本發(fā)明涉及一株羅伊氏乳桿菌新菌株及其細胞外囊泡，還涉及該羅伊氏乳桿菌新菌株及其細胞外囊泡在制備免疫增強劑、疫苗免疫佐劑、增強機體免疫調(diào)節(jié)活性制劑中的用途；還涉及該羅伊氏乳桿菌新菌株在制備黏膜免疫疫苗或口服免疫疫苗中的用途。本發(fā)明屬于生物。

背景技術(shù)：

1、羅伊氏乳桿菌（ lactobacillus?reuteri）是乳桿菌屬的重要成員之一，已報道幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸菌，是最常見的一類益生菌，包括多種屬和種，如 lactobacillus?acidophilus、 lactobacillus?rhamnosus、 lactobacillus? casei等，廣泛存在于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵食品和人體腸道中。研究顯示，腸道菌群組成與人體健康存在極為密切的聯(lián)系，涉及到生長發(fā)育、代謝和免疫反應(yīng)等方面。無菌動物的研究進一步證實了腸道微生物及益生菌群在腸道消化酶活性、腸壁厚度、細胞因子生成和血清免疫球蛋白水平方面的重要性。因此，鑒于腸道微生物群及益生菌菌群的關(guān)鍵角色，益生菌及益生菌菌群被廣泛用于修復(fù)生態(tài)失衡和調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。益生菌，這些微小的活性生物體，不僅在維持人體健康的微生物生態(tài)平衡中扮演著關(guān)鍵角色，而且在預(yù)防和治療多種疾病方面顯示出了巨大的潛力。

2、羅伊氏乳桿菌是人和動物胃腸道中天然存在的乳桿菌之一，不僅具備乳酸菌主要的有益功效，而且還具備產(chǎn)生廣譜抗菌物質(zhì)的特效?？捎行б种颇芤种朴拈T螺旋桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特菌、弧菌、梭菌、葡萄球菌的生長。羅伊氏乳桿菌的名字來自德國微生物學(xué)家gerhardreuter，他在1960年代在人類腸道和糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了它。1960年代被發(fā)現(xiàn)時，羅伊氏乳桿菌自然存在于30-40%的人體內(nèi)，現(xiàn)在大約降至10-20%?？茖W(xué)研究者將這種下降與生活方式的改變聯(lián)系起來。我們不像以前那樣吃發(fā)酵食品，如酸菜，而是使用防腐劑，這會殺死食物和體內(nèi)的細菌。

3、羅伊氏乳桿菌是目前已報道的幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸菌。羅伊氏乳桿菌對腸黏膜具有很強的黏附能力，可改善腸道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患腸道疾病。羅伊氏乳桿菌能產(chǎn)生一種被稱為“羅伊氏菌素(reuterin)”的非蛋白質(zhì)類廣譜抗菌物質(zhì)，能廣泛抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母、真菌和病原蟲等的生長。羅伊氏乳桿菌益生菌制劑可改善人體機能，提高免疫力從而促進人體健康。我國于2003?年批準了羅伊氏乳桿菌可作為人類保健品的微生物菌種，且該菌已是國際上公認的新型益生乳酸菌，具有很高的理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用價值。對羅伊氏乳桿菌的研究早在?20世紀?80?年代就已開始，對其各種益生功能的研究至今仍在繼續(xù)，且新的研究成果層出不窮，使人們對羅伊氏乳桿菌的益生功能有了更全面的認識。

4、羅伊氏乳桿菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生葡聚糖和果聚糖。其中一種葡聚糖，a-1,4/1,6葡聚糖，分子量為40?mda，支化度約為16%，是一種飽腹感誘導(dǎo)劑，對胰島素和血糖水平有良好的影響。葡聚糖不會在胃和空腸中降解，而是在結(jié)腸中完全降解。由于其慢淀粉特性，這種葡聚糖可能是烘焙應(yīng)用中一種促進健康的成分。

5、羅伊氏乳桿菌對低ph?值和膽汁鹽具有抵抗力，能夠附著在粘蛋白和腸上皮細胞上，一些菌株可以附著在一系列脊椎動物宿主的腸上皮細胞上。粘附的一種可能機制是細菌表面分子與粘液層的結(jié)合。粘液結(jié)合蛋白(mub)?和?mub樣蛋白，由乳酸桿菌特定的直系同源蛋白編碼基因簇編碼，用作粘附介質(zhì)或所謂的粘附素。mub?在識別粘液成分和/或其促進聚集能力方面的菌株特異性作用，可以解釋為mub?對羅伊氏乳桿菌粘附的貢獻。益生菌可改善宿主微生態(tài)平衡，抑制病原菌生長，提高宿主免疫力和健康水平。

6、羅伊氏乳桿菌是目前已報道的幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸菌。羅伊氏乳桿菌對腸黏膜具有很強的黏附能力，可改善腸道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患腸道疾病。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種羅伊氏乳桿菌新菌株以及該菌株的用途。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供所述的羅伊氏乳桿菌新菌株外囊泡以及該外囊泡的用途。

3、為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

4、本發(fā)明以10株具有良好免疫調(diào)節(jié)性能的益生菌菌株為出發(fā)菌株，采用原生質(zhì)體融合育種技術(shù)構(gòu)建融合菌，并通過與j774?dual?（穩(wěn)定整合的報告基因的巨噬細胞系，該系攜帶兩個報告基因（堿性磷酸酶報告nf-κb和熒光素酶報告irf））相互作用后，在18個融合菌株中篩選了一株來源于羅伊乳桿菌和雙歧桿菌的融合菌株，經(jīng)鑒定其屬于羅伊氏乳桿菌（ lactobacillus?reuteri），命名為c186，分類命名為羅伊氏乳桿菌（ lactobacillus? reuteri），保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所，其微生物保藏號是cgmcc?no.?30337保藏日期為2024年4月15日。該菌株的微生物學(xué)特征是：①革蘭氏染色典型陽性，菌體為中等偏大，形態(tài)規(guī)則的方形桿狀；需氧或兼性厭氧菌，在固體和液體mrs培養(yǎng)基上生長良好；②具有耐酸特性，可在ph?4.0的mrs上生長良好；③具有耐膽鹽特性，可在含50%的雞膽汁mrs的培養(yǎng)液中存活并生長；④具有獨特的抗炎、抗感染特性；⑤該菌培養(yǎng)最適溫度為37℃，mrs培養(yǎng)基上菌落為乳白色，邊緣整齊，表面光滑濕潤，隆起，不透明的中等大小的菌落，有一種酸香的味道。

5、在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明首先提出了一株羅伊氏乳桿菌菌株，命名為c186，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所，其微生物保藏號是cgmcc?no.?30337，保藏日期為2024年4月15日。

6、進一步的，本發(fā)明還提出了所述的羅伊氏乳桿菌菌株在以下方面的用途：

7、（1）制備免疫佐劑或提高免疫力的制劑；

8、（2）制備抗炎和抗感染藥物制劑或制備調(diào)節(jié)動物腸道菌群或促進動物生長的藥物。

9、其中，優(yōu)選的，所述的免疫佐劑或免疫增強制劑具有提高黏膜免疫應(yīng)答和促進黏膜分泌特異性抗體的作用。

10、其次，本發(fā)明還提出了一種羅伊氏乳桿菌外囊泡，是從所述的羅伊氏乳桿菌菌株c186的培養(yǎng)液中提取得到。

11、其中，優(yōu)選的，所述的外囊泡通過以下方法制備得到：將所述的羅伊氏乳桿菌菌株c186的菌液按照1:100接種在液體mrs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48?h后，3000-3500?g，4℃離心10min，重復(fù)1-2次，保留上清；上清過0.45μm中空纖維篩，收集濾過液體，35000?g?4℃離心1h，保留上清；120000?g，4?℃離心1?h，去上清，用外囊泡保存液重懸沉淀，4℃暫存，-80℃保存。

12、其中，優(yōu)選的，所述的方法還包括對提取得到的外囊泡采用葡萄糖密度梯度離心法進行純化的步驟。

13、其中，優(yōu)選的，所述的葡萄糖密度梯度離心法所使用的葡萄糖的純度，按照質(zhì)量百分比計，從下到上依次是5?ml?60%葡萄糖溶液、10?ml?40%葡萄糖溶液、25?ml?30%葡萄糖溶液、10?ml?20%葡萄糖溶液、5?ml?5%葡萄糖溶液+5?ml?外囊泡溶液，100000?g離心18?h，取不同層的外囊泡溶液后用外囊泡保存液補齊60?ml?120000?g-130000?g離心1.5?h，去上清，沉淀用ph8.0的pbs重懸至300-500μl，即得。

14、進一步的，本發(fā)明還提出了所述的羅伊氏乳桿菌外囊泡在以下方面的用途：

15、（1）制備免疫佐劑或黏膜遞送載體；

16、（2）制備黏膜免疫制劑；

17、（3）制備免疫調(diào)節(jié)制劑；

18、（4）制備抗炎和抗感染藥物制劑或制備調(diào)節(jié)動物腸道菌群或促進動物生長的藥物。

19、其中，優(yōu)選的，所述的黏膜遞送載體用于遞送來自滅活細菌或滅活病毒的抗原全部組分或亞單位成分，所述的黏膜遞送載體可用于腸道免疫或口服免疫。

20、其中，優(yōu)選的，所述的黏膜免疫制劑為黏膜免疫疫苗。

21、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：

22、本發(fā)明以10株具有良好免疫調(diào)節(jié)性能的益生菌菌株為出發(fā)菌株，采用原生質(zhì)體融合育種技術(shù)構(gòu)建融合菌，并通過與j774?dual?相互作用后，在18個融合菌株中篩選了一株來源于羅伊乳桿菌和雙歧桿菌的融合菌株，經(jīng)鑒定其屬于羅伊氏乳桿菌，命名為c186。研究表明，該菌株具有強免疫增強活性的優(yōu)良免疫調(diào)節(jié)特性，同時還具有耐酸、耐膽鹽等特性，而且該菌株可以產(chǎn)生具有很強免疫佐劑活性和免疫增強活性的細胞外囊泡，僅滴鼻點眼該菌株外囊泡186-bevs可直接激活雞哈氏腺淋巴細胞和氣管上皮內(nèi)淋巴細胞，顯著增強黏膜免疫應(yīng)答。將本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌菌株c186或其外囊泡作為添加劑添加于飼料和藥物中，能夠提高飼料和藥物增強機體免疫應(yīng)答及保健的作用，有抗炎作用又有抗感染作用的天然益生菌c186株有望作為各種急性炎癥的輔助性治療制劑，186-bevs也有望作為天然遞送載體用于研發(fā)新型口服疫苗和黏膜遞送疫苗。