專利名稱:編碼可被掃描探針顯微鏡術(shù)(spm)讀取的特定信息的納米條形碼的可控排列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法、組合物及裝置是涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和生物分子分析，所述生物分子包含不限于核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及多糖類。特別地，本發(fā)明是涉及使用納米條形碼(nanobarcodes)及掃描探針顯微鏡法(SPM)檢測、鑒別和/或定序核酸和/或其它生物分子的方法、組合物和裝置。
背景技術(shù)：
諸如核酸或蛋白質(zhì)的生物分子的鑒別及/或測序?qū)τ卺t(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)、生物戰(zhàn)、公共衛(wèi)生及大量的其它領(lǐng)域都是不可或缺。雖然目前針對核酸或蛋白的鑒別及/或測序已投入大量研究，其它諸如碳水化合物、多糖、脂質(zhì)、脂肪酸等等的生物分子也是很重要的。在此所揭示的方法、組合物及裝置并不受限于核酸的鑒別及/或測序，它們也可以用于其它類型的生物分子，包含但不限于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及多糖的分析。
諸如DNA印跡(Southern blotting)或核酸芯片結(jié)合的核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法是依賴于熒光或放射性探針分子與目標(biāo)核酸分子的雜交。已知的用于核酸測序的方法典型地是利用雙脫氧終止(Sanger dideoxy)技術(shù)或與核酸芯片的雜交。
基于寡核苷酸雜交的陣列被廣泛地用于目標(biāo)核酸的檢測。具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸探針連接上發(fā)熒光的、放射性的或其它組分(moiety)，這使得它可以通過Watson-Crick堿基配對與核酸雜交。已知該技術(shù)有許多變化。最近，DNA芯片已經(jīng)被設(shè)計出來，它能夠含有數(shù)百或甚至數(shù)千的寡核苷酸探針。目標(biāo)核酸與寡核苷酸在芯片上的雜交可以使用熒光光譜學(xué)、放射性等來檢測。非精確互補(bǔ)的序列之間的核酸雜交可能導(dǎo)致有關(guān)靈敏性及/或特異性的問題。在樣本中存在的低水平的目標(biāo)核酸就有可能沒有被檢測到。
Sanger雙脫氧核酸測序方法是基于依大小分離開的四種彩色熒光或放射性核酸的檢測，這種方法受到能夠被測序的核酸的長度的限制。通常，一次只能確定500到1000堿基的核酸序列。使用現(xiàn)有的方法時，完整基因序列的確定要求生成該基因的多份拷貝，將其切割成重疊片段，然后進(jìn)行測序，之后可以再將重疊的DNA序列組合起來。該程序費力、昂貴、低效率且耗時。而且通常還需要使用熒光或放射性物質(zhì)，這很可能造成安全和廢物處理問題。最近的通過應(yīng)用與寡核苷酸芯片的雜交來進(jìn)行核酸測序的方法可以被用來推斷短的核酸序列，或用來檢測在樣品中特定核酸的存在，但是并不適合用來鑒定長的核酸序列。
有許多技術(shù)可用于鑒定蛋白、多肽及肽。一般地，這些技術(shù)都涉及抗體的結(jié)合及檢測，所述抗體可以識別在蛋白上的一個或多個表位結(jié)構(gòu)域(epitopic domains)。雖然基于抗體的蛋白鑒別方法相當(dāng)快速，但是由于抗體與不同抗原之間的交叉反應(yīng)、目標(biāo)分析物的低抗原性(導(dǎo)致分析出現(xiàn)低靈敏性)、抗體對各種表面的非他特異結(jié)合等等，這樣的分析有時就會出現(xiàn)不可接受的高水平的假陽性結(jié)果或假陰性結(jié)果。而且這樣的技術(shù)還需要能夠識別單個蛋白或肽的抗體的制備物。因此，它們并不適合用來鑒別先前還未曾被表征過的新的蛋白。
需要快速、精確和靈敏的方法來對諸如核酸或蛋白的生物分子進(jìn)行檢測、鑒別和/或測序。



下面的附圖構(gòu)成了本說明書的一部分，它們被引入是為了進(jìn)一步展示本發(fā)明所公開的實施方案的某些方面。本發(fā)明的實施方案可以通過參考其中的一個或多個附圖并結(jié)合在此提出的特定實施方案的細(xì)節(jié)描述而被更好地理解。
圖1說明了用以排列(aligning)已編碼探針(coded probes)130、230、340、400于表面100、220、300上的示范性方法，每個探針包含粘附于探針分子410的一個或多個納米條形碼420。(A)將表面100、220、300浸入含有已編碼探針130、230、340、400的溶液110。(B)從溶液110中移出含有已被排列的已編碼探針130、230、340、400的表面100、220、300。
圖2說明了另一種用以排列已編碼探針130、230、340、400在表面100、220、300的示范性方法。(A)將一滴含有已編碼探針130、230、340、400的溶液210置于覆蓋滑片200與玻璃載片220之間。覆蓋滑片200固定在適當(dāng)?shù)牡胤?，同時載片220被移動，從而使已編碼探針130、230、340、400進(jìn)行排列。
圖3說明了另一種用以排列已編碼探針130、230、340、400在表面100、220、300上的示范性方法。
圖4說明了示范性的已編碼探針400，其包含附著于探針分子410的納米條形碼420。單個納米條形碼420可以由一個或多個組成部分(moieties)組成，這將在下文中更詳細(xì)地討論。
示范性實施方案的描述在此公開的方法、組合物及裝置是用來對諸如核酸的生物分子進(jìn)行檢測、鑒別及/或測序。在本發(fā)明的特定實施方案中，所述方法、組合物及裝置適合于獲得非常長的核酸分子的序列，所述核酸分子在長度上超過1,000、超過2,000、超過5,000、超過10,000、超過20,000、超過50,000、超過100,000或甚至更多的堿基。優(yōu)點包括能夠在單次測序操作中讀取長的核酸序列、能夠快速獲得序列數(shù)據(jù)，以及就每單位的序列數(shù)據(jù)所需要的操作時間而言具有低的測序成本和高的效率。其它優(yōu)點包括能夠靈敏和精確地檢測和/或鑒別核酸，假陽性結(jié)果發(fā)生的概率很低。
下面的詳細(xì)描述包含了大量的特定細(xì)節(jié)以便提供對本發(fā)明所公開的實施方案更為徹底的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是，本發(fā)明的實施方案不按照這些特定細(xì)節(jié)也可以被實施。在其它例子中，本領(lǐng)域內(nèi)為人所熟知的裝置、方法、程序及個別組分不在此詳細(xì)加以描述。
定義當(dāng)在此使用時，“一個”(“a”或“an”)可以表示術(shù)語的一個或多于一個的形式。
當(dāng)在此使用時，“大約”是指在一個數(shù)值的百分之十內(nèi)。例如，“大約100”是指在90與110之間的數(shù)值。
“核酸”包括DNA、RNA(核糖核酸)，單鏈、雙鏈或三鏈及其任何化學(xué)修飾。實際上，核酸的任何修飾都在考慮的范圍之內(nèi)?！昂怂帷笨梢允菐缀跞魏伍L度，從2個或更多堿基的寡核苷酸到全長染色體DNA分子。核酸包含但不限于寡核苷酸和多核苷酸。
“已編碼探針”130、230、340、400是指附著于一個或多個納米條形碼420的探針分子410。探針分子410是對一個或多個目標(biāo)分子顯示出選擇性和/或特異性結(jié)合的任何分子。在本發(fā)明的各種實施方案中，各個不同的探針分子410可以附著于可區(qū)分的納米條形碼420，以便可以從一群不同的探針分子410中檢測到特定探針410的結(jié)合。至于可以使用的探針分子410的類型，本發(fā)明的實施方案并沒有限制。任何在本領(lǐng)域已知的探針分子410都可以使用，包含但不限于寡核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、結(jié)合蛋白、受體蛋白、肽、凝集素、底物、抑制劑、活化劑、配體、激素、細(xì)胞因子，等等。在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以包含已經(jīng)共價或非共價地附著于一個或多個納米條形碼420的寡核苷酸和/或核酸，其可鑒別寡核苷酸和/或核酸的序列。在本發(fā)明的各種實施方案中，成線性系列的已編碼探針130、230、340、400可以被連接在一起。在這個連接的分子中的各個已編碼探針130、230、340、400可以附著于可區(qū)分的納米條形碼420，以允許識別其序列。因為在該連接分子中的已編碼探針130、230、340、400的序列也可以被確定，所以該整個連接分子的序列可以被鑒定。在另一實施方案中，在寡核苷酸探針410內(nèi)的各個核苷酸都可以附著于可分辨的納米條形碼420，這使得該已編碼探針130、230、340、400的序列可以從核苷酸的序列中鑒別出來。
“納米條形碼”420是指可以用來檢測和/或鑒別已編碼探針130、230、340、400的構(gòu)成物。在下文更為詳細(xì)討論的非限制性的例子中，納米條形碼420可以包括一個或多個亞微米金屬條形碼、碳納米管、富勒烯或任何其它可被掃描探針顯微鏡術(shù)檢測和鑒別的納米級的組分。納米條形碼420并不限于單個組分，在本發(fā)明的某些實施方案中，納米條形碼420可以包含例如兩個或更多個彼此粘附的富勒烯。圖4所說明的非限制性的實例顯示了六個不同組分合并為一個納米條形碼420。當(dāng)所述組分為富勒烯時，它們可以例如由一連串大大小小的以特定頁序連接在一起的富勒烯組成。在納米條形碼420中不同大小的富勒烯的順序可以利用掃描探針顯微鏡術(shù)來檢測，而這個順序可以用來例如識別附著的寡核苷酸探針410的序列。
“目標(biāo)”或“分析物”分子是可以結(jié)合到已編碼探針130、230、340、400的任何分子，包含但不限于核酸、蛋白、脂質(zhì)及多糖。在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400與目標(biāo)分子的結(jié)合可以被用來檢測在樣品中該目標(biāo)分子的存在。
分子梳在本發(fā)明的各種實施方案中，納米條形碼420、已編碼探針130、230、340、400和/或結(jié)合到已編碼探針130、230、340、400的目標(biāo)分子可以被附著到表面100、220、300并被排列以便分析。在一些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以排列于表面上，被整入的納米條形碼420可以被探測，如下所述。在另外的實施方案中，納米條形碼420可以與探針分子410分離、排列于表面上并被探測。在某些實施方案中，結(jié)合到個別目標(biāo)分子上的已編碼探針130、230、340、400的順序可以被保留和檢測，例如利用掃描探針顯微鏡術(shù)。在其它實施方案中，目標(biāo)分子的多個拷貝可以存在于一個樣品中，可以通過將結(jié)合于所述多個拷貝的已編碼探針130、230、340、400的所有序列組合成重疊的目標(biāo)分子序列，來確定目標(biāo)分子的身份和/或序列。用來例如將重疊的部分核酸或蛋白序列組合成連續(xù)序列的方法在本領(lǐng)域是已知的。在各種實施方案中，納米條形碼420可以是在它們附著于探針分子410時被檢測，或者可以是在檢測之前就已與探針分子410分離。
將分子例如核酸、寡核苷酸探針410和/或納米條形碼420附著到表面100、220、300并使之進(jìn)行排列比對的方法及裝置在本領(lǐng)域是已知的。(參見例如Bensimon等人，Phys.Rev.Lett.744754-57，1995；Michalet等人，Scienece 2771518-23，1997；美國專利5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,248,537；6,265,153；6,303,296和6,344,319)。納米條形碼420、已編碼探針130、230、340、400和/或目標(biāo)分子可以利用使用氣-水的彎月面或其它類型的界面所固有的物理作用力而附著于表面100、220、300和被排列。這一技術(shù)通常稱為分子梳(molecualrcombing)。溶解在含水介質(zhì)110、210中的納米條形碼420、已編碼探針130、230、340、400和/或目標(biāo)分子可以是一端或者兩端附著于表面100、220、300，例如硅烷化玻璃片、生物素化(biotinylated)表面、鍍金表面或任何其它的本領(lǐng)域已知的能夠結(jié)合這樣的分子的表面100、220、300。該表面100、220、300可以緩慢地從含水介質(zhì)中拉出(例如圖1)。極性或帶電荷的目標(biāo)分子、納米條形碼420和/或已編碼探針分子130、230、340、400會優(yōu)選分配到親水性(含水)介質(zhì)110、210中。因此，當(dāng)表面100、220、300從該含水介質(zhì)110、210移出時，可造成結(jié)合的目標(biāo)分子、納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400的伸展，其方向平行于彎月面的移動方向。在所述的伸展分子的測量長度與其實際大小之間存在著直接的關(guān)聯(lián)性，一微米的伸展長度對應(yīng)于大約2,000個堿基的核酸序列(Herrick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97222-227，2000)。
一旦所述表面100、220、300已經(jīng)全部從含水介質(zhì)110中移出，附著的納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400就以平行方式排列，該方式可以更容易和精確地分析。在本發(fā)明的某些具體實施方式
中，已編碼探針130、230、340、400的兩端都附著到表面100、220、300上，被排列的已編碼探針130、230、340、400將會呈現(xiàn)出U形形態(tài)，該形態(tài)也更容易分析。該技術(shù)并不受限于要被排列的目標(biāo)分子、納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400的大小，它可以對長至整個染色體的核酸起作用(例如，Michalet等人，1997；Herrick等人，2000)。在彎月面以適當(dāng)?shù)乃俾室苿訒r，所產(chǎn)生的剪力系相當(dāng)小，這樣，被排列的DNA片段可以是數(shù)十萬個堿基或更長(Michalet等人，1997)。
分子到處理過的表面100、220、300上的強(qiáng)烈的非特異性吸附會抑制分子梳作用(Bensimon等人，1995)。因此，在本發(fā)明的各種實施方案中，表面100、220、300被處理，使得目標(biāo)分子或已編碼探針130、230、340、400的僅僅一端或更多端會結(jié)合到表面100、220、300。將核酸及其它類型的已編碼探針130、230、340、400結(jié)合到表面100、220、300的方法在本領(lǐng)域為人所熟知，總結(jié)于下。在非限制性的例子中，目標(biāo)分子、納米條形碼420或已編碼探針130、230、340、400可以在所述分子的一端或兩端用生物素殘基共價修飾。當(dāng)暴露于覆有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)的表面100、220、300時，就只有生物素標(biāo)記的末端會結(jié)合到該表面100、220、300。與表面100、220、300的非特異性吸附可以通過使用本質(zhì)上具有疏水性的表面100、220、300來降低，例如硅烷化表面100、220、300。
本發(fā)明的實施方案并不受限于可以使用的表面100、220、300的類型。表面100、220、300的非限制性的例子包含玻璃、功能化玻璃、陶瓷、塑料、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、鍺、硅、石英、砷化鎵、金、銀、尼龍、硝酸纖維素或任何其它在本領(lǐng)域已知的能夠讓目標(biāo)分子、納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400附著到表面100、220、300的材料。附著可以是共價的或非共價的作用。盡管在本發(fā)明的某些實施方案中，表面100、220、300可以是玻璃片或覆蓋滑片的形式，但表面100、220、300的形狀并沒有限制，表面100、220、300可以是任何形狀。在本發(fā)明的某些實施方案中，表面100、220、300是平面的。
用以排列目標(biāo)分子、納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400在表面100、220、300上的其它方法在本領(lǐng)域是已知的(例如，Bensimon等人，1995；Michalet等人，1997；美國專利5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,248,537；6,265,153；6,303,296及6,344,319)?？梢哉f，任何已知的用于排列的方法都可以在所要求保護(hù)的主題的范圍之內(nèi)被應(yīng)用。在本發(fā)明的某些實施方案中，當(dāng)溶解在含水介質(zhì)110、210中的目標(biāo)分子、納米條形碼420或已編碼探針130、230、340、400透過移動的彎月面而被拉出時，排列便可發(fā)生。彎月面發(fā)生移動的機(jī)制并不重要，可以通過例如將表面100、220、300浸入緩沖溶液110、210中，再將其而緩慢地從該溶液110、210中移出，從而實現(xiàn)彎月面的移動?；蛘?，表面100、220、300可以被浸入溶液110、210中，而彎月面的水平位置可以藉由液體的蒸發(fā)或移除而緩慢地降低。在本發(fā)明的其它實施方案中，可以將一滴溶液210放在覆蓋滑片200和表面100、220、300例如玻璃片之間?？梢詫⒃摫砻?00、220、300緩慢地拉出，使之與覆蓋滑片200分開。因為溶液210緊貼覆蓋滑片200，這就會造成覆蓋滑片200與表面100、220、300接觸的邊緣處形成空氣-水的界面。移動該界面，便使目標(biāo)分子、納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400排列于表面100、220、300。用以排列納米條形碼420和/或已編碼探針130、230、340、400的別的方法在下文中會更詳細(xì)地討論，它們涉及使用自由流動(free-flow)電泳替代分子梳或在分子梳的過程中使用自由流動電泳。
核酸要被檢測、鑒別和/或測序的核酸分子可以利用任何在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來制備。在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸可以是天然發(fā)生的DNA或RNA分子。實際上，任何天然發(fā)生的核酸都可以利用所公開的方法來檢測、鑒別和/或測序，包含但不限于染色體DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA和核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、不均一核RNA和信使RNA。在一些實施方案中，要被分析的核酸是存在于細(xì)胞、組織或器官的粗制均質(zhì)物或提取物中。在其它實施方案中，核酸在分析之前可以被部分或完全純化。在另外的實施方案中，要被分析的核酸分子可以利用在本領(lǐng)域所熟知的化學(xué)合成法來制備，或利用本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增、復(fù)制和/或合成方法來制備。
純化各種形式的細(xì)胞內(nèi)核酸的方法是已知的(參見例如，Guide toMolecular Cloning Techniques，eds.Berger和Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningA Laboratory Mannual，2ndEd.eds.Sambrock，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。在引用的參考文獻(xiàn)中所揭露的方法僅供示范，在本領(lǐng)域已知的任何變化都可加以使用。當(dāng)單鏈DNA(ssDNA)要被分析時，ssDNA可以通過任何已知方法由雙鏈DNA(dsDNA)制備。這樣的方法可以包括加熱dsDNA，使鏈分開，或者，可以包括通過已知的擴(kuò)增或復(fù)制方法從dsDNA制備ssDNA，例如利用在M13中的克隆。任何這樣的已知方法都可以用來制備ssDNA或ssRNA。
雖然本發(fā)明的某些實施方案是涉及天然發(fā)生核酸的分析，但實際上，任何類型的核酸都可以使用。例如，由各種擴(kuò)增技術(shù)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTM)制備的核酸都可以被分析(參見美國專利4,683,195、4,683,202和4,800,159)。要被分析的核酸或者可以克隆到標(biāo)準(zhǔn)載體中，例如質(zhì)粒、粘粒、BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)中。(參見，Berger和Kimmel，1987；Sambrook等人，1989。)核酸插入物可以與載體DNA分離，例如通過用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶進(jìn)行切割，接著進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用來分離核酸插入物的方法在本領(lǐng)域中是已知的。所揭示的方法并沒有限制要被分析的核酸的來源，任何類型的核酸，包括原核生物的、細(xì)菌的、病毒的、真核生物的、哺乳動物的和/或人類的核酸都可以在所要求保護(hù)的主題的范圍之內(nèi)被分析。
在本發(fā)明的各種實施方案中，單個核酸的多個拷貝可以利用已編碼探針130、230、340、400的雜交來分析，如同下文所討論的。制備單個核酸和形成多個拷貝的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如各種擴(kuò)增和/或復(fù)制方法。作為選擇，單個克隆，諸如含有單個核酸插入物的BAC、YAC、質(zhì)粒、病毒或其它載體，可以被分離、放大，插入物可以被取出并純化以用于分析。用以克隆和獲得純化的核酸插入物的方法在本領(lǐng)域是為人熟知的。
熟練的技術(shù)人員應(yīng)了解到，所要求保護(hù)的主題的范圍并不限于核酸的分析，它包括了其它類型的生物分子的分析，這些生物分子包含但不限于蛋白、脂質(zhì)及多糖。用以制備和/或純化各種類型的生物分子的方法在本領(lǐng)域是已知的，任何這樣的方法都可以使用。
已編碼探針文庫在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以構(gòu)成探針分子410文庫，各個不同的探針410附著于可分辨的納米條形碼420。在一個給定的文庫中，有可能某一特定探針分子410存在多于一個的拷貝。在這種情況下，相同探針410的每個拷貝將附著于相同的納米條形碼420。所使用的探針410和納米條形碼420的類型并沒有限制，任何已知類型的探針分子410都可以使用，包含但不限于寡核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、結(jié)合蛋白、受體蛋白、肽、凝集素、底物、抑制物、激活物、配體、激素、細(xì)胞因子，等等。而且，任何類型的可分辨的納米條形碼420都可被使用。
寡核苷酸文庫在本發(fā)明的各個實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以包括寡核苷酸探針410，例如具有確定序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸410可以附著于可分辨的納米條形碼420，再雜交到要被分析的核酸上，相鄰的已編碼探針130、230、340、400可以連接到一起。在與所述核酸分離之后，所述的連接的已編碼探針130、230、340、400可以附著到表面100、220、300，并被排列，如上文所討論的。被排列的已編碼探針130、230、340、400接著可以用掃描探針顯微鏡術(shù)(SPM)來分析。通過SPM分析可以檢測和鑒定已編碼探針130、230、340、400的納米條形碼420組成，并確定結(jié)合到所述核酸的已編碼探針130、230、340、400的順序。該信息便可以用來鑒別核酸和/或用來確定核酸序列。熟練的技術(shù)人員應(yīng)意識到，所要求保護(hù)的主題的范圍并不限于SPM檢測方法，能夠檢測和鑒別納米條形碼420和/或排列于表面100、220、300上的已編碼探針130、230、340、400的任何分析方法都可以被使用。熟練的技術(shù)人員也應(yīng)意識到，SPM分析并不限于檢測和鑒別基于寡核苷酸的已編碼探針130、230、340、400，而是可以針對任何類型的已編碼探針130、230、340、400和/或納米條形碼420來使用。
在本發(fā)明另外的實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以被檢測，而無須連接相鄰的已編碼探針130、230、340、400。已編碼探針130、230、340、400可以雜交到相同目標(biāo)分子的多個拷貝。未雜交的已編碼探針130、230、340、400可以被去除，而雜交的已編碼探針130、230、340、400被檢測。在一些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以在仍然與目標(biāo)分子雜交時被檢測。或者，已編碼探針130、230、340、400可以例如通過加熱樣品而與目標(biāo)分子分離，然后被檢測。在這樣的實施方案中，納米條形碼420組分在檢測之前，可以與或者不與已編碼探針130、230、340、400的探針410組分分開。
在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以在仍然附著于目標(biāo)分子時被檢測。如果在短的寡核苷酸探針410與目標(biāo)核酸之間的結(jié)合作用的強(qiáng)度相對較弱，那么這樣的方法可能更為適當(dāng)，例如在已編碼探針130、230、340、400已經(jīng)使用交聯(lián)劑共價附著于目標(biāo)分子的情形，或是在探針分子410與目標(biāo)之間的結(jié)合作用較強(qiáng)的情形，例如抗體-抗原相互作用的情形。
在本發(fā)明的各種實施方案中，寡核苷酸類型的已編碼探針130、230、340、400可以是DNA、RNA或其任何類似物，例如肽核酸(PNA)，它可以用來鑒別在核酸中的特定互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，一個或多個已編碼探針130、230、340、400文庫可以被制備，用于與一種或多種核酸分子的雜交。例如，可以使用這樣的一套已編碼探針130、230、340、400，其含有所有4096種六聚體或大約2000種非互補(bǔ)六聚體，或所有16384種七聚體或大約8000種非互補(bǔ)七聚體。如果非互補(bǔ)的寡核苷酸已編碼探針130、230、340、400系列被使用，那么可以進(jìn)行多次的雜交和序列分析，這些分析的結(jié)果可以通過計算方法合并為一套數(shù)據(jù)。例如，如果只包含非互補(bǔ)六聚體的文庫被用于雜交和序列分析，那么使用相同的目標(biāo)核酸分子的第二次雜交和分析可以執(zhí)行，所述目標(biāo)核酸分子被雜交到由第一文庫排除的那些已編碼探針130、230、340、400序列。
在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400文庫可以含有具有給定的寡核苷酸長度的所有可能序列(例如，六聚體文庫可以由4096種已編碼探針130、230、340、400組成)。在這樣的情況下，某些已編碼探針130、230、340、400會與互補(bǔ)的已編碼探針130、230、340、400序列形成雜合體。這樣的雜合體以及未雜交的已編碼探針130、230、340、400可以使用已知的方法與雜交到目標(biāo)分子上的已編碼探針130、230、340、400分離，所述方法例如高效液相色譜(HPLC)、凝膠滲透層析、凝膠電泳法、超濾和/或羥磷灰石層析。一組完整的具有既定長度的所有可能序列的寡核苷酸或其中特定的亞組的產(chǎn)生方法和選擇方法是已知的。在各種實施方案中，長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多核苷酸的已編碼探針130、230、340、400可以被使用。
在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400文庫可以包含這樣的已編碼探針130、230、340、400，其中間是隨機(jī)核酸序列，而在其一端或兩端是固定不變的核酸序列。例如，12聚體的已編碼探針130、230、340、400的一個亞組可以由兩端是固定的二聚體的一組完整的隨機(jī)八聚體序列組成。這些已編碼探針130、230、340、400文庫可以根據(jù)它們固定不變的部份被再劃分，并獨立地與核酸雜交，然后使用各個不同的已編碼探針130、230、340、400文庫的數(shù)據(jù)組合進(jìn)行分析，以確定所述核酸的序列。熟練的技術(shù)人員會意識到，所需要的亞文庫的數(shù)目是連接于隨機(jī)序列的固定不變堿基的數(shù)目的函數(shù)。另一種實施方案可以應(yīng)用使用單個已編碼探針130、230、340、400文庫的多重雜交和分析，所述單個文庫含有連接于隨機(jī)寡核苷酸序列的特定固定部份。對于核酸上任何給定的位點，序列不同但是有重疊的多個已編碼探針130、230、340、400能夠以稍微有偏移的方式結(jié)合到該位點，這是可能的。因此，應(yīng)用使用單個文庫的多重雜交和分析，該核酸的完整序列可以通過編輯所述的重疊、偏移的已編碼探針130、230、340、400序列來獲得。
在本發(fā)明的涉及寡核苷酸文庫的實施方案中，寡核苷酸可以利用任何已知方法來制備，例如利用Applied Biosystems 381A DNA合成儀(Foster City，CA)或類似設(shè)備來合成?；蛘撸押塑账峥梢詮墓┴浬?例如Proligo，Boulder，CO；Midland Certified Reagents，Midland，TX)買到。在寡核苷酸是被化學(xué)合成的實施方案中，納米條形碼420可以共價地連接于用于合成的一種或多種核苷酸前體?；蛘?，納米條形碼420可以是在寡核苷酸探針410已經(jīng)合成之后才粘附上。在其它替代的選擇中，納米條形碼420可以在寡核苷酸合成的同時被貼附上。
在本發(fā)明的某些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以包括肽核酸(PNA)。PNA是聚酰胺型的DNA類似物，其具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的單體單元。PNA已經(jīng)商業(yè)化，可以從諸如PE Biosystem(Foster City，CA)的公司獲得?；蛘撸梢栽谑灏?，N，N-二異丙基乙胺(DIEA)存在的條件下，使用O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)來活化和偶聯(lián)9-芴甲氧羰基(Fmoc)單體，從而實施PNA的合成。PNA能夠利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)來純化，可利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)分析來證實。
納米條形碼每個已編碼探針130、230、340、400可以整合有至少一個共價或非共價聯(lián)結(jié)的納米條形碼420。納米條形碼420可以用來檢測和/或鑒別單個已編碼探針130、230、340、400。在本發(fā)明的某些實施方案中，每個已編碼探針130、230、340、400可以具有兩個或更多個附著的納米條形碼420，它們的組合對于特定的已編碼探針130、230、340、400是獨特的。納米條形碼420的組合可以用來擴(kuò)展可分辨的納米條形碼420的數(shù)目，這些納米條形碼在特異地鑒別在文庫中的已編碼探針130、230、340、400時是可利用的。在本發(fā)明的其它實施方案中，每個已編碼探針130、230、340、400可以具有單個獨特的納米條形碼420附著。這里唯一的要求就是由每個已編碼探針130、230、340、400檢測到的信號必須能夠?qū)⒁丫幋a探針130、230、340、400從不同的已編碼探針130、230、340、400中可區(qū)分地鑒別出來。
在本發(fā)明的某些實施方案中，納米條形碼420可以在合成已編碼探針130、230、340、400之前整合到前體中。對于基于寡核苷酸的已編碼探針130、230、340、400，為了在腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)位置處進(jìn)行共價連接而進(jìn)行的內(nèi)部氨基修飾是可以考慮的。內(nèi)部連接也可以使用商業(yè)上可獲得的亞磷酰胺在胸腺嘧啶(T)位置出實施。在一些實施方案中，在A和G位置處具有丙胺連接子(linker)的文庫片段可以用來將納米條形碼420連接到已編碼探針130、230、340、400上。內(nèi)部氨烷基尾端的導(dǎo)入允許納米條形碼420的合成后附著。連接子可以從供貨商處購得，例如Synthetic Genetics(San Diego，CA)。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用適當(dāng)?shù)膩喠柞０费苌镞M(jìn)行納米條形碼420的自動偶聯(lián)也被考慮到。這樣的納米條形碼420可以在寡核苷酸合成期間被偶聯(lián)到其5′-端。
通常，納米條形碼420將以能夠使所述納米條形碼420的空間位阻最小化的方式共價附著于探針410上，以便于已編碼探針130、230、340、400結(jié)合到目標(biāo)分子，例如雜交到核酸上?？梢允褂眠B接子，這樣可以為已編碼探針130、230、340、400提供一定程度的柔性。同質(zhì)或異質(zhì)雙功能連接子可以從各種商業(yè)來源獲得。
寡核苷酸堿基上的附著點會隨著堿基的變化而變化。當(dāng)在任何位置上的附著都是可能的時候，在某些實施方式中，附著是發(fā)生在不涉及互補(bǔ)堿基的氫鍵的位置。因此，例如，附著可以發(fā)生在嘧啶例如尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶的5或6位置處。對于諸如腺嘌呤和鳥嘌呤的嘌呤，連接可以是經(jīng)由8位置處。所要求保護(hù)的方法及組分并不限于任何特定類型的探針分子410，例如寡核苷酸。用以將納米條形碼420附著于其它類型的探針410例如肽、蛋白和/或抗體探針410的方法在本領(lǐng)域是已知的。
本發(fā)明的實施方案并沒有限制可以使用的納米條形碼420的類型。在本領(lǐng)域已知的任何類型的納米條形碼420都可以使用。非限制性的實例包括碳納米管、富勒烯和亞微米金屬條形碼。
金屬條形碼潛在的可用作納米條形碼420的亞微米金屬條形碼的實例在本領(lǐng)域是已知的(例如，Nicewarner-Pena等人，Science 294137-141，2001)。Nicewarner-Pena等人(2001年)公開了制備由亞微米條(submicrometerstripes)編碼的多金屬微棒(multimetal microrods)的方法，其是由不同類型的金屬組成。該系統(tǒng)允許產(chǎn)生非常大量的可區(qū)分的納米條形碼420——使用兩種類型的金屬就可達(dá)到4160種，而利用三種不同類型的金屬則可以達(dá)到8×105種之多。這樣的納米條形碼420可以整合到已編碼探針130、230、340、400，并利用SPM技術(shù)讀取。將諸如金或銀的金屬顆粒粘附到寡核苷酸和其它類型的探針分子410的方法在本領(lǐng)域是已知的(例如美國專利5,472,881)。
碳納米管其它的在所揭示的方法中使用的示范性的納米條形碼420包括單壁碳納米管(SWNT)。納米管可以制作成各種形狀和大小，并可通過SPM方法來區(qū)分(參見，例如Freitag等人，Phys.Rev.B 62R2307-R2310，2000；Clauss等人，Europhys.Ltte.47601-607，1999；Clauss等人，Phys.Rev.B 58R4266-4269，1998；Odom等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.960203-215，2002)。Odom等人(2002年)公開了一種STM(掃描穿隧顯微鏡)技術(shù)，該技術(shù)能夠檢測到10納米或更小尺寸的SWNT的隧穿譜中的離散峰。這樣的峰可以代表碳納米管的電子態(tài)密度(DOS)中的van Hove奇異性。
碳納米管的電子性質(zhì)通過該管的長度和直徑來調(diào)節(jié)。電子波函數(shù)對長度的敏感性可以通過長度為L的管子的能級劈裂的估計來說明。
ΔE＝hvF/2L(式1)其中h為普朗克常數(shù)，vF為費米速度(8.1×105米/秒)(1996年11月23日，Venema等人，“Imaging Electron Wave Functions of CarbonNanotubes”，Los Alamos Physics Preprintscond-mat/9811317)。電子能級間的差異與該納米管的長度成反比，較長的管子會觀察到的較細(xì)密的劈裂。
碳納米管的光學(xué)性質(zhì)也是管直徑的函數(shù)?；灸芰块g隙(最高占據(jù)分子軌道-最低未占據(jù)分子軌道)與管直徑間的關(guān)系可以利用下列函數(shù)來建模Egap＝2y0acc/d(式2)其中y0為碳-碳緊密結(jié)合重疊能量(C-C tight bonding overlapenergy)(2.7±0.1電子伏特)，acc為最鄰近的碳-碳距離(0.142納米)，d為管直徑(1998年，Jeroen等人，Nature 39159-62)。
對于本發(fā)明的某些實施方案，用作納米條形碼420的納米管可以具有大約10到200納米的管長度，及大約1.2到1.4納米的直徑。用作納米條形碼420的納米管的長度或直徑并沒有限制，而實際上可以考慮任何長度或直徑的納米管。
可以預(yù)想到，納米管可通過已知的方法制備或從商業(yè)來源取得，例如CarboLex(Lexington，KY)、NanoLab(Watertown，MA)、材料和電化學(xué)研究中心(Tucson，AZ)或碳納米科技公司(Houston，TX)。在使用之前，合成的或購買到的納米管可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚怼Ｋ鎏幚砜梢园ㄟ^純化將納米管與其它污染物分開、將混合直徑和/或長度的納米管分離為具有離散的直徑和長度的納米管、將納米管的末端結(jié)構(gòu)去除，和/或進(jìn)行共價修飾以有利于納米管附著到探針410上，形成已編碼探針130、230、340、400。
在本發(fā)明的某些實施方案中，具有可變長度和/或直徑的碳納米管可以利用在本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生，所述技術(shù)包含但不限于碳-電弧放電、藉由碳?xì)浠衔锏拇呋邷胤纸獾幕瘜W(xué)氣相沉積、等離子體輔助化學(xué)氣相沉積、含有催化金屬的石墨目標(biāo)的激光燒蝕、或壓縮電解(參見，例如美國專利6,258,401、6,283,812和6,297,592)。在某些實施方案中，納米管可以通過質(zhì)譜方法按大小進(jìn)行分選(參見，1991年，Parker等人，J.Am.Chem.Soc.1137499-7503)?；蛘撸{米管可以在整合入已編碼探針130、230、340、400之前，使用AFM(原子力顯微鏡術(shù))或STM(掃描穿隧顯微鏡術(shù))來分選，精確地量測單個納米管的幾何形狀。其它的在本領(lǐng)域中已知的大小分級的方法是已知的，例如氣相色譜、飛行時間質(zhì)譜、超濾或等同的技術(shù)都可以考慮。被分選之后，碳納米管可以被衍生化，共價地附著于具有已知序列的寡核苷酸探針410或任何其它類型的探針410。
對于碳納米管可能的是，其管長度的最小增量為碳-碳鍵的長度，或者大約0.142納米。對于200納米的管長度范圍，可允許獲得大約1400個離散的納米條形碼420。然而，該方法并不限于每一已編碼探針130、230、340、400使用一個納米管。在另外的實施方案中，不同長度及直徑的多個納米管可以附著于單個已編碼探針130、230、340、400。利用不同長度的納米管的組合，可能的可分辨納米條形碼420的數(shù)目將以指數(shù)方式增加。在一些實施方案中，單個納米管可以附著于單個碳針分子410，以簡化分析。
本發(fā)明的其它實施方案涉及制造具有確定長度和直徑的碳納米管的方法。在一個非限制性的示范實施方案中，一個芯片可以含有一層具有預(yù)先選擇的厚度的SiC，還重疊著一個由例如硅或摻雜有催化劑(例如，金屬原子，比如鎳)的硅所組成的層。使用標(biāo)準(zhǔn)的芯片處理方法，諸如照相平板印刷和蝕刻或激光燒蝕，該SiC層可以被分割成任何長度、寬度、厚度和形狀的SiC沉積物。然后，該芯片可以在真空中加熱，例如在大約10-7Torr和大約1400℃，或者從大約10-3到10-12Torr、10-4到10-10Torr，或10-5到10-9Torr，以及從1200℃到2200℃或1400℃到2000℃。在這些條件下，SiC晶體會自發(fā)地分解，失去硅原子(美國專利6,303,094)。剩余的碳原子自發(fā)地組合成碳納米管。SiC沉積物的大小及形狀可以精確地控制，以制造任何長度和直徑的碳納米管。
在上文中所討論的本發(fā)明的示范性實施方案并不是限制性的，制造具有已選擇的長度和直徑的碳納米管的任何方法都可以使用(例如美國專利6,258,401；6,283,812和6,297,592)。在某些實施方案中，納米管長度可以通過使用激光束、電子束、離子束或氣體等離子束切除其末端來調(diào)節(jié)?；蛘撸{米管的末端可以在含氧的氣氛中與熱片(hotblade)接觸，通過氧化反應(yīng)去除該管子的末端。含有納米管的塊狀物也可以被切割成段或被拋磨以截斷納米管。
在本發(fā)明的某些實施方案中，碳納米管可以用反應(yīng)活性基團(tuán)來衍生化，以促進(jìn)與探針分子410的粘附。在一個非限制性的例子中，納米管可以被衍生化以含有羧酸基團(tuán)(美國專利6,187,823)。羧化衍生的納米管可以通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法附著到探針分子410上，例如與位于探針410上的伯胺或仲胺基團(tuán)形成由碳二亞胺介導(dǎo)的酰胺連接。衍生化和交聯(lián)的方法并沒有限制，任何在本領(lǐng)域中已知的反應(yīng)基團(tuán)或交聯(lián)方法都可以使用。
富勒烯在本發(fā)明的另外的實施方案中，富勒烯可以用作納米條形碼420。制造富勒烯的方法是為人所熟知的(例如美國專利6,358,375)。富勒烯可以利用類似于上文中針對碳納米管所揭示的方法來衍生和附著到探針分子410上。含有富勒烯的已編碼探針130、230、340、400可以利用SPM技術(shù)來鑒別，類似于上文中針對納米管所揭示的方法。
在本發(fā)明的某些實施方案中，富勒烯可以附著于寡核苷酸已編碼探針130、230、340、400中單獨的核苷酸。在這樣的情況下，只要求兩種不同類型的可區(qū)分的富勒烯，因為在寡核苷酸中只發(fā)現(xiàn)四種類型的核苷酸，而兩種類型的富勒烯可以組合成四種不同的組合(例如AA、BB、AB和BA)。當(dāng)單個的核苷酸被附著到納米條形碼420時，在該核苷酸和富勒烯之間使用已知的鏈接基團(tuán)可能是恰當(dāng)?shù)?，這樣可以避免與目標(biāo)核酸雜交時的空間位阻。
熟練的技術(shù)人員會意識到，在所揭示的方法中使用的納米條形碼420并不限于在此揭示的實施方案，而是可以包括任何其它類型的已知的納米條形碼420，所述納米條形碼420可以附著于探針410和被檢測。其它可能使用的納米條形碼420的非限制性的例子包括量子點(例如Schoenfeld等人，Proc.7th Int.Conf.on Modulated SemiconductorStructures，Madrid，pp.605-608，1995；Zhao等人，1st Int.Conf.on LowDimensional Structures and Devices，Singapore，pp 467-471，1995)。量子點和其它類型的納米條形碼420可以利用已知的方法來合成和/或從商業(yè)來源取得(例如量子點公司，Hayward，CA)。其它可能使用的納米條形碼420包括納米顆粒，可以從例如Nanoprobes Inc.(Yaphank.NY)和Polysciences，Inc.(Warrington，PA)獲得。
基于寡核苷酸的已編碼探針的雜交和連接反應(yīng)在本發(fā)明的各種實施方案中，目標(biāo)核酸與寡核苷酸型已編碼探針130、230、340、400文庫的雜交可以在只允許完全互補(bǔ)的核酸序列雜交的嚴(yán)緊條件(stringent conditions)下發(fā)生。低嚴(yán)緊的雜交通常是在0.15M到0.9M的NaCl和20℃到50℃的溫度范圍執(zhí)行。高嚴(yán)緊雜交通常是在0.02M到0.15M的NaCl和50℃到70℃的溫度范圍執(zhí)行。應(yīng)了解的是，具有適當(dāng)?shù)膰?yán)緊性的溫度和/或離子強(qiáng)度是部分地由寡核苷酸探針410的長度、目標(biāo)序列的堿基組成，及在雜交混合物中甲酰胺、四甲基氯化銨或其它溶劑的存在來決定的。上文所提到的范圍是供示范用，對于特定的雜交反應(yīng)，合適的嚴(yán)緊性通常是利用與陽性和/或陰性對照的比較依經(jīng)驗確定的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠慣常地調(diào)整雜交條件，以保證只有精確互補(bǔ)的核酸序列間的嚴(yán)緊雜交發(fā)生。
一旦短的已編碼探針130、230、340、400已經(jīng)雜交到核酸上，相鄰的已編碼探針130、230、340、400便可以使用已知的方法(參見例如美國專利6,013,456)連接在一起。短至6到8個堿基的核苷酸序列可以有效地與目標(biāo)核酸雜交(美國專利6,013,456)。不依賴于引物的連接可以用長度為至少6到8個堿基的寡核苷酸來完成(Kaczorowski和Szybalski，Gene 179189-193，1996；Kotler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904241-45，1993)。將與核酸模板雜交的寡核苷酸已編碼探針130、230、340、400連接起來的方法在本領(lǐng)域中是已知的(美國專利6,013,456)。相鄰的寡核苷酸已編碼探針130、230、340、400的酶促連接可以利用DNA連接酶，例如T4、T7或Taq連接酶或大腸桿菌DNA連接酶。酶促連接的方法是已知的(例如，Sambrook等人，1989)。
分子的固定化在本發(fā)明的各種實施方案中，要被分析的目標(biāo)分子可以在已編碼探針130、230、340、400結(jié)合之前、之后和/或期間被固定化。例如，目標(biāo)分子的固定化可用來促進(jìn)已結(jié)合的已編碼探針130、230、340、400與未結(jié)合的已編碼探針130、230、340、400的分離。在某些實施方案中，目標(biāo)分子的固定化也可在已編碼探針130、230、340、400被檢測和/或鑒別之前，用來將已結(jié)合的已編碼探針130、230、340、400與目標(biāo)分子分離。雖然下面的討論是針對核酸的固定，但是技術(shù)人員應(yīng)了解到，固定各種類型的生物分子的方法在本領(lǐng)域是已知的，它們可以用于所要求保護(hù)的方法中。
核酸固定化可以用來，例如，促進(jìn)目標(biāo)核酸與連接的已編碼探針130、230、340、400的分離、與未雜交的已編碼探針130、230、340、400的分離，或與彼此雜交的已編碼探針130、230、340、400的分離。在非限制性的實例中，目標(biāo)核酸可以被固定，并允許與已編碼探針130、230、340、400雜交，之后，已雜交的相鄰的已編碼探針130、230、340、400被連接在一起。含有已結(jié)合的核酸的混合物被輕輕清洗，以除去未雜交的已編碼探針130、230、340、400和雜交到其它已編碼探針130、230、340、400上的已編碼探針130、230、340、400。在清洗之后，已雜交且已連接的已編碼探針130、230、340、400可以通過加熱到大約攝氏90到95度數(shù)分鐘，使之與固定化的目標(biāo)核酸分離。所述的已連接的已編碼探針130、230、340、400可以粘附至一個表面100、220、300上，并利用分子梳來排列對準(zhǔn)，如同上文中所揭示。經(jīng)排列對準(zhǔn)的已編碼探針130、230、340、400接著可以用SPM來分析。
核酸的固定可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法來達(dá)成。在本發(fā)明的一個示范性的實施方案中，固定化可以通過將基質(zhì)以鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆，接著粘附生物素標(biāo)記核酸來實現(xiàn)(Holmstrom等人，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定化也可以通過在硅、玻璃或其它基質(zhì)上包覆聚-L-Lys(賴氨酸)，接著用雙功能交聯(lián)試劑共價聯(lián)結(jié)氨基修飾或巰基修飾的核酸來實現(xiàn)(Running等人，BioTechniques 8276-277，1990；Newton等人，Nucleic Acids Res.211155-62，1993)。胺類殘基可以通過應(yīng)用氨基硅烷而被導(dǎo)入到基質(zhì)上，以便交聯(lián)。
固定可以通過5′-磷酸化核酸與經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)之間的直接共價連接而發(fā)生(Rasmussen等人，Anal.Biochem.198138-142，1991)。在核酸與基質(zhì)之間的共價鍵通過水溶性碳二亞胺或其它交聯(lián)劑的縮合來形成。該方法方便了核酸主要經(jīng)由其5′-磷酸的5′-連接。示范性的修飾基質(zhì)包含已經(jīng)在酸液中處理過的玻璃載片或覆蓋滑片，其在玻璃上暴露出SiOH基團(tuán)(美國專利5,840,862)。
通常，首先硅烷化玻璃基質(zhì)，然后用碳二亞胺或戊二醛活化，這樣DNA被結(jié)合到玻璃上。另外的程序可以使用諸如3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GOP)、乙烯基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)的試劑和在分子的3′或5′末端連接有整合的氨基連接子的DNA。DNA可以使用紫外輻射直接結(jié)合到薄膜基質(zhì)。其它的核酸固定技術(shù)的非限制性的例子公開在美國專利5,610,287、5,776,674和6,225,068。商業(yè)上可獲得的用于核酸結(jié)合的基質(zhì)是可利用的，例如Covalink、Costar、Estapor、Bangs和Dynal。技術(shù)人員應(yīng)了解到，在此所公開的方法并不受限于核酸的固定，它們也可能用于，例如，將寡核苷酸已編碼探針130、230、340、400的一端或兩端粘附至基質(zhì)。
用以固定核酸或其它目標(biāo)分子的基質(zhì)的類型是沒有限制的。在本發(fā)明的各種實施方案中，固定基質(zhì)可以是磁珠、非磁性珠、平面基質(zhì)或可由幾乎任何材料構(gòu)成的具有任何其它形態(tài)的固體基質(zhì)。可以使用的基質(zhì)的非限制性的例子包含玻璃、硅石、硅酸鹽、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、用銀或其它金屬涂覆的基質(zhì)、硝酸纖維素、尼龍、活化石英、活化玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、其它的諸如聚氯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物，以及光敏聚合物，其含有光活性物質(zhì)，例如能夠與核酸分子形成共價連接的氮賓、卡賓、羰自由基(參見美國專利5,405,766和5,986,076)。
雙功能交聯(lián)劑可以在本發(fā)明的各種實施方案中應(yīng)用。雙功能交聯(lián)劑能夠根據(jù)它們的功能基團(tuán)的特異性來劃分，例如氨基、胍基、吲哚、或羧基特異性基團(tuán)。在這些之中，針對自由氨基基團(tuán)的試劑是較為普遍應(yīng)用的，因為它們可從商業(yè)途徑獲得、容易合成，并且它們被加以應(yīng)用時的反應(yīng)條件溫和。交聯(lián)分子的示范性方法被公開在美國專利5,603,872和5,401,511。交聯(lián)試劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環(huán)氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)，以及碳二亞胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。
掃描探針顯微鏡術(shù)掃描探針顯微鏡術(shù)(SPM)是在微米和/或納米尺度上量測物體的物理性質(zhì)的一系列儀器。SPM技術(shù)的不同形式是可利用的，這在下文會更詳細(xì)討論。任何形式的SPM分析都可以用來檢測和/或鑒別已編碼探針130、230、340、400。一般來說，SPM儀器是使用非常小的、點式的探針在非?？拷砻?00、220、300的區(qū)域測量物體的性質(zhì)。在一些類型的SPM儀器中，探針可以安裝在懸臂上，該懸臂可以長約數(shù)百微米，厚度大約0.5到5.0微米。典型地，探針尖端是在xy模式下越過表面100、220、300進(jìn)行光柵掃描，以描繪表面100、220、300性質(zhì)的局部變化。應(yīng)用SPM來描繪生物分子和/或檢測用作納米條形碼420的分子的方法在本領(lǐng)域是已知的(例如1996年Wang等人，Amer.Chem.Soc.Lett.，121697-98；1998年Kim等人，Appl.Surface Sci.130，230，340-132602-609；2000年Kobayashi等人，Appl.Surface Sci.157228-32；2000年Hirahara等人，Phy.Rev.Lett.855384-87；2001年Klein等人，Applied Phys.Lett.782396-98；2001年Huang等人，Science 291603-33；2001年Ando等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA12468-72)。
掃描穿隧顯微鏡術(shù)(STM)掃描穿隧顯微鏡術(shù)在20世紀(jì)80年代初發(fā)展出來的第一種SPM技術(shù)。STM依賴于在探針尖端與樣品表面100、220、300間量子機(jī)械電子穿隧的存在。該尖端被銳化成單個原子點，在表面100、220、300進(jìn)行光柵掃描，掃描時維持探針-表面100、220、300的間隔距離為幾個埃而又不實際接觸到表面100、220、300。微小的電勢差(在微伏到幾伏這個級別)被施加于在探針尖端與樣品之間，在尖端與樣品間的穿隧電流便可以被測量到。當(dāng)尖端掃描過表面100、220、300時，樣品的電子性質(zhì)和拓?fù)湫再|(zhì)的差異會造成穿隧電流大小的變化。在本發(fā)明的某些實施方案中，尖端的相對高度可以通過具有回饋控制且與計算機(jī)相連接的壓電組件來控制。計算機(jī)可以實時監(jiān)控電流強(qiáng)度，上下移動尖端以維持相對固定的電流。在不同的實施方案中，尖端的高度和/或電流強(qiáng)度可以利用計算機(jī)來處理，從而得到被掃描的表面100、220、300的圖像。
因為STM測量樣品的電子性質(zhì)和拓?fù)湫再|(zhì)，所以它能夠分辨不同類型的傳導(dǎo)材料，例如在金屬條形碼中的不同類型金屬。STM也能夠測量局部電子密度。因為穿隧傳導(dǎo)性與局部能態(tài)密度(DOS)成正比，所以STM也可用以區(qū)分碳納米管，所述碳納米管的電性質(zhì)依其直徑和長度而發(fā)生變化。STM可用以偵測及/或鑒別任何不同于它們電子性質(zhì)之納米條形碼420。
STM探針的尖端可以掃描含有已排列對準(zhǔn)的已編碼探針130、230、340、400的表面100、220、300，從而檢測和鑒別在該表面100、220、300上的各個已編碼探針130、230、340、400。連接的已編碼探針130、230、340、400也可以被鑒別。目標(biāo)分子可以通過確定哪些已編碼探針130、230、340、400結(jié)合到目標(biāo)分子上來加以鑒別。在本發(fā)明的一些實施方案中，已編碼探針130、230、340、400表示特定序列(例如寡核苷酸序列)的存在，那么生物分子的序列就可以從結(jié)合于目標(biāo)分子的已編碼探針130、230、340、400的序列來確定。
原子力顯微鏡術(shù)另一種形式的SPM是原子力顯微鏡術(shù)(AFM)。利用AFM進(jìn)行生物分子分析的方法在本領(lǐng)域中是廣為人知的(例如，Uchihashi等人，“Application of Noncontact-Mode Atomic Force Microscopy toMolecular Imaging”，http//www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)。在AFM顯微鏡術(shù)中，探針是附著在載有彈簧的或彈性的懸臂上，該懸臂與待分析的表面100、220、300相接觸。接觸時的距離是在分子力范圍之內(nèi)(即在范德華力的作用范圍內(nèi))。在AFM中，不同模式的操作都是可能應(yīng)用的，包含接觸模式、非接觸模式和TappingModeTM。
在接觸模式中，探針尖端與樣品表面100、220、300之間的原子力被測量，其中保持尖端-樣品的距離不變，測量懸臂的偏移，這通常是利用將激光從懸臂反射到位置靈敏的檢測器。懸臂的偏移造成被反射的激光束的位置變化。與在STM中的情形一樣，探針尖端的高度可以由計算機(jī)控制，其中使用具有回饋控制的壓電組件。在本發(fā)明的一些實施方案中，通過升起或降低探針尖端來維持相對固定角度的偏移。由于探針尖端與樣品可以有實際的(范德華)接觸，所以接觸模式的AFM往往會使非剛硬的樣品變形。在非接觸模式中，尖端被維持在樣品表面100、220、300之上約50到150埃之間，并且該尖端會振蕩。在尖端與樣品表面100、220、300之間的范德華相互作用就反映在該尖端振蕩的相位、振幅或頻率的變化。非接觸模式所達(dá)到的分辨率相對較低。
在TappingModeTM中，懸臂梁應(yīng)用壓電組件，在其共振頻率或接近其共振頻率處振蕩。AFM尖端周期性地接觸(拍打)樣品表面100、220、300，其頻率約為在空氣中每秒50,000到500,000個循環(huán)，而在液體中頻率要低些。當(dāng)尖端開始接觸樣品表面100、220、300時，振蕩的振幅會降低。振幅的變化被用來確定樣品的拓?fù)湫再|(zhì)。因為AFM分析并非取決于電子傳導(dǎo)，所以它可以用來分析非傳導(dǎo)材料的拓?fù)湫再|(zhì)。拓?fù)湫再|(zhì)具有差異的某些類型的納米條形碼420，包含但不限于碳納米管、富勒烯及納米顆粒，都可以利用AFM技術(shù)來檢測和/或鑒別。
在別的AFM模式中，除了樣品的拓?fù)涿枋鲋?，還可以獲得額外的信息。例如，在橫向力顯微鏡術(shù)(LFM)中，探針是以垂直于其長度的方向掃描，懸臂的扭力的角度被確定。懸臂扭力取決于表面100、220、300的摩擦特性。因為已編碼探針130、230、340、400的摩擦特性可以依其組成而發(fā)生變化，所以LFM可用以檢測和鑒別不同的已編碼探針130、230、340、400。
另一種變化是化學(xué)力顯微鏡術(shù)(CFM)，其中探針尖端用化學(xué)物質(zhì)功能化，掃描樣品時檢測在該化學(xué)物質(zhì)與該樣品之間的粘附力(例如，1994年，F(xiàn)risbie等人，Science，2652071-2074)。對納米條形碼420材料具有不同親和性的化學(xué)物(例如金或銀)可以被整入到AFM探針尖端中，它掃描表面100、220、300以檢測和鑒別納米條形碼420。其它可能使用的SPM模式是力調(diào)變成像(1991年，Maivald等人，Nanotechnology，2103)。Uchihashi等人公開了一種在非接觸模式AFM中使用頻率調(diào)變進(jìn)行生物分子成像的方法(http//www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)。
其它可能用以檢測和/或鑒別已編碼探針130、230、340、400的SPM模式包括磁力顯微鏡術(shù)(MFM)、高頻MFM、磁阻敏感映像(magnetoresistive sensitivity mapping，MSM)、電子力顯微鏡術(shù)(EFM)、掃描電容顯微鏡術(shù)(SCM)、掃描延伸電阻顯微鏡術(shù)(SSRM)、穿隧AFM和傳導(dǎo)AFM。在這些形式中的某一些，樣品的磁性質(zhì)可以被確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，金屬條形碼和其它類型的納米條形碼420可以被設(shè)計成能夠利用其磁性及電性質(zhì)來鑒別。
供已編碼探針130、230、340、400檢測和/或鑒別使用的SPM儀器可以在商業(yè)上獲得(例如Veeco Instruments，Inc.，Plainview，NY；Digitali Instruments，Oakland，CA)。或者，可以使用為客戶定制的SPM儀器。
信息處理和控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)分析在本發(fā)明的某些實施方案中，用于生物分子分析的系統(tǒng)可以包含信息處理及控制系統(tǒng)。實施方案并不限制所使用的信息處理系統(tǒng)的類型。這樣的系統(tǒng)可以用來分析由SPM儀器獲得的數(shù)據(jù)，和/或用來控制SPM探針尖端的移動、所使用的SPM成像的形式以及獲得SPM數(shù)據(jù)的精確技術(shù)。示范性的信息處理系統(tǒng)可以包含計算機(jī)，該計算機(jī)含有用于數(shù)據(jù)通訊的總線和用于處理信息的處理器。在一個實施方案中，處理器是奔騰(Pentium)系列的處理器，包括但不限于奔騰II系列、奔騰III系列及奔騰4系列的處理器，這些可以從英特爾公司(SantaClara，CA)獲得。在本發(fā)明的另外的實施方案中，處理器可以是Celeron、Itanium、X-Scale或奔騰Xeon處理器(英特爾公司，SantaClara，CA)。在本發(fā)明的各種其它的實施方案中，處理器可以是基于英特爾(Intel)構(gòu)架，例如英特爾IA-32或英特爾IA-64構(gòu)架。或者，也可以使用其它處理器。
計算機(jī)可以進(jìn)一步包含隨機(jī)存儲器(RAM)或其它的動態(tài)儲存裝置、只讀存儲器(ROM)或其它的靜態(tài)儲存和數(shù)據(jù)儲存裝置，例如磁盤或光盤及其對應(yīng)的驅(qū)動。信息處理系統(tǒng)還可以包含其它在本領(lǐng)域已知的外圍設(shè)備，例如顯示設(shè)備(例如陰極射線管或液晶顯示器)、字母數(shù)字輸入設(shè)備(例如鍵盤)、光標(biāo)控制設(shè)備(例如鼠標(biāo)、跟蹤球或光標(biāo)方向鍵)及通訊設(shè)備(例如調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)連接卡、或用來連接到以太網(wǎng)、令牌網(wǎng)或其它類型的網(wǎng)絡(luò)的接口設(shè)備)。
在本發(fā)明的特定實施方案中，SPM(掃描探針顯微鏡術(shù))單元可以連接到該數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。來自SPM的數(shù)據(jù)可以用該處理器和儲存在主存儲器中的數(shù)據(jù)來處理。處理器可以分析來自SPM的數(shù)據(jù)以鑒別和/或確定附著于表面100、220、300的已編碼探針130、230、340、400的序列。通過將連接的已編碼探針130、230、340、400的序列重疊在一起，計算機(jī)可以編輯出目標(biāo)核酸的序列?；蛘撸诟街诒砻?00、220、300的已編碼探針130、230、340、400的身份，計算機(jī)可以鑒別出存在于樣品中的不同的已知生物分子物質(zhì)。
應(yīng)該了解，配置不同的信息處理系統(tǒng)可以供某些特定執(zhí)行使用。因此，系統(tǒng)的配置可以在本發(fā)明的不同實施方案中有所變化。在本發(fā)明的另外的實施方案中，在此描述的處理過程可以在程序控制的處理器的控制下執(zhí)行，此時處理器可以完全或部分地通過任何可編程邏輯或硬編碼邏輯，例如，現(xiàn)場可編程序門陣列(FPGA)、TTL邏輯或特定用途集成電路(ASIC)，來加以執(zhí)行。另外，所公開的方法可以通過程控的通用計算機(jī)組件和/或定制的硬件組件的任何組合來加以實施。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以應(yīng)用為客戶設(shè)計的軟件包來分析從SPM獲得的數(shù)據(jù)。在本發(fā)明另外的實施方案中，數(shù)據(jù)分析可以使用信息處理系統(tǒng)和可公開獲得的軟件包來執(zhí)行?？梢垣@得的用于DNA序列分析的軟件的非限制性的例子包括PRISMTMDNA測序分析軟件(Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)、SequencherTM軟件包(GeneCodes，Ann Arbor，MI)，和可以通過訪問National BiotechnologyInformation Facility，網(wǎng)址www.nbif.org/links/1.4.1.php獲得的各種軟件包。
實施例實施例1納米條形碼和掃描探針顯微鏡術(shù)本發(fā)明的示范性的實施方案描述于圖1到圖4。圖1A和圖1B說明了一種用以在表面100、220、300上排列對準(zhǔn)已編碼探針130、230、340、400的非限制性的方法。表面100、220、300，例如已經(jīng)利用已知的方法以鏈霉抗生物素蛋白包覆的玻璃顯微鏡載片100、220、300，被浸入到含有生物素標(biāo)記已編碼探針130、230、340、400的溶液110、210中。該溶液可以存放在容器120內(nèi)。
在非限制性的實例中，已編碼探針130、230、340、400包括寡核苷酸探針410，所述探針已經(jīng)被雜交到目標(biāo)核酸分子上。核酸分子可以通過粘附到尼龍膜、96孔微量滴定板或其它固定基質(zhì)上來固定。包含例如所有4096種可能的六聚體序列的生物素化寡核苷酸可以從商業(yè)來源獲得(例如Midland Certified Reagents，Midland，TX)。生物素化寡核苷酸可以粘附至例如亞微米金屬條形碼(2001年，Nicewarner-Pena等人)，從而形成已編碼探針130、230、340、400。所述的已編碼探針130、230、340、400被允許與目標(biāo)核酸發(fā)生雜交。雜交之后，相鄰的已編碼探針130、230、340、400使用連接酶連接在一起。未雜交的已編碼探針130、230、340、400以及彼此互相雜交的已編碼探針130、230、340、400通過輕輕的清洗來去除，只留下雜交到核酸上的已編碼探針130、230、340、400。所述的已編碼探針130、230、340、400通過加熱溶液110、210到95℃達(dá)5分鐘來分開。粘附在固定基質(zhì)上的核酸被移走，只留下連接的已編碼探針130、230、340、400在溶液110、210中。
生物素標(biāo)記的已編碼探針130、230、340、400在其一末端粘附到鏈霉抗生物素蛋白包覆的表面100、220、300。該表面100、220、300緩慢地從溶液110、210中移出?；蛘?，溶液110、210中的液體緩慢地從容器120中移走，例如通過蒸發(fā)或緩慢的抽吸。當(dāng)空氣-水界面的彎月面緩慢地移過該表面100、220、300時，已粘附的已編碼探針130、230、340、400便排列對準(zhǔn)于該表面100、220、300上。被排列的已編碼探針130、230、340、400可以利用AFM、STM或其它掃描探針方法來分析。
本發(fā)明的另一個示范性的實施方案說明于圖2中。一滴含有已編碼探針130、230、340、400的溶液210被放置在表面100、220、300上，例如玻璃載片上。在某些實施方案中，載片100、220、300可以如上所公開地進(jìn)行處理，以結(jié)合已編碼探針130、230、340、400的一端或兩端。液滴210被夾在表面100、220、300與玻璃覆蓋滑片200之間。在各種實施方案中，覆蓋滑片200可以保持在固定的位置，此時表面100、220、300慢慢地抽離該覆蓋滑片200。這就在覆蓋滑片200的邊緣處產(chǎn)生了彎月面，它可以用來排列比對已編碼探針130、230、340、400。
在本發(fā)明的各種實施方案中，已編碼探針130、230、340、400可以在其兩端而非一端粘附到表面100、220、300上。在這種情況中，已編碼探針130、230、340、400的排列會造成U形的分子，而非線性的分子(例如美國專利5,840,862)。圖1和圖2所說明的示范性實施方案也可以通過將已編碼探針130、230、340、400的兩端粘附到表面100、220、300來執(zhí)行(未顯示)。
在另一種示范性實施方案中，如在圖3中所說明的，已編碼探針130、230、340、400可以藉由自由流動電泳排列在表面100、220、300。該表面可以含有傳導(dǎo)材料和非傳導(dǎo)材料相交替的帶狀物，例如金屬膜310涂布在玻璃片320上。在存在交流電場330的情況下，含有帶電殘基例如寡核苷酸上的磷酸基團(tuán)的已編碼探針130、230、340、400將隨電場330排列。自由流動電泳可以和分子梳結(jié)合使用，或者替代分子梳使用，以排列已編碼探針130、230、340、400于表面100、220、300上。執(zhí)行自由流動電泳的方法是已知的(例如，Adjari和Prost，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884468-71，1991)。然而，本申請第一次提出將自由流動電泳用以在表面上排列分子的應(yīng)用。
所有在此公開的和要求保護(hù)的方法、組合物和裝置都可以根據(jù)這里的公開內(nèi)容來制作和使用，而不需要非預(yù)期的實驗。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，變化可以在不悖離所要求保護(hù)的主題的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，應(yīng)用于在此所公開的方法、組合物及裝置。更特別地，應(yīng)了解，某些相關(guān)的試劑可以替代在此描述的試劑，而且能夠獲得相同或類似的結(jié)果。所有這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很明顯的類似替代和修飾都被視為落入所要求保護(hù)的主題的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括a)獲得一個或多個已編碼探針，每個已編碼探針包含附著有至少一個納米條形碼的探針分子；b)將目標(biāo)分子與已編碼探針接觸；c)鑒別結(jié)合到目標(biāo)分子上的已編碼探針；和d)檢測和/或鑒別該目標(biāo)分子。
2.如權(quán)利要求
1的方法，其中每個已編碼探針包括寡核苷酸。
3.如權(quán)利要求
2的方法，其中所述目標(biāo)分子是核酸。
4.如權(quán)利要求
3的方法，其中將已編碼探針的文庫與目標(biāo)分子接觸，所述已編碼探針的文庫含有具有特定長度的寡核苷酸的所有可能序列。
5.如權(quán)利要求
1的方法，其中所述納米條形碼選自碳納米管、富勒烯、亞微米金屬條形碼、納米顆粒和量子點。
6.如權(quán)利要求
3的方法，其中所述核酸粘附于表面上。
7.如權(quán)利要求
6的方法，進(jìn)一步包括將已雜交到核酸上的相鄰的已編碼探針連接起來。
8.如權(quán)利要求
7的方法，進(jìn)一步包括將連接起來的已編碼探針與核酸和非連接的已編碼探針分離。
9.如權(quán)利要求
1的方法，進(jìn)一步包括通過分子梳將已編碼探針排列在表面上。
10.如權(quán)利要求
1的方法，其中已編碼探針是利用掃描探針顯微鏡術(shù)來鑒別。
11.如權(quán)利要求
10的方法，其中所述掃描探針顯微鏡術(shù)是選自原子力顯微鏡術(shù)、掃描穿隧顯微鏡術(shù)、橫向力顯微鏡術(shù)、化學(xué)力顯微鏡術(shù)、力調(diào)變成像術(shù)、磁力顯微鏡術(shù)、高頻磁力顯微鏡術(shù)、磁阻敏感映像、電子力顯微鏡術(shù)、掃描電容顯微鏡術(shù)、掃描延伸電阻顯微鏡術(shù)、穿隧原子力顯微鏡術(shù)和傳導(dǎo)原子力顯微鏡術(shù)。
12.如權(quán)利要求
9的方法，其中被排列在表面上的已編碼探針是利用掃描探針顯微鏡術(shù)來鑒別。
13.如權(quán)利要求
12的方法，進(jìn)一步包括確定結(jié)合到核酸的寡核苷酸的序列。
14.如權(quán)利要求
13的方法，進(jìn)一步包括由結(jié)合到核酸的寡核苷酸的序列，確定出核酸的序列。
15.如權(quán)利要求
3的方法，進(jìn)一步包括由結(jié)合到核酸的已編碼探針來鑒別該核酸。
16.如權(quán)利要求
1的方法，其中所述目標(biāo)分子是蛋白、肽、糖蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、脂質(zhì)、糖脂或多糖。
17.如權(quán)利要求
16的方法，其中兩個或更多個目標(biāo)分子存在于樣品中，在該樣品中的所有目標(biāo)分子同時被分析。
18.如權(quán)利要求
16的方法，其中兩個或更多個目標(biāo)分子存在于樣品中，所有相同類型的目標(biāo)分子同時被分析。
19.一種組合物，其包含至少一個已編碼探針，每個已編碼探針包含附著于至少一個納米條形碼的探針分子。
20.如權(quán)利要求
19的組合物，其中所述探針分子是選自寡核苷酸、多核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、基因工程抗體、單鏈抗體、人源化抗體、結(jié)合蛋白、受體蛋白、傳運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、肽、凝集素、底物、抑制劑、活化劑、配體、激素、細(xì)胞因子、趨化因子、藥物和藥劑。
21.如權(quán)利要求
19的組合物，其中所述探針分子是寡核苷酸。
22.如權(quán)利要求
21的組合物，其中所述寡核苷酸的長度為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個堿基。
23.如權(quán)利要求
19的組合物，其中所述納米條形碼是選自碳納米管、富勒烯、亞微米金屬條形碼、納米顆粒和量子點。
24.用于核酸測序的系統(tǒng)，包含a)掃描探針顯微鏡；b)表面；和c)至少一個附著于該表面的已編碼探針。
25.如權(quán)利要求
24的系統(tǒng)，其中所述已編碼探針通過分子梳排列在表面上。
26.如權(quán)利要求
24的系統(tǒng)，其中所述已編碼探針包括連接在一起的寡核苷酸。
27.如權(quán)利要求
24的系統(tǒng)，其中所述掃描探針顯微鏡為原子力顯微鏡或掃描穿隧顯微鏡。
專利摘要
在此公開的方法、裝置和組合物涉及諸如核酸或蛋白的生物分子的檢測、鑒別和/或測序。在本發(fā)明的某些實施方案中，含有附著于一個或多個納米條形碼的探針分子的已編碼探針可以結(jié)合到一個或多個目標(biāo)分子上。在結(jié)合以及未結(jié)合的已編碼探針分離之后，已結(jié)合的已編碼探針可以在表面上被排列比對，然后利用掃描探針顯微鏡術(shù)來分析。納米條形碼可以是能夠用SPM分辨的任何分子或復(fù)合物，諸如碳納米管、富勒烯、亞微米金屬條形碼、納米顆?；蛄孔狱c。在探針為寡核苷酸時，與目標(biāo)核酸雜交的相鄰已編碼探針可以在被排列和用SPM分析之前被連接在一起。在此也公開了含有已編碼探針的組合物。用于生物分子分析的系統(tǒng)可以包含SPM設(shè)備和至少一個粘附于表面的已編碼探針。
文檔編號G01Q60/00GKCN1681944SQ03822309
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月5日
發(fā)明者S·陳, X·蘇, M·山川 申請人:英特爾公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan