專利名稱:丙型肝炎病毒基因型的確定的制作方法
丙型肝炎病毒基因型的確定
本申請要求申請日為2004年01月07日的美國臨時(shí)申請系列號No. 60/534，618和申請日為2004年04月20日的美國臨時(shí)申請系列號No. 60/563，629的權(quán)利，二者以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明提供了與用于基礎(chǔ)研究，臨床研究，以及用于臨床檢測分析開發(fā)的核酸檢測分析相關(guān)的方法和組合物。特別地，本發(fā)明提供了用于確定丙型肝炎病毒基因型的方法。
背景
丙型肝炎病毒(HCV)幾乎是所有非甲非乙型肝炎(NANBH)的病例的原因(Choo，Q. -L.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :2451-2455 (1988))，而且是全世界持久性的健 康威脅，每年報(bào)道的新病例超過一百萬(Zein，N.N. Clin. Micro. Rev. 13 :223-235 (2000))。HCV感染通常是慢性和持久性的。HCV感染最嚴(yán)重的后果是慢性肝病和死亡，在美國HCV感染是肝臟移植的主要推動(dòng)力(Zein，出處同前)。
HCV是一種正鏈單鏈RNA病毒，長度大約為10kb，屬于黃病毒(Flaviviridae)家族(Zein，出處同前)。在不同地理區(qū)域發(fā)現(xiàn)的分離物中存在相當(dāng)多的異種。這些差異被分類為多種基因型和亞型。雖然各種不同的標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)用于表征這些基因型，但是采用了 2種主要的分類模式。Peter Simmonds創(chuàng)建了更廣泛應(yīng)用的模式,其使用阿拉伯?dāng)?shù)字來表示不同的基因型，使用拉丁字母表示亞型，例如，la, lb, 2a型，等等，(綜述見Simmonds,P. Hepatology. 二月；21 (2) :570-83(1995)和 Simmonds, P. J Hepatol. ；31 Suppl I 54-60(1999))。根據(jù)該體系，基因型1-3是在北美，歐洲和日本發(fā)現(xiàn)的普遍類型，其余類型以不同的頻率在亞洲和非洲的部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)。因此，在一些情況下，HCV基因型可能是流行病學(xué)重要的，例如在感染的病因?qū)W確定中。
已經(jīng)采取了努力以闡明不同基因型的臨床重要性。一些研究表明，I型感染，尤其是Ib型,可能與更嚴(yán)重的疾病和較早地復(fù)發(fā)相關(guān)(Zein, N. N.等人，Liver Transplant.Surg. I :354-357 (1995) ;Gordon 等人，Transplantation 63 :1419-1423 (1997))。某些研究也表明，除了 I型(例如Ia或Ib)之外的基因型可能更有利地對各種治療，例如干擾素產(chǎn)生應(yīng)答(McHutchison, J. G.，等人，N. Engl. J. Med.，339 :1485-1492 (1998))。已經(jīng)表明，HCV基因型的確定聯(lián)合其它的診斷標(biāo)記，如病毒負(fù)荷，可能在疾病預(yù)后(Zein，N.N.出處同前)和石角定治療的過程(National Institutes of HealthConsensus Development ConferenceStatement !Management ofHepatitis C :2002 ;六月，10-11, 2002)中是重要的。
HCV基因組的不同區(qū)域用于確定基因型。HCV基因組包括相對保守的區(qū)域，如5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)，可變區(qū)(例如El和非結(jié)構(gòu)區(qū)(NS)5B)，以及高變區(qū)，如那些編碼包膜蛋白的區(qū)域(Halfon，P.CLI，四月，2002)。已經(jīng)對保守區(qū)域中特定序列的存在與可變區(qū)尤其是NS-5B中序列的相關(guān)性進(jìn)行了研究(Stuyver，L.，等人，J. Clin. Micro. ,34 2259-2266(1996))。作為這些研究的結(jié)果，基于保守區(qū)域尤其是5' UTR的基因分型分析，已經(jīng)發(fā)展到簡化任務(wù)為鑒定樣品中存在哪種病毒型或哪些病毒型。假定存在商業(yè)可獲得的病毒負(fù)荷分析，其依賴于擴(kuò)增全部或部分5' UTR，根據(jù)該保守區(qū)域中分隔的序列差異確定HCV基因型的能力提供了一種方便的方法從單個(gè)擴(kuò)增的核酸，例如RT-PCR或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TM)擴(kuò)增子，獲得廣泛的診斷信息。
各種分子生物學(xué)方法已經(jīng)用于使用5' UTR確定HCV基因型的任務(wù)中。這些方法包括反向斑點(diǎn)印跡分析(例如，Inno LIPA, Innogenetics, Ghent, Belgium,如 Stuyver,L.等人，J ClinMicrobiol. 1996 Sep ；34(9) :2259_66，美國專利號 6495670 和相關(guān)的美國與國際專利和未決申請中所述；直接DNA測序(例如，TRUEGENE HCV 5' NC基因分型試劑盒，Bayer Diagnostics,Berkeley, CA,如 Germer, J. J.等人 J Clin Microbiol. 2003 Oct ；41(10) :855-7 中所述)，和焦憐酸測序(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden,如美國專利號6258568與相關(guān)的美國和國際專利以及未決申請中所述)。
除了這些分子方法外，已經(jīng)引入了血清方法用于確定基因型，例如，RIBA SIA測試(Chiron Corp. ,Emeryville,CA)和Murex HCV血清分型酶免疫分析(Murex DiagnosticsLtd,Dartford,UK)。一些研究表明，血清學(xué)分型可能在特異性和靈敏度方面有局限(Zein, 出處同前)。
因此，需要一種快速、靈敏、精確和均一的方法，用于在臨床樣品例如血液或血液級分中準(zhǔn)確地確定HCV基因型，而不需要電泳或斑點(diǎn)印跡技術(shù)?？紤]到目前對分子方法的依賴，可能存在對確定HCV基因型的可規(guī)?；涂勺詣?dòng)化方法的前進(jìn)的和增加的需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了用于確定丙型肝炎病毒(HCV)基因型的組合物和方法。更特別地，本發(fā)明提供了使用侵入性切割結(jié)構(gòu)分析(invasivecleavage structur eassays),例如,從患者篩選包含HCV序列的核酸樣品，以鑒定存在的病毒的基因型的組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明可用于檢測單一病毒感染或由不止一種HCV基因型組成的混合感染。
在其他的實(shí)施方案中，如例如，美國專利號6，291，187和6，323，009，以及PCT公開號No. WO 01/88190和WO 02/00934中提供的，使用純化的聚合酶，在多引物基因組DNA的基礎(chǔ)上，制備了適于與本發(fā)明的方法和組合物一起使用的合成DNA，每個(gè)都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的。在這些實(shí)施方案中，使用DNA聚合酶，如高持續(xù)合成的￠29聚合酶(如例如美國專利5，198，543和5，001，050所述，每個(gè)都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的)，聯(lián)合抗核酸外切酶的隨機(jī)引物，如六聚物，進(jìn)行DNA如基因組DNA的擴(kuò)增。
方法不受靶核酸性質(zhì)的限制。在一些實(shí)施方案中，靶核酸是單鏈或雙鏈DNA或RNA。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸在形成切割結(jié)構(gòu)之前變成單鏈(例如，通過加熱)。在一些實(shí)施方案中，靶核酸的來源包括含有基因組DNA的樣品。樣品包括，但是不局限于，組織切片、血液、血液級分(例如血漿、血清)唾液、大腦脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰液和精液。
在一些實(shí)施方案中，靶核酸包括基因組DNA或mRNA。在其他的實(shí)施方案中，靶核酸包括合成DNA或RNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品中的合成DNA或RNA使用純化的聚合酶產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用純化的聚合酶產(chǎn)生合成DNA包括使用PCR。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的合成DNA包括HCV基因組的全部或部分5 ' UTR0在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，合成DNA的產(chǎn)生伴隨有使用純化的逆轉(zhuǎn)錄酶，以在PCR之前產(chǎn)生cDNA。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用商業(yè)的試劑盒如COBAS AMPLICOR或COBASTAQMAN(RocheMolecular Systems)進(jìn)行這種RT-PCR。該方法不局限于HCV基因組的特定區(qū)域。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸涉及存在于5' UTR中的核苷酸。在其他的實(shí)施方案中，可檢測適于基因型分析的備擇區(qū)域，例如，NS-5A, NS-5B，核心區(qū)域或3' UTR0在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，合成DNA的產(chǎn)生包括使用RNA-DNA復(fù)合引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法和組合物(例如，如美國專利號6，251，639中所述，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。在其他的優(yōu)選實(shí)方案中，使用適于與本發(fā)明的方法一起使用的純化的DNA聚合酶產(chǎn)生合成DNA，包括使用滾環(huán)擴(kuò)增，(例如，如美國專利號6，210，884，6，183，960和6，235，502中所述，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。在其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，合成DNA的產(chǎn)生包括使用含有成環(huán)序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，例如，如美國專利號6，410，278中所述，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。在其他的實(shí)施方案中，RNA聚合酶用于產(chǎn)生RNA擴(kuò)增子，例如通過如美國專利號5，554，516和相關(guān)的專利以及未決申請中所述的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。
本發(fā)明提供的HCV基因分型分析可以包括，但不限于，酶錯(cuò)配裂解方法(例如，Variagenics,美國專利號No. 6，110，684，5，958，692，5，851，770，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分支的雜交方法(例如，Chiron，美國專利號5，849，481，5，710，264，5，124，246，和5，624，802，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考);滾環(huán)復(fù)制(例如，美國專利號6，210，884，6，183，960和6，235，502，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)；NASBA(例如，美國專利號5，409，818，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)；分子信標(biāo)技術(shù)(例如，美國專利號6，150,097,以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)；E-傳感器技術(shù)(Motorola，美國專利號 6，248，229,6, 221，583,6, 013，170 和 6，063，573，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考);循環(huán)探針技術(shù)(例如，美國專利號5，403，711，5，011，769和5，660，988，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)；Dade Behring信號放大方法(例如，美國專利號6，121,001,6, 110,677,5,914, 230，5，882，867 和 5，792,614，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barnay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88,189-93(1991));以及夾心雜交方法(例如，美國專利號5，288，609，以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)的檢測分析組合使用。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括非擴(kuò)增的寡核苷酸檢測分析的試劑盒或組合物，其設(shè)計(jì)用于檢測至少一種HCV基因型序列。在其它的實(shí)施方案中，非擴(kuò)增的寡核苷酸檢測分析包括第一和第二寡核苷酸，其設(shè)計(jì)形成侵入性切割結(jié)構(gòu)(例如，INVADER分析)，其與包括所述至少一種HCV基因型序列的靶序列相聯(lián)合。在特定的實(shí)施方案中，第一寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中3'部分設(shè)計(jì)成與靶序列雜交，其中5'部分設(shè)計(jì)成不與靶序列雜交。在其它的實(shí)施方案中，第二寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中5'部分設(shè)計(jì)成與靶序列雜交，其中3'部分設(shè)計(jì)成不與靶序列雜交。
在一些實(shí)施方案中，檢測的HCV 5' UTR序列是在Genbank，NCBI，肝炎病毒數(shù)據(jù)庫中可見的任何序列或其變體。應(yīng)當(dāng)理解，序列將隨時(shí)間而變化，而且其它的HCV變種，現(xiàn)在已知的，或以后發(fā)現(xiàn)的，都可容易地適于本發(fā)明的方法和組合物，通過這里的描述。
在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸檢測分析選自測序分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析、雜交分析、使用與突變互補(bǔ)的探針的雜交分析、微陣列分析、珠子陣列分析、引物延伸分析、酶錯(cuò)、配裂解分析、分支的雜交分析、滾環(huán)復(fù)制分析、NASBA分析、分子信標(biāo)分析、循環(huán)探針分析、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析、侵入性切割結(jié)構(gòu)分析、ARMS分析和夾心雜交分析。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定HCV基因型的方法，包括
a)提供i)來自受試者的樣品；ii)從HCV基因組產(chǎn)生雙鏈DNA的方法；iii)包括寡核苷酸檢測分析的組合物(例如，如這里所述的)jPb)使所述樣品與所述組合物接觸，以便確定存在或缺乏至少一種HCV基因型。在一些實(shí)施方案中，樣品是血液樣品或血液級分樣品(例如，血漿、血清、紅血球)、口腔拭子樣品，例如，口腔細(xì)胞、子宮頸拭子樣品、糞便、唾液樣品或來自受試者的其他生物液體如胸膜液、痰液、尿、羊膜、腦脊髓液或汗液。
仍然在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種用于對包含HCV的樣品進(jìn)行基因分型的方法，其包括以下步驟a)檢測從所述HCV樣品的5' UTR擴(kuò)增的核酸中一種或多種(例如，2種或多種，5種或多種)單核苷酸多態(tài)性；b)根據(jù)來自步驟a的信息產(chǎn)生5' UTR基因型模式；而且，在一些實(shí)施方案中，對所述5' UTR基因型模式與預(yù)先確定的HCV信息矩陣進(jìn)行比較，以便確定所述受試者的HCV基因型。在一些實(shí)施方案中，預(yù)先確定的HCV信息矩陣保存在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法更進(jìn)一步地包括在選擇用于受試者的療法中使用所述HCV基因型的步驟(例如，選擇合適的藥物，選擇合適的藥物劑量，避免某些藥物，繼續(xù)施用某種藥物若干天等等)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括侵入性切割檢測分析的組合物，其中侵入性切割檢測分析設(shè)計(jì)用于檢測HCV的5' UTR序列選自-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法包括以下步驟a)提供i)來自受試者的樣品，其中該樣品懷疑包含HCVjP ii)包括侵入性切割檢測分析的組合物，其中侵入性切割檢測分析設(shè)計(jì)用于檢測HCV的5' UTR序列選自-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80的位置上的單核苷酸多態(tài)性；和b)使該組合物與樣品在能檢測至少一種單核苷酸多態(tài)性的條件下接觸。在某些實(shí)施方案中，該接觸確定了堿基位置的同一性(例如，“G，” “C，” “A，”或“T”)。在其他的實(shí)施方案中，樣品來自于受試者。
在某些實(shí)施方案中，侵入性切割分析包括第一寡核苷酸，其中該第一寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中該3'部分設(shè)計(jì)成與HCV的5' UTR序列雜交，而且其中該5'部分設(shè)計(jì)成不與HCV的5' UTR序列雜交。在其他的實(shí)施方案中，第一寡核苷酸是選自以下的序列SEQ ID NO :2-4,7,8,10，14，16，17，19，22，24，26，30，33，34，36，42，43，45-47，49，50，55，57，59 和 63。
在特定的實(shí)施方案中，侵入性切割分析包括第二寡核苷酸，其中該第二寡核苷酸包含3'部分和3'部分，其中該5'部分設(shè)計(jì)成與HCV的5' UTR序列雜交，而且其中該3'部分設(shè)計(jì)成不與HCV的5' UTR序列雜交。在其他的實(shí)施方案中，第二寡核苷酸是選自以下的序列:1,5,6,9,11-13，15，18，20，21，23，25，29，31，32，35，37-41，44，48，51-54，56 和 58。
在一些實(shí)施方案中，HCV的5' UTR序列包括RNA(例如，可以檢測HCV病毒的RNA，而不用轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA)。在某些實(shí)施方案中，HCV的5' UTR序列包括DNA (例如，在檢測之前把HCV的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法包括以下步驟a)提供i)來自受試者的 樣品，其中該樣品懷疑含有丙型肝炎病毒，和ii)多重寡核苷酸檢測分析，其中每個(gè)寡核苷酸檢測分析設(shè)計(jì)用于檢測HCV的5' UTR序列中的單核苷酸多態(tài)性，和b)在至少能確定每個(gè)單核苷酸多態(tài)性的部分基因型信息的條件下，使樣品與該多重寡核苷酸檢測分析接觸，從而產(chǎn)生5' UTR基因型模式，其中該5' UTR基因型模式足以對丙型肝炎病毒進(jìn)行基因分型。
在某些實(shí)施方案中，該方法更進(jìn)一步地包括c)根據(jù)該5' UTR基因型模式，將丙型肝炎病毒基因分型為如基因型I、II、III、IV、V或VI。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因分型把丙型肝炎病毒分類為如基因型I、iv或V。在其他的實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括侵入性切割結(jié)構(gòu)類型分析。在特定的實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括至少一種以下類型的分析=TAQMAN分析，測序分析，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析，雜交分析，使用與突變互補(bǔ)的探針進(jìn)行的雜交分析，微陣列分析，珠子陣列分析，引物延伸分析，酶錯(cuò)配裂解分析，分支的雜交分析，滾環(huán)復(fù)制分析，NASBA分析，分子信標(biāo)分析，循環(huán)探針分析，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和夾心雜交分析。在特定的實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括非擴(kuò)增的寡核苷酸類型檢測分析。
在一些實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析中至少一個(gè)包括第一寡核苷酸，其中該第一寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中該3'部分設(shè)計(jì)成與HCV的5' UTR序列雜交，而且其中該5'部分設(shè)計(jì)成不與HCV的5' UTR序列雜交。在其他的實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析中至少一個(gè)包括第二寡核苷酸，其中該第二寡核苷酸包含3'部分和3'部分，其中該5'部分設(shè)計(jì)成與HCV的5' UTR序列雜交，而且其中該3'部分設(shè)計(jì)成不與HCV的5' UTR序列雜交。在另外的實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括當(dāng)與5' UTR序列雜交時(shí)含有至少一個(gè)錯(cuò)配的寡核苷酸。
在其他的實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括至少兩個(gè)寡核苷酸檢測分析(例如，2或3)。在更進(jìn)一步地實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括至少4個(gè)寡核苷酸檢測分析(例如，4，5，6或7)。在一些實(shí)施方案中，多重寡核苷酸檢測分析包括至少8個(gè)寡核苷酸檢測分析(例如，8，9或10)。
在另外的實(shí)施方案中，HCV的5' UTR序列中的單核苷酸多態(tài)性位于以下位置中的至少兩個(gè)位置-245，-167，-163，-155，-144，-118和-80。在其他的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明:i)_163位置為“A”；ii)在-144位置處沒有“C”;和任選地iii)在-167位置處沒有“C”;或-167位置處為“T”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型I。
在某些實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_163位置為“A”；ii)_80位置為“T” ；和任選地iii)在-167位置處沒有“C” ；或-167位置處為“T” ；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型I。在更進(jìn)一步地實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_163位置為“A”；ii)-72位置為“C”；和任選地iii)在-167位置處沒有“C”;或-167位置處為“T”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5/ UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型I。
在其他的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_122位置為在-144位置處沒有“C” ;和任選地iii)在-167位置處沒有“C” ；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型I。在另外的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_122位置為“T”；ii)-80位置處為“T”;和任選地iii)在-167位置處沒有“C”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型I。
在特定的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_122位置為“ T”；ii)_72位置處為“T” ;和任選地iii)在-167位置處沒有“C” ；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型I。在某些實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_132位置為“A”;和任選地ii)在-163位置處為“G”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型II。
在更進(jìn)一步地實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_119位置為“Y” ( “C”或“T”)；和任選地ii)在-167位置處沒有“C”，或-167位置為“T”；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型II。在一些實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)-245位置為“T”；和ii)-167位置為“C”；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型IV。在另外的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_245位置為“T”;和ii)_118位置為“A”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型IV。在某些實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)-167位置為“T”;ii)-163位置處為“G”;和iii)_155位置為“C”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型V。
在其他的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_122位置為“C”；和ii)_117位置為“G” ；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型V。在特定的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)-117位置為“G”;和ii)-80位置為“C”；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型VI。
在一些實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_118位置為“A”;和ii)_80位置為“C”;而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型VI。在更進(jìn)一步地實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)-122位置為“T”;和ii)-80位置為“C” ；而且其中該方法更進(jìn)一步地包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型VI。在其他的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式表明i)_122位置為“T” ;和ii)-72位置為“T” ；而且其中該方法其他的包括根據(jù)5' UTR基因型模式把丙型肝炎病毒基因分型為基因型VI。
定義
為了便于理解本發(fā)明，許多術(shù)語和短語定義如下
如這里使用的，術(shù)語“受試者”和“患者”指任何有機(jī)體包括植物，微生物和動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物如狗、貓、家畜和人)。
如這里使用的，術(shù)語“INVADER分析試劑”指用于檢測靶序列的一種或多種試劑，所述試劑包括在存在靶序列時(shí)能形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括在存在侵入性切割結(jié)構(gòu)時(shí)用于檢測的試劑(例如，切割試劑)。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括與靶核酸的第一區(qū)域互補(bǔ)的5'部分，而且所述第二寡核苷酸包括3'部分和5'部分，所述的5'部分與第一部分下游和相鄰第一部分的靶核酸的第二區(qū)域互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，第二寡核苷酸的3'部分包括不與祀核酸互補(bǔ)的的3'末端核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二寡核苷酸的3'部分由不與靶核酸互補(bǔ)的單核苷酸組成。
在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑設(shè)計(jì)用于檢測靶核酸序列，該靶核酸序列包括被包含雙鏈區(qū)域的插入?yún)^(qū)分隔的第一和第二非連續(xù)單鏈區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，INVADER分析試劑包括能與靶核酸序列的所述第一和第二非連續(xù)單鏈區(qū)域結(jié)合的橋連寡核苷酸。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述INVADER分析試劑的所述第一或所述第二寡核苷酸中的一個(gè)或二者是橋連寡核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括固體支持物。例如，在一些實(shí)施方案中，分析試劑的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸(例如，第一和/或第二寡核苷酸，無論是橋連的或非橋連的)附著于所述固體支持物。在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括緩沖液。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液包括二價(jià)陽離子的來源(例如，Mn2+和 /或Mg2+離子)。共同組成INVADER分析試劑的單個(gè)成分(例如，寡核苷酸、酶、緩沖液、靶核酸)稱為“ INVADER分析試劑組分”。
在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括，與第一靶核酸的第一部分上游的靶核酸之第三部分互補(bǔ)的第三寡核苷酸。仍然在其他的實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括靶核酸。在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括第二靶核酸。仍然在其他的實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括含有與第二靶核酸的第一區(qū)域互補(bǔ)的5'部分的第三寡核苷酸。在一些特定的實(shí)施方案中，第三寡核苷酸的3'部分與第二靶核酸共價(jià)連接。在其他的特定實(shí)施方案中，第二靶核酸更進(jìn)一步地包括5，部分，其中第二靶核酸的該5'部分是第三寡核苷酸。仍然在其他的實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括ARREST0R分子(例如，ARREST0R寡核苷酸)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，INVADER分析試劑更進(jìn)一步地包括用于檢測核酸切割產(chǎn)物的試劑。在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑中的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸包括標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述第一寡核苷酸包括標(biāo)記。在其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第三寡核苷酸包括標(biāo)記。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑包括用能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用的部分來標(biāo)記的第一和/或第三寡核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，一種或多種INVADER分析試劑可以預(yù)先配制的形式提供(也即，預(yù)先測量用于該過程的某個(gè)步驟，而不用再測量或再配制)。在一些實(shí)施方案中，選擇的INVADER分析試劑組分同時(shí)進(jìn)行混合并預(yù)先配制。在其他的實(shí)施方案中，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)先配制的分析試劑組分被預(yù)先配制并提供于反應(yīng)容器中(包括而不限于反應(yīng)管或孔，如在例如微孔滴定板中)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)先配制的INVADER分析試劑組分在反應(yīng)容器中干燥(例如，脫干或凍干)。
在一些實(shí)施方案中，INVADER分析試劑作為試劑盒提供。如這里使用的，術(shù)語“試劑盒”指用于遞送材料的任何遞送體系。在反應(yīng)分析的上下文中，這種遞送體系包括允許從一個(gè)地方貯存，轉(zhuǎn)運(yùn)或遞送反應(yīng)試劑(例如，合適的容器中的寡核苷酸，酶等等)和/或支持材料(例如，緩沖液，用于執(zhí)行分析的書面指導(dǎo)等等。)到另一個(gè)地方的體系。例如，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)含有相關(guān)的反應(yīng)試劑和/或支持材料的封裝體(例如，盒子)。如這里使用的，術(shù)語“分離試劑盒(fragmented kit) ”指包括兩個(gè)或多個(gè)分離的容器的遞送體系，每個(gè)容器含有總試劑盒組分的一個(gè)亞部分。[0050]容器可以同時(shí)或單獨(dú)地遞送給目的受體。例如，第一容器可包含用于分析的酶，而第二容器包含寡核苷酸。術(shù)語“分離試劑盒”指包括含有聯(lián)邦食品藥品和化妝品法案第520(e)項(xiàng)下規(guī)定的分析物特異性試劑(ASR)的試劑盒，但不限于此。甚至，任何包括兩個(gè)或多個(gè)分離的容器的遞送系統(tǒng)，其中每個(gè)都含有總試劑盒組分的一個(gè)亞部分，都包括在術(shù)語“分離試劑盒”中。相反，“組合試劑盒”指在一個(gè)容器(例如，一個(gè)盒子中裝有每種所需的組分)含有反應(yīng)分析的全部組分的遞送體系。術(shù)語”試劑盒”包括分離和組合試劑盒。
在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了 INVADER分析試劑試劑盒，其含有實(shí)施本發(fā)明所需的一種或多種組分。例如，本發(fā)明提供了用于儲(chǔ)存或遞送實(shí)踐INVADER分析所需的酶和/或反應(yīng)組分的試劑盒。試劑盒可包括分析必要的或所需的任何和所有組分，包括但不限于，試劑本身、緩沖液、對照試劑(例如，組織樣品、陽性和陰性對照靶寡核苷酸等等)、固體支持物、標(biāo)記、書面的和/或圖示的指導(dǎo)和產(chǎn)品信息、抑制劑、標(biāo)簽和/或檢測試劑、包裝環(huán)境參數(shù)調(diào)節(jié)(例如，冰凍、干燥劑等等)等等。在一些實(shí)施方案中，試劑盒提供了部分所需的組分，其中期望用戶提供剩余的組分。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩個(gè)或多個(gè)分離的容器，其中每個(gè)容器裝有部分待遞送的組分。例如，第一個(gè)容器(例如，盒子)可包含酶(例如，處于合適的儲(chǔ)存緩沖液和容器中的結(jié)構(gòu)特異性裂解酶)，而第二個(gè)盒子可包含寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸、對照靶寡核苷酸等等)。
如這里使用的術(shù)語“標(biāo)記”指可用于提供可檢測(優(yōu)選可計(jì)量的)作用的任何原子或分子，而且其可附著于核酸或蛋白質(zhì)。標(biāo)記包括但不局限于染料；放射性標(biāo)記如32P ；結(jié)合部分如生物素；半抗原如地高辛配基；發(fā)光，磷光或熒光部分；質(zhì)量標(biāo)簽；單獨(dú)的熒光染料或與能通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)抑制或改變發(fā)射光譜的部分組合。標(biāo)記通過熒光、放射性、比色法、重量分析法、X-射線衍射或吸收、磁性、酶活性、質(zhì)量特性或受質(zhì)量影響的特性(例如，MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜法)等等可提供可檢測的信號。標(biāo)記可以是帶電荷的部分(正或負(fù)電荷)或者可選擇地，可以是中性電荷。標(biāo)記可以包括或由核酸或蛋白質(zhì)序列組成，只要包括該標(biāo)記的序列是可檢測的。
如這里使用的，關(guān)于信號的術(shù)語“獨(dú)特的”指能使一個(gè)區(qū)別于另一個(gè)的信號，例如，通過光譜特性如熒光發(fā)射波長、顯色、吸光度、質(zhì)量、大小、熒光偏振特性、電荷等等，或通過與另一個(gè)部分如與化學(xué)試劑、酶、抗體等等相互作用的能力。
如這里使用的，術(shù)語“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”用于指通過堿基配對規(guī)則相關(guān)的多核苷酸(也即，核苷酸如寡核苷酸或靶核酸的序列)。例如，對于序列“5' -A-G-T-3'，，，與序列“3' -T-C-A-5' ”是互補(bǔ)的?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中根據(jù)堿基配對規(guī)則僅僅一些核酸的堿基是匹配的?；蛘撸怂嶂g可以是“完全”或“全部”互補(bǔ)。核酸鏈之間互補(bǔ)的程度對核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著的影響。這在擴(kuò)增反應(yīng)，以及取決于核酸之間的結(jié)合的檢測方法中尤其重要。該術(shù)語也可用于單個(gè)的核苷酸，尤其在多核苷酸的上下文中。例如，寡核苷酸內(nèi)特定的核苷酸因?yàn)榕c另一個(gè)核酸鏈內(nèi)核苷酸的互補(bǔ)或不互補(bǔ)而被注意，相反或者對余下的寡核苷酸與核酸鏈之間的互補(bǔ)性進(jìn)行比較。
術(shù)語“同源性”與“同源”指同一性的程度?？梢允遣糠滞椿蛘咄耆?。部分同源序列是一個(gè)序列與另一個(gè)序列的同一丨I"生小于100%。
如這里使用的，術(shù)語“雜交”用于指互補(bǔ)核酸的配對。雜交與雜交的強(qiáng)度(也即，核酸之間的相關(guān)強(qiáng)度)受這些因子的影響如核酸之間的互補(bǔ)程度，涉及的條件的嚴(yán)謹(jǐn)度，和形成的雜種的Tm。“雜交”方法包括一個(gè)核酸與另一個(gè)互補(bǔ)核酸也即具有互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸退火。包含互補(bǔ)序列的核酸的兩個(gè)聚合物找到彼此，并通過堿基配對相互作用退火的能力是熟知的現(xiàn)象。Marmur和Lane最早觀察到“雜交”過程，Proc. Natl. Acad. Sci. USA46 :453(1960)和 Doty 等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA 46 :461 (1960)，接著把該過程改進(jìn)成為現(xiàn)代生物學(xué)的必需工具。
如這里使用的核酸序列的互補(bǔ)，指一個(gè)寡核苷酸當(dāng)其與某個(gè)核酸序列進(jìn)行序列比對，以使一個(gè)序列的5'末端與另一個(gè)序列的3'末端配對時(shí)，其是“反向平行結(jié)合”的。某些在天然核酸中通常不能找到的堿基，可包括在本發(fā)明的核酸中，而且包括，例如，肌苷和7-脫氮鳥嘌呤?；パa(bǔ)不必是最佳的；穩(wěn)定的雙螺旋可包含錯(cuò)配的堿基對或不匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練技術(shù)人員可以根據(jù)許多變量包括，例如，寡核苷酸的長度，寡核苷酸的堿基組成和序列，離子強(qiáng)度以及錯(cuò)配的堿基對發(fā)生率，憑經(jīng)驗(yàn)確定雙螺旋的穩(wěn)定性。
如這里使用的，術(shù)語“Tm”用于指“解鏈溫度”。解鏈溫度是一群雙鏈核酸分 子半分離成單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸的Tni的幾個(gè)等式是本領(lǐng)域熟知的。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)表明，當(dāng)核酸處于IM NaCl的水溶液中時(shí)，其Tm值的簡單估計(jì)可通過以下等式計(jì)算Tm = 81. 5+0. 41 ( % G+C),(參見，例如，Anderson 和 Young, QuantitativeFilterHybridization, Nucleic Acid Hybridization(1985)。其它的參考文獻(xiàn)(例如，Allawi,H. T. & SantaLucia,J. ,Jr. Thermodynamicsand NMR of internal G. T mismatchesin DNA. Biochemistry 36，10581-94(1997)包括更多的復(fù)雜計(jì)算，其把結(jié)構(gòu)和環(huán)境，以及序列特性考慮到Tm的計(jì)算中。
術(shù)語“基因”指DNA序列，其包括產(chǎn)生具有非編碼功能的RNA (例如，核糖體或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)所需的調(diào)節(jié)和編碼序列，多肽或前體。RNA或多肽可以由全長的編碼序列或由編碼序列的任何部分編碼，只要其保留所需的活性或功能。
術(shù)語“野生型”指當(dāng)從天然存在的來源分離時(shí)，具有該基因或基因產(chǎn)物的特性的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是在群體中最常觀察到的基因，并因此主觀地命名為該基因的“正常”或“野生型”形式。相反，術(shù)語“修飾的”、“突變體”或“多態(tài)的”指當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時(shí)，其在序列或功能特性(也即，改變的特性)中顯示修飾的基因或基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)注意，天然存在的突變體可以被分離；這些突變體可通過當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時(shí)，它們具有改變的特性的事實(shí)來鑒定。
如這里使用的術(shù)語“重組DNA載體”，指包含所需的異源序列的DNA序列。例如，雖然該術(shù)語不局限于使用表達(dá)的序列或編碼表達(dá)產(chǎn)物的序列，在一些實(shí)施方案中，異源序列是編碼序列與編碼序列在宿主有機(jī)體中復(fù)制，或可操作連接的編碼序列在特定的宿主有機(jī)體中表達(dá)所需的合適的DNA序列。在原核生物中表達(dá)所需的DNA序列包括啟動(dòng)子,任選地操縱子序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和可能其他的序列。真核細(xì)胞已知利用啟動(dòng)子，多腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。
如這里使用的術(shù)語“寡核苷酸”定義為包括兩個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，優(yōu)選至少5個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少大約10-15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少大約15到30個(gè)核苷酸。準(zhǔn)確大小取決于許多因子，其依次取決于寡核苷酸的最終功能或使用。寡核苷酸可以任何方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄、PCR或其組合。
因?yàn)閱魏塑账嵋允挂粋€(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸基通過磷酸二酯鍵附著于在一個(gè)方向與它鄰近的單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧的方式反應(yīng)，來制備寡核苷酸，如果它的5'磷酸基沒有與單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧連接，寡核苷酸的一個(gè)末端稱為“5'末端”，而且如果它的3'氧沒有與隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸基連接，寡核苷酸的末端則稱為“3'末端”。如這里使用的，核酸序列，即使較大寡核苷酸內(nèi)部的，也可認(rèn)為具有5'和3'末端。當(dāng)沿著核酸鏈以5'到3'方向移動(dòng)時(shí)，如果第一個(gè)區(qū)域的3'末端在第二個(gè)區(qū)域的5'末端前面，沿著核酸鏈的第一個(gè)區(qū)域認(rèn)為是另一個(gè)區(qū)域的上游區(qū)。
當(dāng)兩個(gè)不同的、非重疊寡核苷酸退火為同樣線性互補(bǔ)的核酸序列的不同區(qū)域，而且一個(gè)寡核苷酸的3'末端貓準(zhǔn)對著另一個(gè)寡核苷酸的5'末端時(shí),前者可以被稱為“上游”寡核苷酸，后者稱為“下游”寡核苷酸。類似地，當(dāng)兩個(gè)重疊的寡核苷酸雜交成為相同的線性互補(bǔ)核酸序列，而且第一個(gè)寡核苷酸處于使它的5'末端位于第二個(gè)寡核苷酸的5'末端的上游，第一個(gè)寡核苷酸的3'末端位于第二個(gè)寡核苷酸的3'末端的上游的位置時(shí)，第一個(gè)寡核苷酸可以被稱為“上游”寡核苷酸，第二個(gè)寡核苷酸可以被稱為“下游”寡核苷 酸。
術(shù)語“引物”指當(dāng)置于其中啟動(dòng)引物延伸的條件下時(shí)，能充當(dāng)合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在，如在純化的限制酶切消化中，或可合成產(chǎn)生。
選擇的引物與模板的特定序列鏈“基本上”互補(bǔ)。弓丨物必須充分互補(bǔ)以便與模板鏈雜交用于發(fā)生引物延伸。引物序列不必反映模板的確切序列。例如，不互補(bǔ)的核苷酸片段可附著于引物的5'末端，而引物序列的余下序列與模板鏈基本上互補(bǔ)?？梢砸氩换パa(bǔ)的堿基或較長的序列到引物中，只要該引物序列能與模板序列足夠互補(bǔ)以進(jìn)行雜交，并從而形成模板引物復(fù)合物用于引物延伸產(chǎn)物的合成。
如這里使用的術(shù)語“切割結(jié)構(gòu)”，指由至少一個(gè)探針寡核苷酸與靶核酸的相互作用形成的結(jié)構(gòu)，形成包括雙螺旋的結(jié)構(gòu)，得到的結(jié)構(gòu)通過切割單元是可切割的，包括但不限于酶。與核酸分子相反，切割結(jié)構(gòu)是一種用于通過裂解方式特異性裂解的基質(zhì)，核酸分子是一種用于通過試劑如磷酸二酯酶非特異性裂解的基質(zhì)，磷酸二酯酶能裂解核酸分子而不考慮二級結(jié)構(gòu)(也即，不需要形成雙鏈結(jié)構(gòu))。
如這里使用的術(shù)語“裂解方式”或“切割試劑”，指能對切割結(jié)構(gòu)進(jìn)行切割的任何方式，包括但不限于酶?！敖Y(jié)構(gòu)特異性核酸酶”或“結(jié)構(gòu)特異性酶”，是能識別核酸分子中的特異性二級結(jié)構(gòu)并裂解這些結(jié)構(gòu)的酶。本發(fā)明的裂解方式能切割對應(yīng)于形成切割結(jié)構(gòu)的核酸分子；裂解方式在切割結(jié)構(gòu)內(nèi)的任何特定位點(diǎn)都能對切割結(jié)構(gòu)進(jìn)行裂解是不必要的。
裂解方式可包括各種來源提供的核酸酶活性，包括裂解酶，F(xiàn)EN-I核酸內(nèi)切酶(包括RAD2與XPG蛋白質(zhì))，Taq DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I。裂解方式可包括具有 5'核酸酶活性的酶(例如，Taq DNA聚合酶(DNAP)，大腸桿菌DNA聚合酶I)。裂解方式還可包括具有5'核酸酶活性但是缺乏合成活性的修飾的DNA聚合酶。適于本發(fā)明的方法和試劑盒的裂解方式的例子提供于美國專利號5，614，402 ;5，795，763 ;5，843，669 ;6，090，606 ；PCT申請?zhí)朩O 98/23774 ；W0 02/070755A2 ;和WO 0190337A2，每個(gè)都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。
術(shù)語“熱穩(wěn)定的”當(dāng)用于酶時(shí)，如5'核酸酶，指該酶在高溫，也即在大約55°C或更高時(shí)具有功能或活性。
如這里使用的術(shù)語“切割產(chǎn)物”，指裂解方式與切割結(jié)構(gòu)反應(yīng)所產(chǎn)生的產(chǎn)物(也即，用裂解方式對切割結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理)。
術(shù)語“靶核酸”指包含具有至少部分與至少一個(gè)探針寡核苷酸互補(bǔ)，同時(shí)可具有至少部分與INVADER寡核苷酸互補(bǔ)的序列的核酸分子。靶核酸可包括單鏈或雙鏈DNA或RNA。
術(shù)語“非靶切割產(chǎn)物”指非來源于靶核酸的裂解反應(yīng)的產(chǎn)物。如上所述討論的，在本發(fā)明的方法中，切割結(jié)構(gòu)的裂解通常發(fā)生于探針寡核苷酸內(nèi)。通過這種靶核酸依賴的裂解所產(chǎn)生的探針寡核苷酸的片段是“非靶切割產(chǎn)物”。術(shù)語“探針寡核苷酸”指在存在或缺乏INVADER寡核苷酸時(shí)，與靶核酸相互作用以形成切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。當(dāng)與靶核酸退火時(shí)，探針寡核苷酸與靶形成切割結(jié)構(gòu)，而且裂解發(fā)生于探針寡核苷酸內(nèi)。
術(shù)語“INVADER寡核苷酸”指在探針與靶核酸之間雜交的區(qū)域附近的位置與靶核酸雜交的寡核苷酸，其中INVADER寡核苷酸包括和探針與靶之間雜交的區(qū)域重疊的部分(例如，化學(xué)部分，或核苷酸-無論與祀互補(bǔ)與否)。在一些實(shí)施方案中，INVADER寡核苷酸包括其3'末端與探針寡核苷酸的5'末端的序列基本上相同的序列。
如這里使用的術(shù)語“表達(dá)盒”指設(shè)計(jì)用于在INVADER分析中對應(yīng)于探針寡核苷酸的裂解，產(chǎn)生可檢測信號的寡核苷酸或寡核苷酸的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)盒與來自探針寡核苷酸裂解的非靶切割產(chǎn)物雜交，以形成另一個(gè)侵入性切割結(jié)構(gòu)，如此表達(dá)盒然后可以被裂解。
在一些實(shí)施方案中，表達(dá)盒是包括發(fā)夾部分的單個(gè)寡核苷酸(也即，區(qū)域中表達(dá)盒寡核苷酸的一部分與相同寡核苷酸的另一部分在反應(yīng)條件下雜交，以形成雙螺旋)。在其它的實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括含有在反應(yīng)條件下能形成雙螺旋的互補(bǔ)部分的至少兩個(gè)寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括標(biāo)記。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用的標(biāo)記部分。
術(shù)語“基本上單鏈”當(dāng)用于核酸基質(zhì)時(shí)，指與以通過鏈內(nèi)堿基配對相互作用結(jié)合在一起的雙鏈核酸存在的雙鏈基質(zhì)相反，該基質(zhì)分子主要以單鏈核酸存在。
如這里使用的，短語“非擴(kuò)增的寡核苷酸檢測分析”，指設(shè)計(jì)用于檢測沒有被擴(kuò)增(例如，通過PCR)，不產(chǎn)生靶序列拷貝的靶序列(例如，基因組DNA)中存在或缺乏特定多態(tài)性(例如，SNP，重復(fù)序列，等等)的檢測分析?！胺菙U(kuò)增的寡核苷酸檢測分析”可，例如，擴(kuò)增用于表明靶序列中存在或缺乏特定多態(tài)性的信號，只要該靶序列沒有被拷貝。
如這里使用的，短語“非擴(kuò)增寡核苷酸檢測分析”，指設(shè)計(jì)用于檢測靶序列(例如，基因組DNA，或擴(kuò)增的或其他的合成DNA)中存在或缺乏特定多態(tài)性(例如，SNP，重復(fù)序列，等等)的檢測分析，而不產(chǎn)生靶序列的拷貝?！胺菙U(kuò)增寡核苷酸檢測分析”可，例如，擴(kuò)增用于表明靶序列中存在或缺乏特定多態(tài)性的信號，只要該靶序列沒有被拷貝。
如這里使用的術(shù)語“序列變異”指兩個(gè)核酸之間核酸序列中的差異。例如，野生型結(jié)構(gòu)基因與該野生型結(jié)構(gòu)基因的突變體形式，由于存在單個(gè)堿基取代和/或缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸，可在序列方面有差異。結(jié)構(gòu)基因的這兩種形式被認(rèn)為彼此在序列方面有差異。結(jié)構(gòu)基因的另一種突變體形式可能存在。該另一種突變體形式被認(rèn)為與野生型基因和該基因的第一種突變體形式在序列方面有差異。
如這里使用的術(shù)語“釋放”，指在例如5'核酸酶的作用下，從較大的核酸片段如寡核苷酸釋放核酸片段，以便釋放的片段不再共價(jià)附著于寡核苷酸的剩余部分。
如這里使用的術(shù)語“K/，指酶的米-曼氏常數(shù)，定義為特定底物的濃度，即給定酶、在酶催化反應(yīng)中達(dá)到它的最大速度的一半時(shí)的濃度。
如這里使用的術(shù)語“核苷酸類似物”，指修飾的或非天然存在的核苷酸，包括但不限于具有改變的堆積相互作用如7-脫氮嘌呤(也即，7-脫氮脫氧腺苷三磷酸和7-脫氮-2-脫氧鳥苷三磷酸)的類似物；具有改變的氫鍵鍵合構(gòu)象的堿基類似物(例如，如Iso-C和Iso-G以及S. Benner的美國專利6，001, 983中描述的其它非標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對)；非氫鍵鍵合類似物(例如，B. A. Schweitzer 和 E. T. Kool, J. Org. Chem.，1994，59，7238-7242，
B.A. Schweitzer 和 E. T. Kool, J. Am. Chem. Soc.，1995，117，1863-1872 所述的非極性的，芳香族的核苷類似物如2，4_ 二氟代甲苯)；“通用”堿基如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(分別如“K”和“P”核苷酸；P.Kong，等人，Nucleic Acids Res.，1989，17，10373-10383，P. Kong 等人，Nucleic Acids Res.，1992，20，5149-5152)。核苷酸類似物包括脫氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修飾形式。
術(shù)語“多態(tài)基因座”是群體中存在的基因座，其在群體的成員之間顯示變異(例如，最常見的等位基因的頻率小于0. 95)。相反，“單態(tài)基因座”指在群體的成員之間很少或 沒有觀察到變異的基因位點(diǎn)(通常指在該基因座中，最常見的等位基因在群體的基因庫中的頻率超過0. 95)。
如這里使用的術(shù)語“微生物”指有機(jī)體太小而不能用肉眼觀察到，而且包括但不限于細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物，真菌和纖毛蟲。
術(shù)語“微生物的基因序列”指來源于微生物的基因序列。
術(shù)語“細(xì)菌”指任何細(xì)菌種類包括真細(xì)菌和古細(xì)菌種類。
術(shù)語“病毒”指沒有自主復(fù)制能力(也即，復(fù)制需要利用宿主細(xì)胞的工具)的專性，超顯微的，胞內(nèi)寄生物。
術(shù)語“多藥抗性”或“多重藥物抗性的”指微生物能抗超過一種用于處理所述微生物的抗生素或抗微生物劑。
說明書和權(quán)利要求
中存在的術(shù)語“樣品”以它的廣義意義使用。一方面，它的意思包括樣本或培養(yǎng)物(例如，微生物學(xué)的培養(yǎng)物)。另一方面，它的意思包括生物學(xué)和環(huán)境樣品。樣品可包括合成來源的樣本。
生物樣品可以是動(dòng)物，包括人，液體，固體(例如，糞便)或組織，以及液體和固體食物和飼養(yǎng)產(chǎn)物和成分如乳品物品，蔬菜，肉和肉類加工副產(chǎn)品和廢物。生物樣品可以獲自家畜，以及未馴服的或野生動(dòng)物的所有不同家系，包括但不限于，這些動(dòng)物如有蹄類、熊、魚類、Iagamorphs、哨齒類,等等。
環(huán)境樣品包括環(huán)境材料如表面物質(zhì)，土壤，水和工業(yè)樣品，以及從食品和乳品加工儀器，裝置，設(shè)備，用具等獲得的樣品，一次性用品以及非一次性用品。這些例子不認(rèn)為是對適用于本發(fā)明的樣品類型的限制。
術(shù)語“靶核酸的來源”指包含核酸(RNA或DNA)的任何樣品。尤其優(yōu)選的靶核酸來源是生物樣品，包括但不限于血液，唾液，大腦脊髓液，胸膜液，乳汁，淋巴，痰液和精液。
如果寡核苷酸以高于另一個(gè)寡核苷酸(或靶核酸序列)的摩爾濃度存在，認(rèn)為該寡核苷酸以相對于另一個(gè)寡核苷酸(靶核酸序列)“過量”存在。當(dāng)寡核苷酸如探針寡核苷酸在裂解反應(yīng)中以相對于互補(bǔ)的靶核酸序列的濃度過量存在時(shí)，該反應(yīng)可用于表明存在的靶核酸的量。一般地，當(dāng)過量存在時(shí)，探針寡核苷酸將以至少100倍摩爾過量存在；典型地，當(dāng)靶核酸序列以大約10飛摩爾或更少存在時(shí)，每個(gè)探針寡核苷酸以至少I皮摩爾使用。
“懷疑包含”第一和第二靶核酸的樣品，可包含兩個(gè)靶核酸分子之一，二者或者都不包含
術(shù)語“反應(yīng)物”在這里以其廣義意義使用。反應(yīng)物可包括，例如，酶促反應(yīng)物，化學(xué)反應(yīng)物或光(例如，紫外光，尤其是短波長紫外光已知能打斷寡核苷酸鏈)。能與寡核苷酸反應(yīng)以縮短(也即，裂解)或者延伸寡核苷酸的任何試劑都包含在術(shù)語“反應(yīng)物”內(nèi)。
如這里使用的，術(shù)語“純化的”或“純化”指從樣品除去污染物。例如，重組體CLEAVASE核酸酶在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)，通過除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)對核酸進(jìn)行純化；從而增加這些重組體核酸酶在樣品中的百分比。
如這里使用的術(shù)語“部分”，當(dāng)涉及蛋白質(zhì)時(shí)(如在“給定蛋白質(zhì)的部分”中)，指該蛋白質(zhì)的片段。片段的大小可以從4個(gè)氨基酸殘基到全部的氨基酸序列減去I個(gè)氨基酸(例如，4, 5,6,…，,n-1)。
如這里使用的術(shù)語“核酸序列”指寡核苷酸，核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，以及基因組或合成來源的DNA或RNA，其可以是單鏈或雙鏈的，而且代表有義或反義鏈。類似地，如這里使用的“氨基酸序列”指肽或蛋白質(zhì)序列。
如這里使用的，術(shù)語“純化的”或“基本上純化的”指從它們的天然環(huán)境移取的，分離的或分離的分子，核酸或氨基酸序列，而且其至少60%游離，優(yōu)選75%游離，最優(yōu)選90%游離于其天然締合的其他的組分?！胺蛛x的多核苷酸”或“分離的寡核苷酸”因此是基本上純化的多核苷酸。
如這里使用的術(shù)語“連續(xù)的核酸鏈”，指具有連續(xù)的，共價(jià)連接的主鏈結(jié)構(gòu)，而沒有缺口或其他的破壞的核酸鏈。每個(gè)核苷酸的堿基部分的特性，無論是堿基對，單鏈或錯(cuò)配，都不是連續(xù)鏈的定義中的成員。連續(xù)鏈的主鏈不局限于天然存在的，未修飾的核酸的核糖-磷酸或脫氧核糖-磷酸組合物。本發(fā)明的核酸可包括主鏈結(jié)構(gòu)中的修飾，包括但不限于硫代磷酸酯殘基，膦酸酯殘基，2'取代的核糖殘基(例如，2' -0-甲基核糖)和含有殘基的備擇的糖(例如，阿拉伯糖)。
如這里使用的術(shù)語“連續(xù)的雙螺旋”，指雙鏈核酸的區(qū)域，其中對在雙螺旋內(nèi)的堿基對的進(jìn)展沒有破壞(也即，沿著雙螺旋的堿基對沒有被扭曲而提供缺口，凸出或與連續(xù)雙螺旋區(qū)域范圍內(nèi)錯(cuò)配)。如這里使用的，該術(shù)語僅僅涉及雙螺旋內(nèi)堿基對的排列，而不暗示核酸鏈的主鏈部分中的連續(xù)性。具有連續(xù)的堿基配對，但是在一條或兩條鏈中有缺口的雙螺旋核酸，在連續(xù)雙螺旋的定義內(nèi)。
術(shù)語“雙螺旋”指其中一條鏈上的核苷酸的堿基部分通過氫鍵鍵合與另一條鏈上排列的它們的互補(bǔ)堿基結(jié)合的核酸狀態(tài)。處于雙螺旋形式的情況反映了核酸的堿基狀況。根據(jù)堿基配對，核酸鏈還通常假定雙螺旋的三級結(jié)構(gòu)，具有大溝和小溝。螺旋狀形式的假設(shè)在成為雙螺旋時(shí)是絕對的。
術(shù)語“模板”指在其上通過模板依賴的核酸聚合酶活性，從核苷三磷酸生成互補(bǔ)的拷貝的核酸鏈。在雙螺旋內(nèi)，按照慣例，模板鏈被敘述和描述為“底”鏈。類似地，非模板鏈常常敘述和描述為“頂”鏈。
短語“5' UTR基因型模式”指從至少兩種寡核苷酸檢測分析得到的組合結(jié)果，該寡核苷酸檢測分析設(shè)計(jì)用于檢測丙型肝炎病毒5' UTR序列中的單核苷酸多態(tài)性，并提供每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位置的至少部分基因型信息。5' UTR基因型模式不包含來自非5' UTR HCV序列的序列信息(例如，來自編碼區(qū)的序列信息)。每個(gè)樣品的5' UTR基因型模式的例子顯示于圖4，5C，6C和9中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，5' UTR基因型模式足以對丙型肝炎病毒進(jìn)行基因分型(例如，劃分成基因型I、II、III、IV、V和VI)，而不需要來自丙型肝炎病毒非5' UTR序列的另外的序列信息。
如這里使用的，與特定的5' UTR HCV單核苷酸多態(tài)性有關(guān)的短語“部分基因型信息”，指被檢測的特定堿基，顯示使被檢測的HCV的可能基因型具體化為標(biāo)準(zhǔn)的6個(gè)HCV基因型的2個(gè)至5個(gè)之間的信息(也即，部分基因型信息不提供準(zhǔn)確的基因型，但是至少排除了 6個(gè)HCV基因型中的至少I個(gè)，而且可能使它縮小至2個(gè)可能的基因型)。分析A提供了提供部分基因型信息的一個(gè)例子(檢測位置-118)，其中的陽性結(jié)果(檢測到“G”)表明可能存在基因型I、V或VI(參見
圖10中的位置-118，其表明僅僅基因型I，V和VI在該位置具有“G”)。如果一個(gè)特定的寡核苷酸檢測分析提供了 “至少”部分基因型信息，該分析至少排除了 6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)HCV基因型中的I個(gè)，而且通過這種單核苷酸多態(tài)性可提供準(zhǔn)確的基因型(例如，圖7中的分析H，如果檢測，顯示存在基因型VI ;參見圖10，其表明僅僅基因型VI在位置-144/5具有“C，，[CA插入])。
附圖簡述
圖I顯示了用于在單個(gè)反應(yīng)中檢測2個(gè)不同的等位基因(例如，相差一個(gè)核苷酸)的INVADER寡核苷酸，探針寡核苷酸和FRET表達(dá)盒的示意圖。
圖2顯示了在設(shè)計(jì)用于檢測HCV序列的COBAS AMPLIC0R病毒負(fù)荷分析產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子上進(jìn)行的侵入性切割分析的結(jié)果。
圖3顯示了在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中檢測分析組分的序列。探針的3'末端包含己二醇保護(hù)基。小寫字母表明非互補(bǔ)的翼。
圖4顯示使用本發(fā)明的分析組分得到的HCV 5' UTR基因型模式的圖解。
圖5顯示了在用COBAS AMPLIC0R監(jiān)控試劑產(chǎn)生的HCV的5' UTR的PCR擴(kuò)增子上進(jìn)行的侵入性切割分析的結(jié)果。11個(gè)樣品中每個(gè)的5' UTR基因型模式顯示于圖5C中。
圖6顯示了在用COBAS TAQMAN試劑產(chǎn)生的HCV的5' UTR的PCR擴(kuò)增子上進(jìn)行的侵入性切割分析的結(jié)果。11個(gè)樣品中每個(gè)的5' UTR基因型模式顯示于圖6C中。
圖7顯示了用設(shè)計(jì)用來檢測HCV序列的COBAS AMPLIC0R病毒負(fù)荷分析產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子混合物上進(jìn)行的侵入性切割分析的結(jié)果。
圖8顯示了在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中檢測分析組分的序列。探針的3'末端包含己二醇保護(hù)基。小寫字母表明非互補(bǔ)的翼。
圖9顯示了在HCV的5' UTR的PCR擴(kuò)增子上利用備擇的寡核苷酸進(jìn)行的侵入性切割分析的結(jié)果。11個(gè)樣品中每個(gè)的5' UTR基因型模式顯示于該圖中。
圖10顯示了 HCV的5' UTR區(qū)域的-274到-31中，6個(gè)HCV基因型中每個(gè)的共有序列的序列比對。來自6個(gè)基因型的每個(gè)序列標(biāo)記如下基因型I (SEQ ID NO 64);基因型 II (SEQ ID NO 65);基因型 III (SEQ ID NO 66);基因型 IV(SEQ ID NO 67);基因型V(SEQ ID NO 68);和基因型VI (SEQ ID NO :69)。并且，標(biāo)記了不同的單核苷酸多態(tài)性位 置，包括-245 ;_188(對照)；-167 ；-163 ；-155 ；-144/5 ；-118 -M -80 ;其在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中進(jìn)行檢測，以提供至少部分的基因型信息(其可通過參考該圖來確定)。該圖還顯示了示例性引物的位置，其可用于擴(kuò)增HCV的5' UTR區(qū)域。
發(fā)明描述
本發(fā)明提供了形成依賴于靶核酸的存在的核酸切割結(jié)構(gòu)，并切割該核酸切割結(jié)構(gòu)以便釋放特異的切割產(chǎn)物的方法。5'核酸酶活性，例如，用于裂解該靶依賴的切割結(jié)構(gòu)，而且得到的切割產(chǎn)物能指示樣品中特異性靶核酸序列的存在。當(dāng)核酸或寡核苷酸的兩條鏈(都與靶核酸鏈雜交，)以致它們形成重疊的侵入性切割結(jié)構(gòu)時(shí)，如下所述，可出現(xiàn)侵入性切割。通過切割試劑(例如，5'核酸酶)與上游寡核苷酸的相互作用，切割試劑可以產(chǎn)生特異片段的方式在內(nèi)部位點(diǎn)裂解下游寡核苷酸。這種實(shí)施方案稱為INVADER分析(ThirdWaveTechnologies)，并描述于美國專利號 5，846，717,5, 985，557,5, 994，069,6, 001，567，6，090，543，6，348，314 和 6，458，535，WO 97/27214 和 WO 98/42873，Lyamichev 等人，Nat. Biotech.，17 :292 (1999)，Hall 等人，PNAS，USA，97 :8272 (2000)，每個(gè)都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的)。
通過結(jié)構(gòu)特異性酶對特異性結(jié)構(gòu)的酶促裂解，INVADER分析能檢測探針與靶的雜交(參見，例如，美國專利號 5，846，717 ;6，090，543 ;6，001，567 ;5，985，557 ；5，994，069 ;6，090，543 ;6，348，314 ;6，458，535 ;美國專利公開號 20030186238 (系列號No. 10/084839) ；20030104378A1 (系列號 09/864636) ；Lyamichev 等人，Nat. Biotech.，17 292(1999)，Hall 等人，PNAS, USA, 97 :8272 (2000)，WO 97/27214 和 WO 98/42873，每個(gè)都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的)。
使用結(jié)構(gòu)特異性酶(例如，F(xiàn)EN核酸內(nèi)切酶)來裂解由重疊的寡核苷酸探針雜交形成的復(fù)合物，INVADER分析可檢測特異性DNA和RNA序列(參見，例如，圖I)。高溫和一種探針過量，能使對于存在的每個(gè)靶序列的多重探針被裂解，而不需要溫度循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，這些裂解的探針然后指導(dǎo)另一個(gè)標(biāo)記的探針的裂解。第二探針寡核苷酸可用熒光素進(jìn)行5'末端標(biāo)記，熒光素被內(nèi)部染料猝滅。裂解之后，脫猝滅的熒光素標(biāo)記產(chǎn)物可使用標(biāo)準(zhǔn)熒光平板讀數(shù)器進(jìn)行檢測。
INVADER分析能檢測未擴(kuò)增的、以及擴(kuò)增的RNA和DNA包括基因組DNA中的特異性序列、突變和SNP。在圖I示意顯示的實(shí)施方案中，INVADER分析使用2個(gè)級聯(lián)步驟(初級和次級反應(yīng))都產(chǎn)生而且然后擴(kuò)大了靶特異性信號。為了方便起見，下面討論中的等位基因被稱作野生型(WT)和突變體(MT)，盡管這些術(shù)語不能應(yīng)用于所有的遺傳變異。在初級反應(yīng)中(圖I，系列A)，WT初級探針和INVADER寡核苷酸先后與靶核酸雜交而形成重疊結(jié)構(gòu)。WT初級探針的5'末端含有不成對的“翼”。結(jié)構(gòu)特異性酶(例如，CLEAVASE酶，ThirdWaveTechnologies)能識別重疊、并裂解不成對的翼,釋放它作為祀特異性產(chǎn)物。在次級反應(yīng)中，該切割產(chǎn)物用作WT熒光共振能量轉(zhuǎn)移(WT-FRET)探針上的INVADER寡核苷酸，又產(chǎn)生能被結(jié)構(gòu)特異性酶識別的結(jié)構(gòu)(系列A)。當(dāng)通過裂解把單個(gè)FRET探針上的兩個(gè)染料分開時(shí)(圖I中的箭頭所示)，就可產(chǎn)生高于背景熒光的可檢測熒光信號。因此，這種二級結(jié)構(gòu)的裂解導(dǎo)致熒光的增加，這表明WT等位基因的存在(或突變體等位基因，如果分析是設(shè)計(jì)用于突變體等位基因以產(chǎn)生可檢測信號)。在一些實(shí)施方案中，具有不同標(biāo)記的FRET探針(例如，通過發(fā)射或激發(fā)波長差異可分辨的，或通過時(shí)間分辨熒光檢測可分辨的)，提供用于待檢測的每個(gè)等位基因或基因座，以便可以在單個(gè)反應(yīng)中檢測不同的等位基因或基因座。在這些實(shí)施方案中，可以在單個(gè)分析中組合初級探針組和不同的FRET探針，以允許對來自相同樣品的每個(gè)等位基因或基因座的信號進(jìn)行比較。
如果初級探針寡核苷酸與靶核苷酸序列在裂解位點(diǎn)不匹配(例如，與MT主要探針和WT靶，圖1，系列B)，不能形成重疊結(jié)構(gòu)，而且裂解被抑制。使用的結(jié)構(gòu)特異性酶(例如，CLEAVASE VIII酶，Third WaveTechnologies)，裂解重疊結(jié)構(gòu)比非重疊結(jié)構(gòu)更有效(例如，至少340倍)，以允許極好的等位基因的鑒別。
探針周轉(zhuǎn)而不需要溫度循環(huán)，以使每個(gè)靶產(chǎn)生許多信號(也即，線性信號放大)。類似地，每個(gè)靶特異性產(chǎn)物都能使許多FRET探針裂解。
初級INVADER分析反應(yīng)是針對被檢測的靶DNA (或RNA)。由于INVADER和初級探針以摩爾過量提供，靶DNA是第一次侵入性切割中的限制組分。在第二次侵入性切割中，釋放的翼是限制性的。當(dāng)這2個(gè)裂解反應(yīng)相繼進(jìn)行時(shí)，來自組合反應(yīng)的熒光信號相對于靶DNA的量線性積累。在次級反應(yīng)中，每個(gè)釋放的5'-翼可用作熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)表達(dá)盒中的INVADER寡核苷酸，以產(chǎn)生另一個(gè)可被CLEAVASE酶識別和裂解的重疊結(jié)構(gòu)(圖I)。當(dāng)FRET表達(dá)盒被裂解時(shí)，熒光團(tuán)(F)和猝滅劑(Q)被分開，產(chǎn)生可檢測的熒光信號。與初始反應(yīng)類似，釋放的5'-翼和FRET表達(dá)盒循環(huán)，導(dǎo)致放大的熒光信號。初始和次級反應(yīng)在同一個(gè)孔中同時(shí)進(jìn)行。
二重形式的INVADER DNA分析，能在一個(gè)孔中同時(shí)檢測2個(gè)DNA序列。最經(jīng)常地，這涉及特定多態(tài)性的2個(gè)變體的檢測。二重形式使用2個(gè)不同的有區(qū)別的初級探針，其中每個(gè)探針都具有獨(dú)特的5'-翼，與2個(gè)不同的FRET表達(dá)盒，其每個(gè)表達(dá)盒都具有光譜不同的熒光團(tuán)。有意地，釋放的5'-翼將只與它們各自的FRET表達(dá)盒結(jié)合，以產(chǎn)生靶特異性信號。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含實(shí)施本發(fā)明所必需的一個(gè)或多個(gè)組分的試劑盒。例如，本發(fā)明提供了用于儲(chǔ)存或遞送本發(fā)明的酶，和/或?qū)嵤┝呀夥治?例如，INVADER分析)所必需的反應(yīng)組分的試劑盒。舉例來說，而不是為了限制本發(fā)明的試劑盒到任何特定的結(jié)構(gòu)或組分的組合，以下部分描述了用于實(shí)施本發(fā)明的試劑盒一個(gè)實(shí)施方案
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了以下試劑
CLEAVASE酶(例如，初級寡核苷酸CLEAVASE X)
DNA反應(yīng)緩沖液I INVADER寡核苷酸
FRET表達(dá)盒I (例如，F(xiàn))
FRET表達(dá)盒2 (例如，R)
突變體DNA對照
野生型DNA對照
“無靶”空白對照
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了以下試劑
溶于2IOmM MgCl2,40%甘油中的含有溶于25mM M0PS，
CLEAVASE酶混合物pH7. 5中以下組分的突變的
(例如，CLEAVASEX)混合物
初級寡核苷酸
INVADER 寡核苷酸[0143]FRET表達(dá)盒1(例如，F(xiàn))
FRET表達(dá)盒2 (例如，另
一個(gè)F表達(dá)盒)
FRET表達(dá)盒3 (例如，R)
突變體DNA對照
內(nèi)部DNA對照
“無靶”空白對照
圖2，3和8中提供了適合用于本發(fā)明方法的初級寡核苷酸，次級寡核苷酸和FRET 表達(dá)盒的例子。雖然這里所示的寡核苷酸可用于本發(fā)明的許多方法和變化中，但是發(fā)現(xiàn)這些INVADER分析寡核苷酸組尤其可用于本發(fā)明的試劑盒。圖2，3和8中所示的寡核苷酸組可用作單獨(dú)的組以檢測單個(gè)靶DNA，或在二重或多重反應(yīng)中組合用于在單個(gè)反應(yīng)中檢測兩個(gè)或多個(gè)分析物或?qū)φ铡?br>在某些實(shí)施方案中，利用易接近的位點(diǎn)設(shè)計(jì)的寡核苷酸和/或橋連寡核苷酸進(jìn)行INVADER分析，或其它的核苷酸檢測分析。這些方法，程序和組合物描述于美國專利6，194，149, WO 9850403和TO 0198537，其都以其全部內(nèi)容特別地引入這里作為參考。
在某些實(shí)施方案中，靶核酸序列在檢測之前進(jìn)行擴(kuò)增(例如，以便產(chǎn)生合成的核酸)。在一些實(shí)施方案中，靶核酸包括基因組DNA。在其它的實(shí)施方案中，靶核酸包括合成DNA或RNA在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用純化的聚合酶產(chǎn)生樣品內(nèi)的合成DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用純化的聚合酶產(chǎn)生合成DNA包括使用PCR。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用適合用于本發(fā)明方法的純化DNA聚合酶產(chǎn)生合成DNA，包括使用滾環(huán)擴(kuò)增，(例如，如美國專利號6，210，884，6，183，960和6，235，502，其都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考)。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，合成DNA的產(chǎn)生包括通過從基因組DNA樣品上的多個(gè)位點(diǎn)引發(fā)，而拷貝基因組DNA。在一些實(shí)施方案中，從基因組DNA樣品上的多個(gè)位點(diǎn)引發(fā)，包括使用短的寡核苷酸引物(例如，小于大約8個(gè)核苷酸)。在其它的實(shí)施方案中，從基因組DNA上的多個(gè)位點(diǎn)引發(fā)，包括在有缺口的，雙鏈基因組DNA的3'末端的延伸(也即，通過破壞或裂解DNA雙鏈區(qū)域的一條鏈，其中一個(gè)3'羥基可用于延伸)。在有缺口的基因組DNA上，使用純化的聚合酶，其適合用于本發(fā)明的方法和組合物，制備合成DNA的一些例子提供于2000年09月12日公開的美國專利號6，117，634，和2001年03月06日公開的6，197，557，以及PCT公開號No. WO 98/39485，其都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測靶序列的方法，包括提供a)含有通過在有缺口的雙鏈基因組DNA的3'末端延伸進(jìn)行擴(kuò)增的DNA的樣品，所述基因組DNA懷疑含有所述靶序列；b)在存在所述靶序列時(shí)，能形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸；和c)使樣品暴露于該寡核苷酸和試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑包括切割試劑。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法更進(jìn)一步地包括檢測所述切割產(chǎn)物的步驟。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使樣品暴露于寡核苷酸和試劑，包括如果所述祀序列存在于所述樣品中，在其中所述靶序列于所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的條件下，使樣品暴露于寡核苷酸和試劑，其中通過所述切割試劑使所述侵入性切割結(jié)構(gòu)裂解以形成切割產(chǎn)物。
在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶序列包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域下游并且與所述第一區(qū)域相鄰，所述的寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸，其中至少部分的所述第一寡核苷酸與所述靶序列的所述第一部分完全互補(bǔ)，而且其中所述第二寡核苷酸包括3'部分和5'部分，其中所述5'部分與所述靶核酸的所述第二部分完全互補(bǔ)。
在其它的實(shí)施方案中，適合用于本發(fā)明的方法和組合物的合成DNA，使用純化的聚合酶在多引物的基因組DNA上制備，如例如美國專利號6，291，187和6，323，009，以及PCT公開號No. WO 01/88190和WO 02/00934中提供的，其都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的。在這些實(shí)施方案中，使用DNA聚合酶，如高持續(xù)合成的￠29聚合酶(如美國專利號5，198，543和5，001, 050中所述，其以其全部內(nèi)容引入這里作為參考用于各種目的)，聯(lián)合抗核酸外切酶的隨機(jī)引物，如六聚物，進(jìn)行DNA如基因組DNA的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測靶序列的方法，包括提供a)含有在基因組DNA上通過多引物延伸擴(kuò)增的DNA的樣品，所述基因組DNA懷疑含有所述靶序列；b)在存在所述靶序列時(shí)，能形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸；和c)使樣品暴露于該寡核苷酸和試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑包括切割試劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物是隨機(jī)引物。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物是抗核酸外切酶的。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法更進(jìn)一步地包括檢測所述切割產(chǎn)物的步驟。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使樣品暴露于寡核苷酸和試劑，包括如果所述祀序列存在于所述樣品中，在其中所述靶序列于所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的條件下，使樣品暴露于寡核苷酸和試劑，其中通過所述切割試劑使所述侵入性切割結(jié)構(gòu)裂解以形成切割產(chǎn)物。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使樣品暴露于寡核苷酸和試劑，包括如果所述祀序列存在于所述樣品中，在其中所述靶序列于所述寡核苷酸之間形成侵入性切割結(jié)構(gòu)的條件下，使樣品暴露于寡核苷酸和試劑，其中通過所述切割試劑使所述侵入性切割結(jié)構(gòu)裂解以形成切割產(chǎn)物。
在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶序列包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域下游并且與所述第一區(qū)域相鄰，所述的寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸，其中至少部分的所述第一寡核苷酸與所述靶序列的所述第一部分完全互補(bǔ)，而且其中所述第二寡核苷酸包括3'部分和5'部分，其中所述5'部分與所述靶核酸的所述第二部分完全互補(bǔ)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用INVADER檢測試劑(例如，初級探針，INVADER探針和FRET表達(dá)盒)，用于分析合并的樣本(例如，合并的血液樣品)的試劑盒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒更進(jìn)一步地包括關(guān)于如何進(jìn)行INVADER分析，和特別地如何把INVADER檢測分析用于來自許多受試者的合并的樣本，或用于來自單個(gè)受試者的許多細(xì)胞的“合并的”樣品(例如，來自活組織切片檢查樣品)的指導(dǎo)。
本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了一些分析，其中靶核酸在與寡核苷酸探針多重雜交，以及探針裂解期間，重復(fù)使用或重復(fù)循環(huán)，而不需要使用溫度循環(huán)(也即，用于靶核酸鏈的周期變性)或核酸合成(也即，用于靶或探針核酸鏈的基于聚合作用的取代)。當(dāng)在其中探針在靶鏈上被連續(xù)置換的條件下(例如，通過探針-探針取代或通過探針/靶締合與離解之間的平衡，或通過這些機(jī)制的組合，[寡核苷酸置換的動(dòng)力學(xué)。Luis P. Reynaldo,AlexanderV. Vologodskii, Bruce P. Neri 和 Victor I. Lyamichev. J. Mol. Biol. 97 :511-520 (2000)]，進(jìn)行裂解反應(yīng)時(shí)，多個(gè)探針可與相同的靶雜交，允許多個(gè)裂解，并產(chǎn)生多個(gè)切割產(chǎn)物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測分析設(shè)計(jì)用于檢測一個(gè)或多個(gè)HCV序列。在一些實(shí)施方案中，HCV基因型由一個(gè)或多個(gè)檢測分析的復(fù)合結(jié)果確定。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，對每個(gè)樣品進(jìn)行兩個(gè)或更多個(gè)檢測分析。仍然在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，對每個(gè)樣品進(jìn)行兩個(gè)或更多個(gè)檢測分析，以產(chǎn)生5' UTR基因型模式。在一些實(shí)施方案中，8個(gè)檢測分析用于產(chǎn)生5' UTR基因型模式。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行I個(gè)分析來檢測共有序列用作內(nèi)部對照分析。仍然在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于對含有HCV的樣品進(jìn)行基因分型的方法，其包括以下步驟a)檢測從所述HCV樣品的5' UTR擴(kuò)增的核酸中一個(gè)或多個(gè)(例如，2個(gè)或以上，5個(gè)或以上)單核苷酸多態(tài)性；b)根據(jù)來源于步驟a的信息產(chǎn)生5' UTR基因型模式；和，在一些實(shí)施方案中，比較所述5' UTR基因型模式與預(yù)先確定的HCV信息矩陣，以便確定所述受試者的HCV基因型。在 一些實(shí)施方案中，預(yù)先確定的HCV信息矩陣儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法更進(jìn)一步地包括在選擇用于受試者的療法中使用所述的HCV基因型(例如，選擇合適的藥物，選擇藥物的合適劑量，避免某些藥物，繼續(xù)施用某種藥物某些天等等。)。
在一些實(shí)施方案中，用于檢測分析的寡核苷酸與目的HCV祀序列完美互補(bǔ)。在其它的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含與感興趣的HCV靶序列的一個(gè)或多個(gè)不匹配。發(fā)現(xiàn)了不匹配的多個(gè)用途，包括但不限于，還原雜交效力的能力(其在一些探測分析形式中可能是要求的)，增加簡并性的能力(例如，檢測兩個(gè)或更多個(gè)菌株或變體)，和補(bǔ)償樣品中存在的序列變異的能力。在一些實(shí)施方案中，在測試群體的一些成員中鑒定了位于特定核苷酸位置的變異，提供在該位置序列不同的多個(gè)寡核苷酸，以便檢測該群體內(nèi)的每個(gè)變體。下面的實(shí)施例部分提供了用于侵入性切割分析的示例性檢測分析組分，用于HCV的某些基因型。應(yīng)該注意，使用這里提供的反應(yīng)設(shè)計(jì)和最佳化指南，這些探針組的設(shè)計(jì)(例如，寡核苷酸和/或它們的序列)，可以改變以用于RNA檢測分析。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了由用戶提供的一列附加組分(例如，試劑，供應(yīng)品和/或設(shè)備)，以進(jìn)行本發(fā)明的方法。例如，不是為了限制這些附加組分列表到任何特定的組分，這種列表的一個(gè)實(shí)施方案包括以下組分
澄清的CHILL0UT-14液體蠟(MJ Research)或無RNA酶，光學(xué)級礦物油(Sigma，Cat. No. M-5904)
96 孔聚丙烯微量培養(yǎng)板(MJ Research, Cat. No. MSP-9601)
無菌的I. 5ml或2. Oml微量離心管
無菌的，無DNA酶/RNA酶一次性氣霧劑障礙移液管吸頭
多通道移液管(0. 5-10 U 1,2. 5-20 U I)
熱循環(huán)儀或其他的熱源(例如，實(shí)驗(yàn)室烘箱或加熱器)。
繁雜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(試管架，微量加液器，多通道移液管，微量離心機(jī)，渦旋攪拌機(jī))。
熒光微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(優(yōu)選的平板讀數(shù)器是具有以下特性的裝備有光過濾器的高級讀數(shù)器
激發(fā)發(fā)射[0175](波長/帶寬)(波長/帶寬)
485nm/20nm 530nm/25nm
560nm/20nm 620nm/40nm
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了由用戶提供的一列任選組分(例如，試劑，供應(yīng)品和/或設(shè)備)，以便于進(jìn)行本發(fā)明的方法。例如，不是為了限制這些任選組分列表到任何特定的組分，這種列表的一個(gè)實(shí)施方案包括以下組分
無菌的8管條或微量培養(yǎng)板(任選的)
一次性塑料槽(任選的)
平板密封帶(任選的)
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了由用戶提供的一列需要的組分，以便于進(jìn)行本發(fā)明的方法，對本發(fā)明的方法來說多種替換物是可接受的(例如，樣品制備試劑盒)。例如，不是為了限制這些任選組分列表到任何特定的組分，這種列表的一個(gè)實(shí)施方案包括以下組分
QIAGEN QI Aamp 血液試劑盒
# Gentra Systems PUREGENE 試劑盒
Gentra Systems GENERATI ON 產(chǎn)品
在試劑盒的一些實(shí)施方案中，提供了詳細(xì)的方案。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了用于組合INVADER分析反應(yīng)的方案(例如，用于制備反應(yīng)混合物的制劑和優(yōu)選方法)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于組合反應(yīng)混合物的方案包括計(jì)算或圖解輔助法，以減少進(jìn)行本發(fā)明方法中的錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)(例如，便于計(jì)算多重反應(yīng)所需試劑的量的表格，和幫助裝配多孔分析平板以含有許多分析反應(yīng)的平板設(shè)計(jì)指導(dǎo))。舉例來說，不是為了限制這種方案到任何特定的內(nèi)容或形式，本發(fā)明的試劑盒可包括下列方案
I.詳細(xì)的DNA 二重INVADER分析方案
I.確定待測試樣品和對照的數(shù)量。
2.計(jì)劃每輪實(shí)驗(yàn)的微量培養(yǎng)板設(shè)計(jì)(例如，樣品，對照)。包括無靶對照(溶于緩沖的，無核酸酶水中的tRNA載體)對于有效的結(jié)果是需要的。
3.制備用于二重分析形式的INVADER DNA分析反應(yīng)混合物。為了計(jì)算分析所需的反應(yīng)組分的量(X體積)，I. 25[X體積(ii I) = #反應(yīng)xl. 25]乘以反應(yīng)的總數(shù)(樣品和對照)。把最后的試劑添加到混合物中后不久，充分地渦旋INVADER DNA分析反應(yīng)物。
INVADER DNA分析反應(yīng)混合物
二重分析形式
反應(yīng)組分IX體積X體積
DNA反應(yīng)緩沖液I5. Oy I
FRET F 表達(dá)盒l(wèi).Oyl
FRET R 表達(dá)盒l(wèi).Oyl
權(quán)利要求
1.一種包含用于多個(gè)侵入性切割分析的試劑的組合物，其中用于每一個(gè)所述侵入性切割分析的試劑包含探針組，所述探針組含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸， 所述第一寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中所述第一寡核苷酸的3'部分設(shè)計(jì)成與HCV的5' UTR序列雜交，而其中所述第一寡核苷酸的5'部分設(shè)計(jì)成不與HCV的所述5' UTR序列雜交， 所述第二寡核苷酸包含5'部分和3'部分，其中所述第二寡核苷酸的5'部分設(shè)計(jì)成與相鄰于所述第一寡核苷酸的雜交區(qū)域的HCV的5' UTR序列雜交，而其中所述第二寡核苷酸的3'部分設(shè)計(jì)成與所述第一寡核苷酸和所述HCV的5' UTR序列之間的雜交區(qū)域重疊，從而當(dāng)所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸都與HCV的5，UTR序列雜交時(shí)，形成重疊的侵入性切割結(jié)構(gòu)， 所述組合物用于檢測HCV的5' UTR序列位置上的至少兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性的有無，所述位置選自-245，-167，-163，-155，-144，-118和_80，其中所述位置見于如圖10中所示 的 SEQ ID NO :64，65，66，67，68 和 69。
2.權(quán)利要求
I的組合物，其中所述第一寡核苷酸是選自以下的序列SEQID NO 2-4,7,8,10，14，16，17，19，22，24，26，30，33，34，36，42，43，45-47，49，50，55，57，59 和 63。
3.權(quán)利要求
I的組合物，其中所述第二寡核苷酸是選自以下的序列SEQID NOl,5,6,9,11-13，15，18，20，21，23，25，29，31，32，35，37-41，44，48，51-54，56 和 58。
4.權(quán)利要求
I的組合物，其中用于所述侵入性切割分析的所述試劑設(shè)計(jì)用于檢測RNA形式的HCV的5' UTR序列。
5.權(quán)利要求
I的組合物，其中用于所述侵入性切割分析的所述試劑設(shè)計(jì)用于檢測DNA形式的HCV的5' UTR序列。
6.權(quán)利要求
1-5中任一項(xiàng)的組合物在制備用于分析丙型肝炎病毒基因型的制劑中的用途。
7.權(quán)利要求
1-5中任一項(xiàng)的組合物在制備用于產(chǎn)生丙型肝炎病毒的5'UTR基因型模式的制劑中的用途。
8.權(quán)利要求
7的組合物的用途，其中所述5'UTR基因型模式選自基因型I、II、III、IV、V 或 VI。
9.權(quán)利要求
7的組合物的用途，其中所述5'UTR基因型模式是基因型I、IV或V。
專利摘要
本發(fā)明提供了用于檢測和表征HCV序列的組合物和方法。更特別地，本發(fā)明提供了使用侵入性切割結(jié)構(gòu)分析(例如，INVADER分析)，來篩選例如，來自患者的核酸樣品，以確定HCV基因型的組合物、方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/70GKCN1977050 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200580007156
公開日2012年9月5日 申請日期2005年1月7日
發(fā)明者B·希爾, S·勞, V·A·葉拉金 申請人:第三次浪潮技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1),