片段的衣殼蛋白)表達的序列和與小基因中的AAV ITR相同來源或來自交叉互補來源的rep序列。AAV cap和rep序列可彼此獨立地由前述AAV源獲得,并可以前述本領(lǐng)域人員已知的任何方式引入宿主細胞。此外，在進行AAV載體假型包裝時，可用不同的AAV來源(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)提供編碼各種主要 rep蛋白的序列。例如rep78/68序列得自AAV2，而rep52/40序列得自AAV8。
在一個實施方案中，宿主細胞穩(wěn)定地含有在合適的啟動子(例如前文所述)控制下的衣殼蛋白。在該實施方案中，衣殼蛋白最好在誘導型啟動子的控制下表達。在另ー個實施方案中，衣殼蛋白以轉(zhuǎn)入方式(in trans)提供至宿主細胞。當以轉(zhuǎn)入方式遞送至宿主細胞時，衣殼蛋白可通過含有指導選定衣殼蛋白在宿主細胞中表達所需序列的質(zhì)粒遞送。當以轉(zhuǎn)入方式遞送至宿主細胞吋，攜帯衣殼蛋白的質(zhì)粒最好還攜帶包裝rAAV所需的其他序列，例如rep序列。
在另ー個實施方案中，宿主細胞穩(wěn)定地含有在合適的啟動子(如前文所述)控制下的rep序列。在該實施方案中，主要rep蛋白最好在誘導型啟動子的控制下表達。在另一個實施方案中，rep蛋白以轉(zhuǎn)入方式(in trans)提供至宿主細胞。當以轉(zhuǎn)入方式遞送至宿主細胞時，rep蛋白可通過含有指導選定的rep蛋白在宿主細胞中表達所需序列的質(zhì)粒遞送。當以轉(zhuǎn)入方式遞送至宿主細胞吋，攜帯衣殼蛋白的質(zhì)粒也最好攜帯包裝rAAV所需的其他序列，例如rep和cap序列。
因此，在一個實施方案中，rep和cap序列可以位于ー個核酸分子上轉(zhuǎn)染入宿主細胞，并且作為附加體穩(wěn)定地存在于細胞中。在另ー個實施方案中，:rep和cap序列穩(wěn)定地整合進細胞的染色體。在另ー個實施方案中，rep和cap序列在宿主細胞中瞬時表達。例如，用于這種轉(zhuǎn)染的有用核酸分子從5’到3’含有啟動子、插在啟動子與rep基因序列起始位點之間可選的間隔子、AAV rep基因序列和AAV cap基因序列。
任選地，!·印和/或cap序列可提供于載體上，該載體含有待引入宿主細胞的其他DNA序列。例如載體可含有包含小基因的rAAV構(gòu)建體。載體可含有ー個或多個編碼輔助因子功能例如腺病毒蛋白El、E2a和E4 0RF6的基因與VAI RNA的基因。
用于該構(gòu)建體的啟動子優(yōu)選本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或前文所述的特征組成型、誘導型或天然啟動子。在一個實施方案中，使用AAV P5啟動子序列。選擇AAV來提供這些序列不是對本發(fā)明的限制。
在另ー個優(yōu)選的實施方案中，rep的啟動子是誘導型啟動子，例如前文就轉(zhuǎn)基因調(diào)節(jié)元件所述的那些。R印表達的優(yōu)選的啟動子之ー是T7啟動子。用包含由T7啟動子調(diào)節(jié)的rep基因和cap基因的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化組成性或誘導性表達T7聚合酶的細胞。參見1998年3月12日公開的國際專利公開號WO 98/10088。
在設(shè)計載體中，間隔子是可選元件。間隔子是插在啟動子和rep基因的ATG起始位點間的DNA序列。間隔子可具有任何所需的設(shè)計；即，它可是隨機的核苷酸序列，或者可編碼ー個基因產(chǎn)物，例如標記基因。間隔子可含有通常包括起始/終止和PolyA位點的基因。間隔子可以是來自原核生物或真核生物的非編碼DNA序列、重復非編碼序列、無轉(zhuǎn)錄控制的編碼序列或有轉(zhuǎn)錄控制的編碼序列。間隔子序列的兩個典型來源是噬菌體梯序列或酵母梯序列，二者可購自例如Gibco或Invitrogen等。間隔子可是任何大小的,只要足以降低rep78和rep68基因產(chǎn)物的表達，使rep52、rep40和cap基因產(chǎn)物的表達處于正常水平。因此，間隔子的長度范圍約為IObp-IO. Okbp，優(yōu)選約100bp-8. Okbp0為減少重組的可能性，間隔子長度優(yōu)選小于2kbp ;然而，本發(fā)明不限于此。
雖然提供和cap的分子可能瞬時(即通過轉(zhuǎn)染)存在于宿主細胞中，但優(yōu)選rep和cap蛋白之一或二者與控制其表達的啟動子在宿主細胞中穩(wěn)定地表達，例如作為附加體或通過整合進宿主細胞染色體。用于構(gòu)建本發(fā)明這方面內(nèi)容的實施方案的方法是常規(guī)遺傳工程或重組工程技術(shù)，例如前文參考文獻所述的技木。雖然本說明書提供了具體的構(gòu)建體的說明性實例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本文提供的信息來選擇間隔子、P5啟動子和其他元件(包括至少ー個翻譯起始和終止信號)和任選加入的聚腺苷酸化位點，從而可選擇和設(shè)計其他合適的構(gòu)建體。
在本發(fā)明的另ー個實施方案中，可由宿主細胞穩(wěn)定地提供或cap蛋白。
C.輔助因子功能
為包裝本發(fā)明的rAAV，包裝宿主細胞還需要輔助因子功能。任選地，這些功能可由皰疹病毒提供。所需的輔助功能物最好分別由人或非人靈長類腺病毒源提供，例如前文所述的和/或得自各種來源的(包括美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas, VA(美國))。在ー個目前優(yōu)選的實施方案中，向宿主細胞提供和/或宿主細胞含有Ela基因產(chǎn)物、Elb基因產(chǎn)物、E2a基因產(chǎn)物和/或E4 0RF6基因產(chǎn)物。宿主細胞可含有其他腺病毒基因，例如VAI RNA，但這些基因不是必需的。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞中不存在其他腺病韋基因或基因功能。
“表達Ela基因產(chǎn)物的腺病毒DNA ”表示編碼Ela或其功能性部分的各種腺病毒序列。表達E2a基因產(chǎn)物的腺病毒DNA和表達E4 0RF6基因產(chǎn)物的腺病毒DNA的定義類似。腺病毒基因或其功能部分的各等位基因或其他修飾形式也包括在內(nèi)。所述修飾既包括借助常規(guī)遺傳工程或誘變技術(shù)特地引入從而以某種方式增強腺病毒功能的那些，也包括天然存在的等位變體。這些用來通過DNA操作獲得腺病毒基因功能的修飾和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
腺病毒Ela、Elb、E2a和/或E4 0RF6基因產(chǎn)物以及各種其他需要的輔助因子功能可使用各種使其在細胞中表達的方法提供。各條編碼這些產(chǎn)物的序列可各自位于單獨的載體上，或者ー個或多個基因可位于同一載體上。載體可以是本領(lǐng)域已知的或前文所述的各種載體，包括質(zhì)粒、粘粒和病毒。載體可通過本領(lǐng)域已知或前文所述的各種方法引入宿主細胞，所述方法包括轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔、脂質(zhì)體遞送、膜融合技術(shù)、高速DNA-包被小球、病毒感染與原生質(zhì)體融合等。ー個或多個腺病毒基因可穩(wěn)定地整合入宿主細胞基因組，作為附加體穩(wěn)定表達，或者瞬時表達?；虍a(chǎn)物可全部瞬時表達，包含在附加體上或穩(wěn)定整合；或者，ー些基因產(chǎn)物可穩(wěn)定地表達，而另一些瞬時表達。此外，各腺病毒基因的啟動子可彼此獨立地選自組成型啟動子、誘導型啟動子或天然腺病毒啟動子。啟動子可由生物體或細胞的特定生理狀態(tài)調(diào)節(jié)(即，分化狀態(tài)或復制或靜息細胞)或由其他方法例如外源添加因子調(diào)節(jié)。
D.宿主細胞和包裝細胞系
宿主細胞本身可選自各種生物體，包括原核(例如細菌)細胞和真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞。特別理想的宿主細胞選自特征哺乳動物種 類，包括，不限于以下細胞A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、C0S1、C0S7、BSC1、BSC40、BMT10、VER0、W138、HeLa,293細胞(表達功能性腺病毒El)、Saos, C2C12、L細胞、HT1080, HepG2和來源于哺乳動物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔子和倉鼠)的初級成纖維細胞、肝細胞和成肌細胞。選擇細胞的哺乳動物來源和哺乳動物細胞的類型(即成纖維細胞、肝細胞、腫瘤細胞等)不限制本發(fā)明。對所使用細胞的要求是它不攜帯任何除El、E2a和/或E4 0RF6以外的腺病毒基因；它不含有在rAAV產(chǎn)生過程中可導致污染病毒的同源重組的任何其他病毒基因；并且，它能被DNA感染或轉(zhuǎn)染并表達所轉(zhuǎn)染的DNA。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是在包含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的rep和cap的細胞。
用于本發(fā)明的宿主細胞之ー是用編碼rep和cap的序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并用腺病毒El、E2a和E4 0RF6 DNA和攜帯有前文所述小基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。也可類似地使用穩(wěn)定的和/或cap表達細胞系，例如B-50 (國際專利申請公開號WO 99/15685)，或美國專利號5，658，785所述的細胞系。另ー種理想的宿主細胞含有表達E4 0RF6所需的基本腺病毒DNA。使用本發(fā)明的新經(jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV cap序列還可構(gòu)建出其他細胞系。
本發(fā)明制備宿主細胞涉及諸如裝配選定的DNA序列等技木?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)實現(xiàn)這種裝配。這種技術(shù)包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等人的著作中的cDNA和基因組克隆、使用腺病毒和AAV基因組的重疊寡核苷酸序列，結(jié)合聚合酶鏈式反應、合成方法以及提供所需核苷酸序列的其他合適方法。
也可使用技術(shù)人員已知和本說明書中討論的技術(shù)將這些分子(如質(zhì)粒或病毒)引入宿主細胞。在優(yōu)選的實施方案中，使用標準轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如=CaPO4轉(zhuǎn)染或電穿孔，和/或用雜交腺病毒/AAV載體感染細胞系，所述細胞系例如人胚胎腎細胞系HEK293 ( ー種人腎細胞系，含功能性腺病毒El基因，該基因提供反式作用的El蛋白)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的是，本發(fā)明的新AAV序列可容易地經(jīng)調(diào)整而適用在上述及其他表達載體系統(tǒng)中用于體外、離體或體內(nèi)的基因遞送。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇本發(fā)明的其他AAV基因組片段用于各種rAAV和非rAAV載體系統(tǒng)。這些載體系統(tǒng)包括例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒、牛痘病毒和腺病毒系統(tǒng)等。這些載體系統(tǒng)的選擇不限制本發(fā)明。
因此，本發(fā)明進一歩提供了使用本發(fā)明的新AAV的核酸與氨基酸序列產(chǎn)生的載體。這種載體可用于多種目的，包括遞送治療性分子和用在疫苗給藥方案(vaccineregimens)中。含有本發(fā)明的新AAV衣殼的重組AAV對遞送治療性分子特別理想。含有本發(fā)明的新AAV序列的這些或其他載體構(gòu)建體可用于疫苗給藥方案，例如用于共同遞送細胞因子，或用于遞送免疫原本身。
IV.重組病毒及其應用
本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本文所述的技術(shù)來產(chǎn)生rAAV，該rAAV具有本發(fā)明AAV的衣殼或其衣殼含有本發(fā)明AAV的ー個或多個片段。在一個實施方案中，使用來自經(jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV的全長衣殼。
A.病毒的遞送
另ー方面，本發(fā)明提供了一種將轉(zhuǎn)基因遞送至宿主的方法，該方法涉及利用本發(fā)明經(jīng)單現(xiàn)突變校正的AAV (或其功能性片段)產(chǎn)生的重組病毒載體轉(zhuǎn)染或感染所選宿主細胞。用于遞送的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并不限制本發(fā)明。在ー個理想的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于AAV-介導遞送轉(zhuǎn)基因至宿主的方法。該方法涉及利用含有所選轉(zhuǎn)基因和修正衣殼蛋白的重組病毒載體轉(zhuǎn)染或感染所選宿主細胞，該轉(zhuǎn)基因在指導其表達的序列的控制下。
任選地，來自宿主的樣品可首先測定其是否含有所選AAV源(例如某血清型)的抗體。用于檢測中和抗體的各種測定方式已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這種測定的選擇不限制本發(fā)明。參見，例如Fisher等人，Nature Med. ,3(3) :306-312 (1997年3月)和ff. C. Manning 等人，Human Gene Therapy, 9 :477-485(1998 年 3 月 I 日)。該測定的結(jié)果，例如沒有某衣殼來源的特異性中和抗體，可用于確定哪種含有特定來源的衣殼蛋白的AAV載體是遞送所優(yōu)選的。
該方法的一方面，可在遞送具有本發(fā)明AAV衣殼蛋白的載體之前或之后遞送具有另ー不同AAV衣殼蛋白的載體。因此，通過rAAV載體的基因遞送可用于重復地將基因遞送至所選定的宿主細胞中。理想地，在后給予的rAAV載體攜帯與第一 rAAV載體中相同的轉(zhuǎn)基因，但在后給予的載體含有的衣殼蛋白的來源不同于第一載體(并且優(yōu)選不同的血清型)。例如如果第一載體具有經(jīng)單現(xiàn)突變校正的衣殼蛋白，在后給予的載體可具有選自其他AAV的衣殼蛋白，例如可以是另一血清型或另一分化體的AAV。
任選地，多個rAAV載體可通過共同給予多個rAAV載體用于遞送大的轉(zhuǎn)基因或多個轉(zhuǎn)基因，在體內(nèi)多聯(lián)化成單個載體基因組。在這種實施方案中，第一AAV可攜帯表達單個轉(zhuǎn)基因(或其亞基)的表達盒，第二AAV可攜帯在宿主細胞中共表達的表達第二轉(zhuǎn)基因(或不同亞基)的表達盒。第一 AAV可攜帯多順反子構(gòu)建體的第一部分(例如啟動子和轉(zhuǎn)基因，或亞基)的表達盒，第二 AAV可攜帯多順反子構(gòu)建體的第二部分(例如轉(zhuǎn)基因或亞基和polyA序列)的表達盒。多順反子構(gòu)建體的這兩個部分在體內(nèi)多聯(lián)化成共表達由第一和第二 AAV遞送的轉(zhuǎn)基因的單個載體基因組。在這種實施方案中，攜帯第一表達盒的rAAV載體和攜帯第二表達盒的rAAV載體可以包含在單個藥物組合物中來遞送。在其他實施方案中，兩個或多個rAAV載體以分開的藥物組合物來遞送，這些藥物組合物可基本上同時給藥或略有先后。
上述重組載體可按照公開的方法遞送至宿主細胞中。可將rAAV，優(yōu)選懸浮在生理相容載體中的rAAV，給予人或非人哺乳動物患者。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)病毒遞送所針對的適應癥容易地選擇適當?shù)妮d體。例如，適當?shù)妮d體包括可用各種緩沖液配制的鹽水(例如磷酸緩沖鹽水)。其他的載體例子包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡萄糖、瓊月旨、果膠、花生油、芝麻油和水。載體的選擇不限制本發(fā)明。
任選地，除rAAV和載體以外，本發(fā)明的組合物還可含有其他常規(guī)藥物組分，例如防腐劑或化學穩(wěn)定劑。適當?shù)姆栏瘎├缏却〈?、山梨酸鉀、山梨酸、ニ氧化硫、沒食子酸丙酷、對羥基苯甲酸酯類、こ基香草醛、甘油、苯酚與對氯苯酚。適當?shù)幕瘜W穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。
載體的給予量應滿足轉(zhuǎn)染細胞所需并應提供足夠的基因傳送和表達水平以提供療效而無副作用，或有醫(yī)學上可接受的生理作用，這可由醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員確定。常規(guī)的和藥學上可接受的給藥途徑包括但不限于直接遞送至目標器官(例如，肝(任選經(jīng)肝動脈)或肺)、ロ服、吸入、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、動脈內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)和其他胃腸外給藥途徑。如果需要，可多種給藥途徑聯(lián)用。
病毒載體的劑量主要取決于以下因素，例如治療的病癥、患者的年齡、體重和健康狀況，因此可依患者而改變。例如，病毒載體的人用治療有效劑量一般約為含有濃度約I X IO9-I X IO16個基因組病毒載體的O. ImL-IOOmL溶液。遞送至大器官(例如肝、肌肉、心 臟和肺)的優(yōu)選的人用劑量可約為5X 101CI-5X IO13個AAV基因組/kg，體積約為1-lOOmL。遞送至眼的優(yōu)選劑量約為5X109-5X1012份基因組拷貝，體積約為O. ImL-ImL0可調(diào)整劑量以平衡副作用和療效，并且這種劑量可根據(jù)重組載體的具體治療性用途而改變?？杀O(jiān)測轉(zhuǎn)基因的表達水平來確定給藥頻率，以獲得病毒載體，優(yōu)選含有小基因的AAV載體。任選地，可按照類似于就治療性目所述的給藥方案用本發(fā)明的組合物來免疫接種。
后文提供了用本發(fā)明的含AAV載體進行遞送的治療性產(chǎn)物和免疫原性產(chǎn)物的實例。這些載體可用于本文所述的各種治療性或接種方案。此外，按照治療性和/或接種方案所需，這些載體可聯(lián)合一種或多種其他載體或活性成分用于遞送
B.治療性轉(zhuǎn)基因
轉(zhuǎn)基因編碼的有用的治療性產(chǎn)物包括激素與生長因子和分化因子，包括但不限于胰島素、胰高血糖素、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黃體激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、促紅細胞生產(chǎn)素(EPO)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(TOGF)、胰島素生長因子I和IUIGF-I和IGF-II)、轉(zhuǎn)化生長因子α超家族中的任ー個(包括TGFa、活化素、抑制素)、或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)BMP1-15中的任ー個、生長因子中的調(diào)蛋白/神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任ー個、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白NT-3和NT-4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、neurturin、聚集蛋白、腦信號蛋白/瓦解蛋白家族的任ー個、導蛋白-1和導蛋白-2、肝細胞生長因子(HGF)、肝配蛋白、頭蛋白、sonichedgehog蛋白和酪氨酸輕化酶。
其他有用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，包括但不限干細胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-I到IL-25(包括，例如IL_2、IL-4、IL-12和IL-18)、單核細胞化學誘導蛋白、白血病抑制因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子α和β、干擾素α、β和Y、干細胞因子、flk_2/flt3配體。免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的基因產(chǎn)物也可用于本發(fā)明。這些產(chǎn)物包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合T細胞受體、單鏈T細胞受體、I類和II類MHC分子，以及經(jīng)改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因產(chǎn)物還包括補體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，例如補體調(diào)節(jié)蛋白、膜輔因子蛋白(MCP)、衰變加速因子(DAF)、CR1、CF2 和 CD59。
其他有用的基因產(chǎn)物包括激素受體、生長因子、細胞因子、淋巴因子、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)的任ー種。本發(fā)明包括膽固醇調(diào)節(jié)和/或脂質(zhì)調(diào)節(jié)的受體，包括低密度脂蛋白(LDL)受體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL)受體和清除受體。本發(fā)明也包括以下基因產(chǎn)物例如類固醇激素受體超家族的成員，包括糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體、維生素D受體和其他核受體。此外，有用的基因產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄因子，例如jun、fos、max、mad、血清效應因子(SRF)、AP_l、AP2、myb、MyoD和肌細胞生成蛋白、含有蛋白質(zhì)的ETS-盒、TFE3、E2F、ATFI、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SPI、CCAAT-盒結(jié)合蛋白、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-I)、Wilms腫瘤蛋白、ETS-結(jié)合蛋白、STAT、GATA-盒結(jié)合蛋白，例如GATA-3和翼狀螺旋蛋白的叉頭蛋白家族。
其他有用的基因產(chǎn)物包括氨甲酰合成酶I、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰こ酰こ酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α -I抗胰蛋白酶、葡萄糖-6_磷酸酶、膽色素原脫氨酶、胱硫醚合成酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙ニ酰CoA變位酶、戊ニ酰-CoA脫氫酶、胰島素、β -葡糖苷酶、丙酮酸羧酸鹽、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)序列和抗肌萎縮蛋白基因產(chǎn)物[例如小-或微-抗肌萎縮蛋白]。其他有用的基因產(chǎn)物包括可用于酶活性缺乏所導致的各種病癥例如可用于酶替代治療的酶。例如，含有甘露糖-6_磷酸的酶可用于治療溶菌酶儲存疾病(例如編碼β -葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)的基因)。
其他有用的基因產(chǎn)物包括用于治療血友病的產(chǎn)物，包括B型血友病(包括因子IX)和A型血友病(包括因子VIII及其變體，例如異ニ聚體的輕鏈和重鏈和B-缺失結(jié)構(gòu)域；美國專利號6，200, 560和美國專利號6，221，349)。因子VIII基因編碼2351個氨基酸，該蛋白具有六個結(jié)構(gòu)域，從氨基向羧基端依次指定為Al-A2-B-A3-Cl-C2[Wood等人，Nature, 312 :330 (1984) ；Vehar 等人，Nature, 312 :337 (1984)；以及 Toole 等人，Nature,342 :337 (1984)]。人因子VIII在細胞內(nèi)經(jīng)加工產(chǎn)生主要含有重鏈和輕鏈的異ニ聚體，所述重鏈含有A1、A2和B結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈含有A3、C1和C2結(jié)構(gòu)域。單鏈多肽與異ニ聚體作為無活性的前體在血漿中循環(huán)，直至在A2和B結(jié)構(gòu)域之間被凝血酶切割而激活，由此釋放出B結(jié)構(gòu)域并形成由Al和A2結(jié)構(gòu)域組成的重鏈。該蛋白質(zhì)激活的前凝血質(zhì)形式不含B結(jié)構(gòu)域。此外，在天然蛋白中，B結(jié)構(gòu)域之側(cè)的兩條多肽鏈(“a”和“b”)與ニ價鈣陽離子結(jié)合。
在一些實施方案中，小基因含有編碼10個氨基酸信號序列的因子VIII重鏈的前57個堿基對和人生長激素(hGH)聚腺苷酸化序列。在另ー實施方案中，小基因進ー步含有Al和A2結(jié)構(gòu)域，以及B結(jié)構(gòu)域N-末端的5個氨基酸，和/或B結(jié)構(gòu)域C-末端的85個氨基酸，以及A3、Cl和C2結(jié)構(gòu)域。在另外的實施方案中，編碼因子VIII重鏈和輕鏈的核酸被編碼B結(jié)構(gòu)域的14個氨基酸的42個核酸隔開并包含在單個小基因中[美國專利號6，200，560]。[0142]本文使用的治療上的有效量指可產(chǎn)生足夠量的因子VIII以降低受試對象血液凝結(jié)所需時間的AAV載體的量。通常，因子VIII水平低于正常水平的1%的嚴重血友病患者的全血凝時間大于60分鐘，而非血友病患者約為10分鐘。
本發(fā)明不限于任何具體的因子VII I序列。已經(jīng)分離和產(chǎn)生了許多因子VIII的天然和重組形式。因子VIII的天然形式和重組形式的實例見專利和科學文獻，包括美國專利號 5, 563，045 ;5，451，521 ;5，422，260 ;5，004，803 ;4，757，006 ;5，661，008 ；5，789，203 ;5，681，746 ;5，595，886 ;5，045，455 ;5，668，108 ;5，633，150 ;5，693，499 ；5，587，310 ;5，171，844 ;5，149，637 ;5，112，950 ;4，886，876 ;國際專利公開號 W094/11503,WO 87/07144, WO 92/16557, WO 91/09122, WO 97/03195, WO 96/21035 和 WO 91/07490 ;歐洲專利申請?zhí)?EP O 672 138，EP O 270 618，EP O 182 448，EP O 162 067，EP O 786 474，EP O 533 862，EP O 506 757，EP O 874057，EP O 795 021，EP O 670 332，EP O 500 734 ；EP O 232 112和EP O 160 457 ;Sanberg等人，世界血友病聯(lián)合會第20屆國際會議(XXthInt. Congress of the WorldFed. OfHemophilia), (1992)和 Lind 等人，Eur. J. Biochem.,232 :19(1995)。
編碼上述因子VIII的核酸序列可使用重組方法獲得或從已知包含該序列的載體得到。此外，也可使用標準技術(shù)直接從含有該序列的細胞和組織中分離所需序列，所述標準技術(shù)例如酚提取與cDNA或基因組DNA的PCR[參見，例如=Sambrook等人]。除了克隆以夕卜，核苷酸序列也可合成產(chǎn)生?？捎脴藴史椒ㄖ苽渲丿B的寡核苷酸，從重疊的寡核苷酸裝配成完整的編碼序列中[參見，例如Edge, Nature, 292 :757(1981) ；Nambari等人，Science,223 :1299(1984)和 Jay 等人，J. Biol. Chem.，259 :6311 (1984)]。
此外，本發(fā)明不限于人因子VIII。實際上，本發(fā)明意在包括來自除人以外的動物的因子VIII，所述動物包括但不限于寵物動物(例如狗、貓和馬)、牲畜(例如牛、山羊和綿羊)、實驗室動物、海生動物、大型貓科動物(large cat)等。
AAV載體可含有編碼因子VIII片段的核酸，該片段本身無生物活性，但當給予受試對象時則能改善或恢復血凝時間。例如，如前所述，因子VIII蛋白含有兩條多肽鏈由B結(jié)構(gòu)域隔開的重鏈和輕鏈，B結(jié)構(gòu)域?qū)⒃诩庸み^程中被切除。如本發(fā)明所證明的，用因子VIII的重鏈和輕鏈共轉(zhuǎn)導受體細胞導致生物活性因子VIII的表達。由于大多數(shù)血友病患者僅在一條鏈(例如重鏈或輕鏈)中含有突變或缺失，這就有可能僅給予患者有缺陷的那條鏈來與另一條鏈互補。
其他有用的基因產(chǎn)物包括非天然存在的多肽，例如具有非天然存在的氨基酸序列的嵌合或雜交多肽，所述非天然存在的氨基酸序列含有插入、缺失或氨基酸取代。例如，經(jīng)單鏈改造的免疫球蛋白可用在某些免疫低下患者中。其他類型的非天然存在的基因序列包括反義分子和催化性核酸，例如核酶，可用于降低靶的過度表達。
降低和/或調(diào)節(jié)基因表達對治療以細胞過度増殖為特征的過度増殖性疾病，例如癌癥和銀屑病，尤其理想。靶多肽包括，與正常細胞相比，僅在過度增殖細胞中產(chǎn)生或在過度増殖細胞中以更高水平產(chǎn)生的多肽。靶抗原包括癌基因和易位基因編碼的多肽，所述癌基因編碼的多肽例如myb、myc、fyn,所述易位基因編碼的多肽如bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF。除了作為靶抗原的癌基因產(chǎn)物，用于抗癌治療和保護性治療方案的靶多肽包括B細胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)和T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區(qū)，在某些些實施方案中，它們也用作自身免疫疾病的靶抗原。其他腫瘤相關(guān)多肽也可用作靶多肽，例如在腫瘤細胞中處于較高水平的多肽，包括單克隆抗體17-1A所識別的多肽和葉酸結(jié)合多肽。
其他合適的治療性多肽和蛋白質(zhì)包括通過賦予抗自身免疫相關(guān)靶的廣譜基礎(chǔ)保護性免疫應答來治療患自身免疫疾病和紊亂的個體的多肽和蛋白，所述自身免疫相關(guān)靶包括細胞受體和產(chǎn)生“自我”定向抗體的細胞。T細胞介導的自身免疫疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、Sj_gren氏綜合征、結(jié)節(jié)病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管炎、韋格納肉芽腫病、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病均以結(jié)合內(nèi)源性抗原并引發(fā)自身免疫疾病相關(guān)炎性級聯(lián)反應的T細胞受體(TCR)為特征。
C.免疫原性轉(zhuǎn)基因
本發(fā)明的AAV載體以避免產(chǎn)生針對包含于載體的AAV序列的免疫應答為宜。然而，這些載體配制成使得載體攜帶的轉(zhuǎn)基因得以表達從而誘導對選定抗原的免疫應答。例如， 為促進免疫應答，可由組成型啟動子控制轉(zhuǎn)基因的表達，如本文所述將載體與佐劑組合，和/或可將載體引入退化組織中。
適當?shù)拿庖咴赞D(zhuǎn)基因的實例可包括選自各種病毒科的免疫原性轉(zhuǎn)基因。需要免疫應答來抵御的病毒科的實例包括小RNA病毒科，其包括導致約50%普通感冒病例的鼻病毒屬；腸病毒屬，其包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒和人腸病毒(例如甲肝病毒)；以及ロ瘡病毒屬，其主要在非人動物中導致ロ蹄疫。在小RNA病毒科內(nèi)，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。其他病毒科包括星狀病毒和杯狀病毒科。杯狀病毒科包括視為流行性腸胃炎重要病因的諾瓦克組病毒。另ー種有望用于靶抗原在人或非人動物中誘導免疫應答的病毒科是披膜病毒科，該科包括甲型病毒屬，該甲型病毒屬包括辛德畢斯病毒、羅斯河病毒、和委內(nèi)瑞拉、東部和西部馬腦炎病毒和風疹病毒屬，包括風疹病毒。黃病毒科包括登革熱、黃熱、日本腦炎、圣路易斯腦炎和蜱傳性腦炎病毒。其他靶抗原可從丙型肝炎或冠狀病毒科產(chǎn)生，其中包括許多非人病毒，例如感染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性胃腸病毒(豬)、豬凝血性腦脊髄炎病毒(豬)、貓感染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠狀病毒(貓)、狗冠狀病毒(狗)和可導致普通感冒和/或非-甲型、こ型或丙型肝炎的人呼吸冠狀病毒，該科病毒還可能是嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)的病因。在冠狀病毒科內(nèi)，靶抗原包括El (也稱為M或基質(zhì)蛋白)、E2 (也稱為S或刺蛋白)、E3 (也稱為HE或血凝素-依爾替糖)、糖蛋白(并非所有冠狀病毒中都有)或N(核衣売)。他抗原還可以是針對動脈炎病毒科和彈狀病毒科的。彈狀病毒科包括水皰病毒屬(例如皰疹口炎病毒)和狂犬病病毒屬(例如狂犬病)。在彈狀病毒科內(nèi)，適當?shù)目乖稍从贕蛋白或N蛋白。包括出血熱病毒例如馬爾堡和埃博拉病毒的絲狀病毒科可能是合適的抗原來源。副黏病毒科包括I型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(小雞)、牛瘟病毒、麻疹病毒(其包括麻疹和犬瘟熱)，以及肺病毒(其包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒被分在正黏病毒科內(nèi)，并且是抗原(例如=HA蛋白、NI蛋白)的合適來源。布尼亞病毒科包括布尼亞病毒屬(加利福尼亞腦炎，拉克羅斯腦炎)、白蛉熱病毒屬(裂谷熱)、漢坦病毒屬(普馬拉是hemahagin熱病毒)、內(nèi)羅畢病毒屬(內(nèi)羅畢綿羊病)和各種未命名的銀環(huán)蛇病毒(bungaviruse)。沙粒病毒科提供抗LCM和拉沙熱病毒的抗原來源?？乖牧愆`來源是博內(nèi)病毒科。呼腸孤病毒科包括呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬(其導致兒童急性腸胃炎)、環(huán)狀病毒屬和科羅拉多蜱熱病毒屬(科羅拉多蝶熱病毒屬、Lebombo病毒屬(人)、馬變性腦病病毒屬、藍舌病病毒屬)。逆轉(zhuǎn)錄病毒科包括致腫瘤RNA病毒亞科，該亞科包括人和獸醫(yī)疾病，例如貓白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亞科(包括HIV、猿免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒、犬感染性貧血病毒和泡沫病毒亞科)。
就HIV和SIV而言，已經(jīng)描述了許多合適的抗原，并可以容易地選擇。合適的HIV和SIV抗原的實例包括但不限于gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat和Rev蛋白，及其各種片段。例如，適當?shù)谋荒?env)蛋白的片段包括,例如gp41、gpl40和gpl20。另外，已經(jīng)描述了對于這些及其他HIV和SIV抗原的各種修飾。用于該用途的合適抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。例如，可從其他蛋白中選擇編碼gag、pol、Vif以及Vpr、Env、Tat和Rev的序列。參見，例如在美國專利5，972，596中描述了修飾的gag蛋白。同時參見，在D. H. Barouch等人，J. Virol.，75 (5) :2462-2467 (2001 年 3 月)和 R. R. Amara 等人，Science, 292 :69-74 (2001年4月6日)中所描述的HIV和SIV蛋白。這些蛋白質(zhì)或其亞基可經(jīng)由多個載體或由單個 載體單獨或組合遞送。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亞科(BKU和J⑶病毒)和乳頭瘤病毒亞科(與癌癥或乳頭瘤的惡性進展有關(guān))。腺病毒科包括導致呼吸疾病和/或腸炎的病毒(EX、AD7、ARD、O. B.)。細小病毒科包括貓細小病毒(貓腸炎)、貓全白細胞減少病病毒、狗細小病毒和豬細小病毒科。皰疹病毒科包括皰疹病毒亞科，該亞科包括單純皰疹病毒屬(HSVI、HSVII)、水痘病毒屬(假狂犬病、水痘帯狀皰疹)；以及β皰疹病毒亞科，該亞科包括巨細胞病毒屬(HCMV，鼠巨細胞病毒屬)；和Y皰疹病毒亞科，該亞科包括淋巴潛伏病毒屬、EBV(伯基特淋巴瘤)、人皰疫病毒6Α、6Β和7、卡波西肉瘤相關(guān)皰疫病毒與彌猴皰疫病毒(B病毒)、傳染性鼻氣管炎病毒屬、馬雷克病病毒屬和細長病毒屬。痘病毒科包括脊椎動物痘病毒亞科，包括正痘病毒屬(大天花(天花)和牛痘(牛痘))、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬和昆蟲痘病毒亞科。嗜肝DNA病毒科包括こ肝病毒?？勺鳛榭乖暮线m來源的ー種未歸類病毒是肝炎S病毒、戊肝病毒和朊病毒。另ー種作為抗原來源的病毒是Nipan病毒。其他的病毒來源包括鳥感染性粘液囊病病毒和豬呼吸和生殖綜合征病毒。甲型病毒科包括馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
本發(fā)明還包括用于免疫人或非人動物抗其他病原體的免疫原，所述病原體包括感染人和非人脊椎動物的細菌、真菌、寄生微生物或多細胞寄生蟲，或來自癌細胞或腫瘤細胞的病原體。細菌病原體的實例包括致病性革蘭氏陽性球菌，其包括肺炎球菌、葡萄球菌(及其產(chǎn)生的毒素，例如腸毒素B)和鏈球菌。致病性革蘭氏陰性球菌包括腦膜炎球菌、淋球菌。致病性腸革蘭氏陰性桿菌包括腸桿菌科；假單胞菌屬、不動桿菌屬和?？暇鷮伲活惐蔷壹賳捂呔鷮?；沙門氏菌屬；志賀氏菌屬；嗜血桿菌屬莫拉氏菌屬；杜克雷嗜血桿菌(H. ducreyi)(其導致軟下疳)；布魯桿菌(布魯桿菌病)；野兔熱弗朗西絲菌(Franisella tularensis)(其導致兔熱病)；鼠疫耶爾森菌(鼠疫)和其他耶爾森菌屬(巴斯德菌屬)；念珠狀鏈桿菌和螺菌屬；革蘭氏陽性桿菌，其包括單核細胞增多李斯特菌；紅斑丹毒絲菌；白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)(白喉)；霍亂；炭疽桿菌(B. anthracis)(炭疽)；多諾萬病(腹股溝肉芽腫)和巴爾通體病。致病性厭氧細菌導致的疾病包括破傷風；肉毒中毒(肉毒梭菌(Clostridum botulimum)及其毒素)；產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringen)及其ε毒素；其他梭菌屬；結(jié)核病；麻風和其他分枝桿菌屬。致病性螺旋體疾病包括梅毒；密螺旋體病雅司病、品他病和地方性梅毒；以及鉤端螺旋體病。較高致病性細菌和致病性真菌導致的其他感染包括鼻疽(鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei);放線菌?。恢Z卡菌?。浑[球菌病、芽生菌病、組織胞漿菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉??；孢子絲菌??；副球孢子菌病、石樣真菌病、球擬酵母病、足分枝菌病和著色真菌?。灰约捌ふ婢?。立克次體感染包括斑疹傷寒熱、落肌山斑疫熱、Q熱(伯內(nèi)特科克斯立克次體(Coxiellaburnetti))和立克次氏體痘。支原體和衣原體感染的實例包括支原體肺炎、性病性淋巴肉芽腫、鸚鵡熱和圍產(chǎn)期衣原體感染。致病性真核細胞包括致病性原生動物和蠕蟲，并且由其產(chǎn)生的感染包括阿米巴病、痕疾、利什曼病、錐蟲病、弓形體病、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、Trichans、鼠弓形體(Toxoplasmagondii)、巴貝蟲病、賈第蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病、血吸蟲病、線蟲、吸蟲(trematode)或吸蟲(fluke)感染和絳蟲(絳蟲)感染。
這些生物體和/或其產(chǎn)生的毒素中有許多已被疾病控制中心[(⑶C)，健康與人 類服務(wù)部(Department of Heath and Human Services),美國]認定為是可用于生物攻擊的物質(zhì)。例如，某些此類生物物質(zhì)包括目前分類為A類物質(zhì)的炭疽桿菌(Bacillusanthracis)(炭疽)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒桿菌毒素)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔熱弗朗西絲菌(Franisellatularensis)(兔熱病)和病毒性出血熱[絲狀病毒(例如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)和沙粒病毒[例如拉沙病毒、馬丘博病毒];目前分類為B類物質(zhì)的伯內(nèi)特科克斯立克次體(Coxiella burnetti) (Q熱)、布魯桿菌(布魯桿菌病)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、假鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapseudomallei)(類鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen)及其韋素(ε 韋素)、葡萄球菌(Staphylococcus)及其韋素(腸毒素B)、嬰I踏熱衣原體(Chlamydia psittaci)(嬰I踏熱)、水上安全威脅(watersafetythreat)(例如霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、斑疫傷寒熱(普氏立克次體(Richettsia powazekii)和病毒性腦炎(甲型病毒，例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎、東部馬腦炎、西部馬腦炎)；以及目前分類為C類物質(zhì)的Nipan病毒和漢坦病毒。此外，其他如此分類或不同分類的生物體也可能在將來可被鑒定和/或用于這種目的。容易理解的是，本文所述的病毒載體和其他構(gòu)建體可用于傳遞來自這些生物體的抗原、病毒、其毒素或其他副產(chǎn)物，這可預防和/或治療這些生物物質(zhì)引起的感染或其他不良反應。
施用本發(fā)明的載體來遞送抗T細胞可變區(qū)的免疫原引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應答來消除T細胞。在類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，已鑒定了參與該疾病的數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些TCR包括V-3、V-14、V-17和V-17。因此，遞送編碼這些多肽中至少ー種的核酸序列將引發(fā)以參與RA的T細胞為目標的免疫應答。在多發(fā)性硬化癥(MS)中，已鑒定了參與該疾病的數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些TCR包括V-7和V-IO。因此，遞送編碼這些多肽中至少ー種的核酸序列將引發(fā)以參與MS的T細胞為目標的免疫應答。在硬皮病中，已鑒定了參與該疾病的數(shù)種特定 TCR 可變區(qū)。這些 TCR 包括 V-6、V-8、V-14 和 V-16、V-3C、V_7、V-14、V-15、V-16、V-28和V-12。因此，遞送編碼這些多肽中至少ー種的核酸分子將引發(fā)以參與硬皮病的T細胞為目標的免疫應答。
因此，本發(fā)明的rAAV衍生的重組病毒載體提供了一種有效的基因轉(zhuǎn)送載體，它們能在體內(nèi)或體外將選定轉(zhuǎn)基因遞送至選定宿主細胞中，既使該生物體具有針對ー種或多種AAV源的中和抗體。在一個實施方案中，rAAV與細胞體外混合，使用常規(guī)方法培養(yǎng)被感染的細胞，并將被轉(zhuǎn)導細胞回輸給患者。
這些組合物尤其適用于治療目的和免疫接種目的的基因遞送，所述免疫接種包括誘導保護性免疫。本發(fā)明的AAV和包含本發(fā)明的AAV的組合物還可以用于免疫療法，例如在為本申請申請人所共有的、2004年4月28日遞交的“致免疫分子的連續(xù)的腺病毒和AAV介導的傳遞”的美國專利申請?zhí)?0/565，936。
此外，本發(fā)明的組合物也可用于體外生產(chǎn)所需基因產(chǎn)物。就體外生產(chǎn)而言，可如下獲得所需產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))用含有編碼所需產(chǎn)物的分子的rAAV轉(zhuǎn)染宿主細胞，并在允許表達的條件下培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物，然后從培養(yǎng)物中獲得所需產(chǎn)物。然后，可視需要純化和分 離該表達產(chǎn)物。合適的轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)、純化和分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
以下實施例闡述了本發(fā)明的幾個方面與實施方案。
實施例I
根據(jù)本發(fā)明的方法，將AAV序列與包含分化體A、B、C、D、E和F(由AAV9代表)各自代表性序列的文庫比對時，確定了其具有單現(xiàn)突變。下列表格顯示了有待改變?yōu)楸Ｊ匦蛄械囊職ば蛄泻蛦维F(xiàn)突變。為表示某些突變，單現(xiàn)突變后面有*，再后面是用于取代它的氨基酸殘基。為表示其他有些突變，單現(xiàn)突變后面是其氨基酸位置和用來取代它的殘基。
氨基酸編號是基于這些AAV衣殼各自的已公開序列。參見，例如G. Gao等人，J. Virol. ,78(12) :6381-6388 (2004年6 月)和國際專利公開號 WO 2004/042397[其中的全部序列存放在GenBank中]，以及2004年9月30日提交的國際專利公開號W02005/033321，其引用作為參考。
例如，就下表而言，各名稱應如下理解。Cy5Rl指氨基酸殘基位點13處為天冬氨酸(D)的經(jīng)修正氨基酸序列SEQ ID NO 24 ；cy5天然氨基酸序列的第13位殘基處是甘氨酸。Cy5R2指氨基酸殘基位點13處(在天然序列中為甘氨酸)為天冬氨酸且在氨基酸殘基位點403處(在天然序列中為天冬氨酸)為天冬酰胺的經(jīng)修正氨基酸序列SEQ ID NO 240Cy5R3具有經(jīng)修正的氨基酸序列SEQ ID NO :24，具有與Cy5R2相同的改變，此外，在位點158處為賴氨酸(在天然序列中為天冬酰胺)，在位點161處為谷氨酰胺(在天然序列中為脯氨酸)。鑒于以上信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定在下表中所列的其他單現(xiàn)突變改變。
權(quán)利要求
1.一種提高AAV —種或多種功能特性的方法，所述ー種或多種功能特性是AAV病毒粒子包裝產(chǎn)量、轉(zhuǎn)導效率和/或基因轉(zhuǎn)移效率，所述方法包括如下步驟 (a)將親代AAV衣殼序列與功能性AAV衣殼序列文庫的序列進行比對，所述文庫包含來自至少三個不同分化體的AAV衣殼序列，并包含至少3個功能性AAV衣殼序列，它們在接受比對的vpl序列全長上至少有85%同一性，所述功能性AAV衣殼具有目標水平的包裝能力、目標水平的體外轉(zhuǎn)導效率和/或目標水平的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率； (b)鑒定在親代AAV衣殼中的至少ー個單現(xiàn)突變，所述單現(xiàn)突變是在親代AAV衣殼序列中的某一位點上的氨基酸殘基，該氨基酸殘基不同于與之對齊的文庫中功能性AAV衣殼序列該位點上的氨基酸殘基，這些文庫中功能性AAV衣殼序列在該位點上的氨基酸殘基都相同； (c)將親代AAV衣殼中的所述單現(xiàn)突變改變?yōu)樗鑫膸熘泄δ苄訟AV衣殼序列中對應位點上的氨基酸，由此形成修飾的AAV衣殼序列； (d)評定和挑選出與親代AAV相比包裝產(chǎn)量、轉(zhuǎn)導效率和/或基因轉(zhuǎn)移效率提高的修飾的 AAV。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述文庫包含每個分化體的至少兩個AAV序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述比對的AAV衣殼序列文庫包含至少3到100個AAV序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述比對的AAV衣殼序列文庫包含至少6到50個AAV序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其中所述文庫包含至少12個AAV序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述親代AAV包含多個單現(xiàn)突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其中所述親代AAV包含2到4個單現(xiàn)突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其中對不同的單現(xiàn)突變重復步驟(C)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中通過對所述單現(xiàn)突變的密碼子進行定點誘變來改變親代AAV。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的方法，其中，對質(zhì)粒骨架所攜帯的親代AAV進行所述定點誘變。
11.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其進ー步包括將經(jīng)改變的AAV包裝成AAV顆粒的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，所述AAV顆粒與親代AAV相比具有提高的包裝效率。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，所述AAV顆粒與親代AAV相比具有提高的轉(zhuǎn)導效率。
14.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，所述AAV顆粒與親代AAV相比具有提高的基因轉(zhuǎn)移效率。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種在選定的腺相關(guān)病毒(AAV)序列中校正單現(xiàn)突變從而提高選定AAV的包裝產(chǎn)量、轉(zhuǎn)導效率和/或基因轉(zhuǎn)移效率的方法。該方法包括改變親代AAV衣殼中的一個或多個單現(xiàn)突變，使它們與用來比對的功能性AAV衣殼序列中相應位點上的氨基酸相一致。
文檔編號C12N15/864GKCN101203613 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200680010566
公開日2012年12月12日 申請日期2006年4月7日
發(fā)明者L·范登伯格, G·高, J·M·威爾森 申請人:賓夕法尼亞大學托管會導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (1),