專利名稱:一種土壤總dna小量快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從土壤中小量快速提取總DNA的方法。
背景技術(shù)：
目前通常用于土壤總DNA提取的方法主要有間接法(Andrew E.Berry，Claudia Chiocchini，TinaSelby，Margherita Sosio，Elizabeth M.H.Wellington.(2003)Isolation of high molecular weight DNA from soil forcloning into BAC vectors.FEMS Microbiology Letters.22315-20)、直接法(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，andTiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)和試劑盒法(Q.BIOgene公司的FastDNA SPIN Kit for Soil)，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(公開(kāi)號(hào)CN1456684A，專利申請(qǐng)?zhí)?3120964.5)公開(kāi)了“一種PCR-DGGE研究環(huán)境微生物群落的引物設(shè)計(jì)方案”，其提取土壤總DNA的方法也為直接法。從土壤中提取總DNA的間接法是先分離細(xì)胞再裂解，由于許多微生物與土壤顆粒緊密結(jié)合，細(xì)胞不易分離，導(dǎo)致最終的DNA產(chǎn)量低，還非常費(fèi)時(shí)，此法一般少用；直接法是直接從土壤中裂解細(xì)胞，該法費(fèi)時(shí)且效果一般；試劑盒法具有簡(jiǎn)單、快速，但價(jià)格昂貴，對(duì)大批樣品的提取不經(jīng)濟(jì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有方法存在的缺陷，建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、方便且價(jià)格經(jīng)濟(jì)的新方法。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有土壤DNA提取試劑盒，該方法可用于制作試劑盒，在半小時(shí)左右提取比較純的土壤總DNA，直接作為PCR的模板和酶切的底物，用于土壤微生物學(xué)和分子生物學(xué)的操作。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)人發(fā)明了一種土壤總DNA小量快速提取的新方法。以土壤為材料，采取物理和化學(xué)方法共同裂解細(xì)胞釋放DNA(即石英沙、二氧化硅粉末振蕩和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)聯(lián)用)，釋放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高濃度硫氰酸根離子(SCN-)下可被硅藻土(主要成分為二氧化硅)吸附，當(dāng)條件改變后，在弱堿性下DNA又被低鹽緩沖液或去離子水洗脫出來(lái)，這樣得到的DNA具有足夠的純度和量用于PCR和酶切反應(yīng)。
本發(fā)明包括以下步驟本發(fā)明的主要步驟包括細(xì)胞裂解、DNA抽提和純化。其具體步驟如下(1)制作裂解管稱取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗滌，然后用去離子水洗滌并浸泡過(guò)夜，再在80℃下烘干，精確稱取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，裝入2ml的離心管，121℃滅菌30分鐘；(2)稱取土樣0.5克到步驟(1)的裂解管中，加裂解緩沖液(裂解緩沖液的制備0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃滅菌30分鐘后加CTAB，使其終濃度為1％(克/毫升))1毫升后混勻；(3)用膠帶將裂解管固定在旋渦混合儀(產(chǎn)自江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司，產(chǎn)品型號(hào)為QL-901型)上振蕩5分鐘；(4)在10,000×g下離心1分鐘后將盡可能多的上清液轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5毫升離心管中；(5)在10,000×g下離心2分鐘后小心吸取上清液0.4毫升到一潔凈的2毫升離心管中，將吸附基質(zhì)懸浮液(吸附基質(zhì)懸浮液的制備0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗滌和去離子水浸泡過(guò)夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其終濃度為5％(克/毫升))搖勻后加1毫升；(6)手動(dòng)輕輕搖勻2分鐘，使DNA與吸附基質(zhì)充分結(jié)合；(7)在10,000×g下離心10秒后小心棄去上清液0.8毫升，將吸附基質(zhì)重新懸浮后全部吸取，移到含收集管的離心純化柱(離心純化柱購(gòu)買自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)上；(8)在10,000×g下離心1分鐘收集沉淀，倒去收集管中的廢液；(9)在離心純化柱上加0.5毫升洗滌液(洗滌液的制備12ml 3M NaAc與100ml乙醇混合后調(diào)pH值至7.0)，在10,000×g下離心1分鐘洗滌基質(zhì)，倒去收集管中的廢液，再在10,000×g下離心2分鐘以除去殘留的洗滌液；(10)將離心純化柱轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5毫升離心管中，于室溫下干燥2分鐘；(11)在離心純化柱中間加100微升TE緩沖液(TE緩沖液的制備10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃滅菌30分鐘)或去離子水，用手指輕彈管壁1分鐘以保證DNA的充分洗脫，在10,000×g下離心1分鐘收集DNA；(12)以步驟(11)抽取的DNA為模板，以16S rDNA引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’，(Gentry，T.J.，Wang，G.，Rensing，C.and Pepper I.L.(2004).Chlorobenzoate-degrading bacteria in similar pristine soilsexhibit different community structures and population dynamics in response to anthropogenic 2-，3-，and4-chlorobenzoate levels.Microb.Ecology 48，90-102)和1492R 5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’(Wilson，K.H.，Blitchington，R.B.and Green，R.C.(1990)Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chainreaction.Journal of.Clinical Microbiology 28，1942-1946)為引物擴(kuò)增出土壤16S rDNA并進(jìn)行電泳檢測(cè)；(13)用EcoR I和Pst I對(duì)步驟(11)提取的DNA作雙酶切并進(jìn)行電泳檢測(cè)。



圖1是用3種不同方法提取同一樣品土壤總DNA的電泳檢測(cè)圖。圖中編號(hào)1-3依次為直接法、試劑盒法和本發(fā)明方法提取的DNA，點(diǎn)樣量均為10ul。DNA Marker I的分子量標(biāo)準(zhǔn)從上至下依次為15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp(bp堿基對(duì)，北京天為時(shí)代科技有限公司，目錄號(hào)MD115-01)。
圖2是用3種不同方法提取同一樣品土壤總DNA做PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖。1-3依次為直接法、試劑盒法和本發(fā)明方法提取的DNA不稀釋做模板，4-6依次為3種方法提取的DNA稀釋10倍做模板，點(diǎn)樣量均為10ul。DNA Marker II的分子量標(biāo)準(zhǔn)從上至下依次為1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp(bp堿基對(duì)，北京天為時(shí)代科技有限公司，目錄號(hào)MD109-01)。
圖3是用本發(fā)明方法提取的DNA的酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖。1為未酶切的DNA，2為酶切的DNA，點(diǎn)樣量分別為5ul和20ul(DNA的量相同)。
圖4是用本發(fā)明方法提取自然林地、人工林地和水田土壤DNA的電泳檢測(cè)圖。1-3依次為3種土樣的DNA，點(diǎn)樣量均為10ul。
本發(fā)明的積極效果如表1表1本發(fā)明與直接法和試劑盒法與的實(shí)施效果比較


具體實(shí)施方式
實(shí)施例1從旱耕入為土(Orthic Anthrosols)中提取總DNA實(shí)驗(yàn)土壤取自中國(guó)湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬中學(xué)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)表層土樣(該土壤分類為旱耕入為土，pH＝5.87，分類命名為Orthic Anthrosols)，取樣后過(guò)2毫米×2毫米孔徑的篩，然后-20℃保存待用。具體操作步驟如下(1)制作裂解管稱取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗滌，然后用去離子水洗滌并浸泡過(guò)夜，再在80℃下烘干，精確稱取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，裝入2ml的離心管，121℃滅菌30分鐘；(2)稱取土樣0.5克到步驟(1)的裂解管中，加裂解緩沖液(裂解緩沖液的制備0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃滅菌30分鐘后加CTAB，使其終濃度為1％(克/毫升))1毫升后混勻；(3)用膠帶將裂解管固定在旋渦混合儀(產(chǎn)自江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司，產(chǎn)品型號(hào)為QL-901型)上振蕩5分鐘；(4)在10,000×g下離心1分鐘后將盡可能多的上清液轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5毫升離心管中；(5)在10,000×g下離心2分鐘后小心吸取上清液0.4毫升到一潔凈的2毫升離心管中，將吸附基質(zhì)懸浮液(吸附基質(zhì)懸浮液的制備0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗滌和去離子水浸泡過(guò)夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其終濃度為5％(克/毫升))搖勻后加1毫升；(6)手動(dòng)輕輕搖勻2分鐘，使DNA與吸附基質(zhì)充分結(jié)合；(7)在10,000×g下離心10秒后小心吸棄上清液0.8毫升，重懸基質(zhì)后全部吸起(約0.6毫升)，移到含收集管的離心純化柱(離心純化柱購(gòu)買自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)上；(8)在10,000×g下離心1分鐘收集沉淀，倒去收集管中的廢液；(9)在離心純化柱上加0.5毫升洗滌液(洗滌液的制備12ml 3M NaAc與100ml乙醇混合后調(diào)pH值至7.0)，在10,000×g下離心1分鐘洗滌基質(zhì)，倒去收集管中的廢液，再在10,000×g下離心2分鐘以除去殘留的洗滌液；(10)將離心純化柱轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5毫升離心管中，于室溫下干燥2分鐘；(11)在離心純化柱中間加100微升TE緩沖液(TE緩沖液的制備10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃滅菌30分鐘)或去離子水，用手指輕彈管壁1分鐘以保證DNA的充分洗脫，在10,000×g下離心1分鐘收集DNA；為了比較本發(fā)明與現(xiàn)有的直接法和試劑盒法的平行效果，申請(qǐng)人同時(shí)進(jìn)行了利用直接法和試劑盒法的實(shí)驗(yàn)，利用直接法從土壤中提取總DNA按照Z(yǔ)hou報(bào)道的方法進(jìn)行(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，and Tiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)；利用試劑盒法從土壤中提取總DNA所用試劑盒購(gòu)自Q.BIOgene公司，試劑盒的商品名稱為FastDNA SPIN Kit for Soil。上述兩種方法使用的土壤樣品同本發(fā)明，即樣品處理都用0.5g土樣提取其DNA，然后將提取的DNA溶于100微升的TE緩沖液中。
如圖1所示，采用直接法、試劑盒法和本發(fā)明的方法從土壤中提取的總DNA結(jié)果有較大差別，前兩種方法提取的總DNA產(chǎn)量相當(dāng)，本發(fā)明的方法較高(采用常用分光光度計(jì)檢測(cè)的總DNA產(chǎn)量約為10ug)，比前兩種方法均高出1倍。
實(shí)施例2對(duì)實(shí)施例1提取的DNA做PCR檢測(cè)用本實(shí)施例1提取的DNA為模板，以設(shè)計(jì)的引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’和1492R5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，擴(kuò)增土壤微生物16S rDNA(16S核糖核蛋白體RNA基因)。利用間接法、試劑盒法和本發(fā)明的方法制備的土壤總DNA不稀釋和稀釋10倍作PCR反應(yīng)的模板分別來(lái)擴(kuò)增土壤微生物的16S rDNA。PCR反應(yīng)體系如下(50ul)ddH2O34.5ul；DNA2ul；10×PCR buffer(TaKaRa)5ul；10×MgCl2(TaKaRa)5ul；dNTP(Promega，每種10mM)1ul；16S rDNA引物338F(50ng/ul)1ul；16S rDNA引物1492R(50ng/ul)1ul；Taq Enzyme(TaKaRa，5U/ul)0.5ul。PCR程序如下預(yù)變性94℃ 5分鐘；變性94℃ 45秒；退火49℃ 45秒；延伸72℃ 1.5分鐘；最后延伸72℃ 10分鐘；循環(huán)數(shù)35個(gè)。
擴(kuò)增的目的DNA片段大小為1151bp，如圖2所示，在1500bp和1000bp之間第3到第6泳道有強(qiáng)帶，第1和第2泳道無(wú)帶，這表明直接法和試劑盒法提取的DNA不可以直接作模板做PCR擴(kuò)增；經(jīng)過(guò)10倍稀釋后可以做PCR擴(kuò)增，而本發(fā)明的方法提取的DNA不稀釋和稀釋10倍完全可以滿足做PCR的要求。
實(shí)施例3對(duì)使用本發(fā)明方法提取的DNA做酶切檢測(cè)對(duì)實(shí)施例1中用本發(fā)明方法提取的DNA做EcoR I(G↓AATTC)和Pst I(CTGCA↓G)雙酶切(參考文獻(xiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第三版.科學(xué)出版社.2003)。酶切體系(20ul)ddH2O11ul；10×H buffer(TaKaRa)2ul；EcoR I(TaKaRa，15U/ul)1ul；Pst I(TaKaRa，15U/ul)1ul；DNA5ul。酶切條件37℃過(guò)夜。由圖3可以看出酶切后的DNA呈現(xiàn)一片連續(xù)的帶形，證明DNA被切成小片段，為smear狀，說(shuō)明用本發(fā)明方法提取的DNA可以滿足酶切的要求。
實(shí)施例4應(yīng)用本發(fā)明的方法從不同類型土壤樣品中提取土壤總DNA按照實(shí)施例1的方法分別提取3種土樣的DNA中國(guó)湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山的自然林地土壤(pH＝6.65)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)人工林地土壤(pH＝6.46)，兩種土壤均為濕潤(rùn)雛形土，分類命名為Udic Cambisols；中國(guó)湖北省大冶市金礦附近的水田土壤(pH＝7.12)，該土壤為水耕入為土，分類命名為Stagnic Anthrosols。電泳檢測(cè)圖如圖4所示，由圖4看出，本實(shí)施例中的3種土樣都能制備出質(zhì)量比較好的DNA，其發(fā)明效果如表2所示。
表2應(yīng)用本發(fā)明對(duì)不同類型的土壤總DNA的制備效果


權(quán)利要求
1.一種土壤總DNA的小量快速提取方法，其主要步驟包括樣品制備、PCR和電泳，具體步驟如下(1)制作裂解管稱取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗滌，然后用去離子水洗滌并浸泡過(guò)夜，再在80℃下烘干，精確稱取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，裝入2ml的離心管，121℃滅菌30分鐘；(2)稱取土樣0.5克到步驟(1)的裂解管中，加裂解緩沖液1毫升后混勻；(3)用膠帶將裂解管固定在旋渦混合儀上振蕩5分鐘；(4)在10,000×g下離心1分鐘后將盡可能多的上清液轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5毫升離心管中；(5)在10,000×g下離心2分鐘后小心吸取上清液0.4毫升到一潔凈的2毫升離心管中，將吸附基質(zhì)懸浮液搖勻后加1毫升；(6)手動(dòng)輕輕搖勻2分鐘，使DNA與吸附基質(zhì)充分結(jié)合；(7)在10,000×g下離心10秒后小心棄去上清液0.8毫升，將吸附基質(zhì)重新懸浮后全部吸取，移到含收集管的離心純化柱上；(8)在10,000×g下離心1分鐘收集沉淀，倒去收集管中的廢液；(9)在離心純化柱上加0.5毫升洗滌液，在10,000×g下離心1分鐘洗滌基質(zhì)，倒去收集管中的廢液，再在10,000×g下離心2分鐘以除去殘留的洗滌液；(10)將離心純化柱轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5毫升離心管中，于室溫下干燥2分鐘；(11)在離心純化柱中間加100微升TE緩沖液或去離子水，用手指輕彈管壁1分鐘以保證DNA的充分洗脫，在10,000×g下離心1分鐘收集DNA；(12)以步驟(11)抽取的DNA為模板，以16S rDNA引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’和1492R5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’為引物擴(kuò)增出土壤16S rDNA并進(jìn)行電泳檢測(cè)；(13)用EcoR I和Pst I對(duì)步驟(11)提取的DNA作雙酶切并進(jìn)行電泳檢測(cè)。
2.權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的裂解緩沖液按以下步驟制備0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1M H3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃滅菌30分鐘后加十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，使其終濃度以克/毫升計(jì)為1％。
3.權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的吸附基質(zhì)懸浮液按以下步驟的制備0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6.0，121℃滅菌30分鐘后加用稀硝酸洗滌和去離子水浸泡過(guò)夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其終濃度以克/毫升計(jì)為5％。
4.權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的洗滌液按以下步驟制備將12ml 3M NaAc與100ml乙醇混合后調(diào)pH至7.0。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種土壤總DNA的小量快速提取方法。以土壤為材料，采取石英沙、二氧化硅粉末振蕩和十六烷基三甲基溴化銨共同裂解細(xì)胞釋放DNA，釋放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高濃度硫氰酸根離子下可被硅藻土吸附，當(dāng)條件改變后，在弱堿性下DNA又被低鹽緩沖液或去離子水洗脫出來(lái)，這樣提取的DNA具有足夠的純度和量用于PCR和酶切反應(yīng)。主要步驟包括裂解細(xì)胞、抽提DNA和純化DNA三步。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快速、方便、提取的DNA純度高和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，而且可應(yīng)用于試劑盒的制作，在半小時(shí)左右提取比較純的土壤總DNA，用于土壤微生物學(xué)和分子生物學(xué)研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN1990863SQ200510120584
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月30日
發(fā)明者王革嬌, 蔡林 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan