專利名稱:高效表達乙肝表面s(主蛋白)和前s1(大蛋白)融合抗原的轉(zhuǎn)基因哺乳動物細胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
高科技生物工程技術(shù)背景技術(shù)：
我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，有50-70％的人群感染過HBV，10％的人群(約1億多人)為帶毒者。目前還沒有治療乙肝的有效方法，接種乙肝疫苗是預(yù)防肝炎的有效措施。
血源疫苗國內(nèi)外已投入生產(chǎn)使用，由于血源疫苗存在著一些問題，如血源有限，帶有肯定的潛在性危險(如丙肝、艾滋病毒等)，為此需要急切研制乙肝基因工程疫苗。國內(nèi)外對乙肝基因工程疫苗的研究已得到較快的發(fā)展，美國的MSD公司應(yīng)用酵母系統(tǒng)生產(chǎn)乙肝基因工程疫苗已獲生產(chǎn)許可證。我國預(yù)防醫(yī)學科學院病毒研究所用哺乳動物細胞生產(chǎn)的乙肝基因工程疫苗也獲正式生產(chǎn)文號。
目前使用的基因工程疫苗和血源疫苗一樣，都是由乙肝表面抗原主蛋白(S)組成，該疫苗免疫原性低，用量大，約有10％左右人群對其無免疫反應(yīng)或反應(yīng)低下，另外已發(fā)現(xiàn)對主蛋白的免疫逃逸突變株，因此研究含有PreS1和PreS2的新型乙肝疫苗已受到各國科學家的重視。以色列[5]使用天然結(jié)構(gòu)研制的CHO細胞表達的含PreS1和PreS2的疫苗也顯示出很好的免疫效果。其使用量降低到2.5ug，與常規(guī)10ug量的疫苗相比，同樣產(chǎn)生較高的抗體滴度。史克公司[6]也構(gòu)建了改造的大蛋白L*，并能在酵母中穩(wěn)定表達PreS1，PreS2和S，在小鼠中也誘生相應(yīng)的抗體，但臨床試用結(jié)果并非特別優(yōu)越。
1984年M.L.Michel[1]應(yīng)用ayw亞型的乙肝病毒表面抗原大蛋白構(gòu)建重組質(zhì)粒，其特點是乙肝表面抗原大蛋白受SV40早期啟動子的調(diào)控，而dhfr(二氫葉酸還原酶)擴增基因受MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)啟動子的調(diào)控，表達系統(tǒng)應(yīng)用二氫葉酸還原酶陰性的中國地鼠卵巢細胞(CHO-dhfr-)蛋白電泳顯示出22KD，26KD的主蛋白及34KD的中蛋白條帶，未顯出大蛋白條帶，其表達量為1ug/106細胞/每天。
1986年P(guān).Dehoux等[2]用ayw亞型構(gòu)建含乙肝表面抗原大蛋白基因的重組質(zhì)粒，其大蛋白基因在PHO5(強酵母啟動子)調(diào)控下，在酵母中進行表達其表達產(chǎn)物免疫沉淀后，蛋白電泳出現(xiàn)39KD的帶條。蛋白分泌量為25ug/L。
1989年T.Lee et al[3]應(yīng)用adr亞型乙肝表面抗原天然大蛋白構(gòu)成重組質(zhì)粒，HBsAg基因的轉(zhuǎn)錄方向與SV40早期啟動子方向相反，dhfr為擴增基因，在CHO細胞中表達，其產(chǎn)量平均為1ug/107細胞/每天，蛋白印跡實驗用PreS1及PreS2單克隆抗體能分別測出40KD的PreS1及33KD，36KD的PreS2帶。
西德的Hexal Biotech公司[4]應(yīng)用改造的大蛋白疫苗(含PreS1 PreS2和S)臨床觀察有很好的效果，接種一代后抗體陽轉(zhuǎn)率可達100％，對S疫苗無反應(yīng)者也有效。國內(nèi)，上海生化研究所研制出乙肝表面抗原主蛋白羧端融合了肝細胞受體結(jié)合位點PreS1(2147)的融合抗原(14)，此融合抗原在哺乳動物細胞CV-1中能表達和分泌乙肝表面抗原S和PreS1的嵌合顆粒，免疫小鼠能同時產(chǎn)生高滴度的抗S和抗PreS1抗體，該結(jié)構(gòu)已申請了專利，申請?zhí)?4112069.4公開號CN1108306A。
表達系統(tǒng)中擴增基因的選擇是直接影響基因表達水平的重要因素之一，現(xiàn)有表達HBsAg主要使用m-dhfr[7，8]及PBV[9，10]作為擴增基因，但都存在一些不足之處。谷氨酰胺合成酶(GS)基因是最近幾年發(fā)展起來的作為擴增選擇標記基因之一，具有較高的表達效率[11]。中國預(yù)防醫(yī)學科學院病毒學研究所利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)作為擴增基因成功的在CHO細胞中高效表達了乙肝表面抗原S基因[15]，此表達系統(tǒng)已申報專利，申請?zhí)?6100703.6綜上所述，含乙肝病毒表面抗原PreS1、PreS2和S的大蛋白均已在CHO細胞或酵母中獲得表達，主要有天然的和改造的二種結(jié)構(gòu)，但所有結(jié)構(gòu)的表達效率均較低，一些結(jié)構(gòu)產(chǎn)物不穩(wěn)定，含PreS1的成分較低。由于PreS1不僅具有B細胞表位，同時有T細胞表位，能引導(dǎo)產(chǎn)生較強的細胞免疫，可增強乙肝表面S區(qū)的免疫原性。因此使用S+S1基因構(gòu)建可獲得含PreS1的乙肝表面抗原高效表達質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，并獲得相應(yīng)的高效表達細胞系就成為本發(fā)明的主要目的。

發(fā)明內(nèi)容
我們應(yīng)用pGJPSS1質(zhì)粒[16]和pSV2DHBr1-32質(zhì)粒[17]，經(jīng)過一系列的中間質(zhì)粒，最終構(gòu)建了pCHBSS1G質(zhì)粒，采用常規(guī)的磷酸鈣沉淀技術(shù)[12，13]將重組質(zhì)粒pCHBSS1G與pSV2dhfr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到約80％成片的CHO-dhfr-細胞中，篩出一系列高效分泌HBsAg陽性的克隆細胞系(GdSS1-X細胞系)。
具體實施方式
含乙肝表面抗原S+前S1重組質(zhì)粒的構(gòu)建為在哺乳動物細胞中獲得高效表達，本發(fā)明在S+S1結(jié)構(gòu)[14](本結(jié)構(gòu)在1994年申報專利，申請?zhí)枮?4112096.4，公開號為CN1108306A和GS結(jié)構(gòu)[15](本項專利發(fā)明人之一)基礎(chǔ)上，在S+S1基因后引入來源于乙肝病毒基因Adr型北京株的RNA加聚A信號AATAA、乙肝病毒增強子I(ENI)和增強子II(EN2)，并使用缺失突變技術(shù)改造了乙肝病毒X基因，使其自ATG后第8位bp起缺失16個bp，即為mx基因，從而失去表達X蛋白的可能，降低致癌性。另由乙肝病毒Adr亞型北京株[17]S基因ATG起1-92bp替代了原S+S1基因[14]的ATG起1-92bp，此外，我們測序發(fā)現(xiàn)原S+S1結(jié)構(gòu)中第49位的亮氨酸和第112位的精氨酸實測分別為脯氨酸和甘氨酸。我們應(yīng)用pGJPSS1質(zhì)粒[16](上海生化所提供)和pSV2DHBr1-32質(zhì)粒[17]，經(jīng)過一系列的中間質(zhì)粒，最終構(gòu)建了pCHBSS1G質(zhì)粒，具體構(gòu)建過程見附圖1-4說明。
轉(zhuǎn)基因細胞系(Gdss1系)的構(gòu)建采用常規(guī)的磷酸鈣沉淀技術(shù)[12，13]將重組質(zhì)粒pCHBSS1G與pSV2dhfr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到約80％成片的細胞(CHO-dhfr-)瓶中，37℃培育8小時，倒掉轉(zhuǎn)化液換含10％小牛血清，無谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含有谷氨酸，天門冬酰胺)，2天后進行稀傳，此時培養(yǎng)液中含20um的MSX，以后每3天換液一次，直到出單克隆細胞，挑單細胞集落于96孔板，增殖后依次逐漸傳到24孔板及方瓶，在傳代過程中逐漸加大MSX及MTX量，最終以100uM MSX及10-7-10-6M MTX為最佳，分別篩出一系列高效分泌HBsAg陽性的克隆細胞系(GdSS1-X細胞系)，見圖5。
表達產(chǎn)物檢測HBsAg的反相血凝滴度為1∶256-1024；PreS1的酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)為1∶128；純品經(jīng)SDS-PAGE電泳顯出27KD蛋白條帶，同時可出現(xiàn)30KD的蛋白條帶；經(jīng)蛋白印跡試驗證明含PreS1融合蛋白條帶是特異特性的；電鏡觀察到22nm大小的顆粒；免疫小鼠后均可測出S及PreS1抗體，且Pres1抗體產(chǎn)生比S抗體產(chǎn)生早。
GdSS1-X細胞系經(jīng)液氮凍存近2年后再復(fù)蘇其HBsAg的分泌量不下降，表明其遺傳性穩(wěn)定。



圖1說明pSV2SS1質(zhì)粒的構(gòu)建方法用Xba I和EcoR I雙酶切pGJPSS1質(zhì)粒[16](上海生化所提供)和pSV2DHBr1-32質(zhì)粒[17]，分別回收0.65kb片段和2.74kb片段，用T4連接酶粘端連接，構(gòu)成pSV40SS1質(zhì)粒。再用Pvu II和EcoR I雙酶切該質(zhì)粒，回收1.1kb片段；用Bgl II酶切pSV2dhfr質(zhì)粒[18]，回收5.0kb片段，這兩個片段經(jīng)klenow酶補平后，用T4連接酶平端連接，構(gòu)成pSV2SS1質(zhì)粒。
圖2說明pCMV-HBr-1質(zhì)粒的構(gòu)建方法用Spoe I和Sph I雙酶切HCMV病毒序列，回收0.75kb的CMV IE en/pro(人巨細胞病毒立即早期增強子/啟動子)片段[19]。將此片段插入到3.0kb的商品化質(zhì)粒pBluescript SK(-)的多克隆位點中的Spe I和HindIII位點之間，用T4連接酶進行平-粘端連接，構(gòu)建成3.75kb的pBluescript-CMV質(zhì)粒。同時用Xho I和EcoR I雙酶切pSDHBr-1質(zhì)粒[20]，回收1.88kb的S基因片段，將此片段插入pBluescript-CMV質(zhì)粒的Sa1I切點處，構(gòu)成pCMV-HBr-1質(zhì)粒(5.6kb)。
圖3說明pGS12和pC2HBrSG質(zhì)粒的構(gòu)建方法首先將CHO-dhfr-細胞在含有MSX的情況下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)細胞內(nèi)源性GS基因的表達。待細胞成片后，提取胞漿中的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄方法合成出cDNA第一條鏈，再用PCR方法擴增，獲得1.12kb的全長GS基因(兩端均含有BamH I位點)。用BamH I進行酶切后，將GS基因插入商品化載體pUC18的BamH I位點處，從而獲得重組質(zhì)粒pGS12。
用BamH I酶切pGS12質(zhì)粒，回收1.12kb片段；用Hind III和Bgl II雙酶切pSV2dhfr質(zhì)粒[18]，回收4.2kb片段。這兩個片段經(jīng)klenow酶補平后，用T4連接酶平端連接，構(gòu)成pSV2-GS12質(zhì)粒(5.3kb)。
用Bgl II和Xba I雙酶切pCMV-HBr-1質(zhì)粒，回收2.6kb片段；用Pvu II酶切pSV2-GS12質(zhì)粒，這兩個片段經(jīng)klenow酶補平后，用T4連接酶平端連接，構(gòu)成pC2HBrSG質(zhì)粒(7.9kb)。圖4說明pCHBSS1G質(zhì)粒的構(gòu)建方法用XbaI，BamHI酶切pSV2SS1質(zhì)粒，回收4.5kb片段，XbaI，EcoRI酶切pGJPSS1質(zhì)?；厥?.65kb的片段，用PCR法制取乙肝表面抗原的EcoRI-BamHI的0.54kb的增強子I(EnI)。以上三個片段經(jīng)T4酶連接成PSV2SS1En1質(zhì)粒(5.7kb)。
質(zhì)粒PSDHBr-1[20]經(jīng)BamHI酶切回收BamHI-BamHI的1.4kb片段，此片段含增強子2即En2，將此片段插到pSV2SS1EnI質(zhì)粒的BamHI切點處，構(gòu)成pSV2SS1En1，2質(zhì)粒。
用XbaI酶切及BamHI不完全酶切pSV2SS1En1，2制取1.2kb的小片段，同樣XbaI及BamHI酶切PC2HBrSG質(zhì)粒，制取6.8kb的大片段。
上述片段用T4酶連接最終構(gòu)成pCHBSS1G(8.0kb)。
此結(jié)構(gòu)的特點是1.CMV立即早期啟動子調(diào)控乙肝表面抗原SS1融合基因在前，SV40早期啟動子調(diào)控GS擴增基因在后。2.在乙肝表面抗原SS1融合基因下游有增強子1(En1)、增強子2(En2)，它們均有提高啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強作用，同時使用缺失突變技術(shù)使X基因自ATG后第8位bp起缺失16個bp，從而失去表達X蛋白的可能。
我們將該微生物(株)于2004年1月18日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
地點北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號中國科學院微生物研究所。郵編100080生物分類名稱CHO細胞。
編號CGMCC No.1090
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權(quán)利要求
1.一種含有乙肝病毒adr亞型表面抗原S+S1融合基因的重組質(zhì)粒pCHBSS1G，此質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點是復(fù)制方向從左至右，其排列順序是PBR322的復(fù)制起點→CMV-1E的0.75kb的啟動子→乙肝表面抗原S+S1融合基因SS1→增強子EN1，En2及使用缺失突變使X基因自ATG后第8位bp起缺失16個bp，從而失去表達X基因的可能，降低致癌性→SV40的復(fù)制起點，早期啟動子→GS基因，此基因是從CHO-dhfr-細胞中經(jīng)PCR獲得的→SV40的多聚A位點；質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的乙肝表面抗原S+S1融合基因SS1在前，谷氨酰胺合成酶擴增基因GS在后，它們是分別在CMV立即早期啟動子及SV40早期啟動子的調(diào)控之下；乙肝表面抗原S+S1基因是前S1第21-47基因片段與S基因3’端的第223位相連的融合基因。
2.應(yīng)用權(quán)力要求1中的pCHBSS1G質(zhì)粒與pSV2dhfr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化CHO-dhfr-細胞獲得一系列的基因工程細胞系GdSS1-X，其特征是耐受MTX和MSX，能高效表達乙肝病毒表面抗原SS1融合蛋白。
專利摘要
在乙肝表面抗原PreS1(21－47)基因片段與S基因的第223位相連的基礎(chǔ)上，在其下游引入RNA加聚A信號AATAA、乙肝病毒增強子1(En1)和增強子2(En2)，及突變的x基因(mX)構(gòu)成pCHBSS1G質(zhì)粒。將pCHBSS1G質(zhì)粒與pSV2dhfr質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CHO－dhfr－細胞，經(jīng)克隆加MSX及MTX篩選擴增，獲得了高效表達乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的一系列基因工程細胞系(GdSS1－X)，SS1融合蛋白在SDS－PAGE中顯出27KD蛋白條帶，同時可出現(xiàn)30KD蛋白條帶，小鼠免疫可產(chǎn)生針對S和S1的特異性抗體。
文檔編號C12N15/62GKCN1796563SQ200410101382
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月21日
發(fā)明者田淑芳, 阮力, 劉文軍, 楊芙蓉, 宗芳, 李軍, 陳紅, 王文, 阮薇琴, 王秀平 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan