本發(fā)明涉及一株植物乳桿菌菌株及其細(xì)胞外囊泡，還涉及該植物乳桿菌菌株在抗炎和抗感染制劑中的用途、該植物乳桿菌新菌株及其細(xì)胞外囊泡在制備免疫增強(qiáng)劑或疫苗免疫佐劑中的用途、在增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)活性制劑中的用途以及在制備黏膜免疫疫苗或口服免疫疫苗中的用途。本發(fā)明屬于生物。

背景技術(shù)：

1、植物乳桿菌（ lactobacillus?plantarum）屬于乳桿菌屬，是一種革蘭氏陽性菌。它廣泛存在于自然界，如土壤、植物表面、人和畜禽腸道中，在人類和動物的口腔、腸道等黏膜環(huán)境中的乳酸菌，是構(gòu)成正常微生物菌群或腸道菌群的重要成員。植物乳桿菌存在于人體胃腸道中，對人體健康具有很大的促進(jìn)作用。植物乳桿菌在食品、飼料與醫(yī)藥工業(yè)中，它們經(jīng)常被添加用來幫助發(fā)酵食品或拮抗致病微生物繁殖，維持腸道健康，防治疾病的發(fā)生，其使用價值日益受到廣泛重視。

2、植物乳桿菌也屬于化能異養(yǎng)型微生物，缺少對多種化合物的合成能力，需從外界獲取生長代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、氨基酸、生長因子和礦物質(zhì)等。植物乳桿菌最適生長溫度為15～35℃，有的適合在4℃至15℃繁殖生長，植物乳桿菌為直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀，最適ph?6.0左右。植物乳桿菌能在低ph值或低溫環(huán)境中生長，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制有害菌生長等益生作用。

3、植物乳桿菌具有多種功能，首先是可以調(diào)節(jié)腸道微生物群落平衡，植物乳桿菌能夠產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙酸等，抑制有害菌的生長，促進(jìn)有益菌的繁殖，從而維持腸道微生物群落的平衡。其次是增強(qiáng)免疫力，植物乳桿菌能夠刺激免疫細(xì)胞的活性，提高機(jī)體的免疫力，預(yù)防疾病。還具有抗氧化作用，植物乳桿菌能夠清除體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用，延緩衰老；還可以降低膽固醇，植物乳桿菌能夠降低血液中的膽固醇水平，預(yù)防心血管疾?。痪哂薪堤亲饔?，例如植物乳桿菌?ss18-5就在高脂肪和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型中被發(fā)現(xiàn)口服給藥可控制體重，降低空腹血糖、糖化血紅蛋白和胰島素水平，并增加肝糖原水平。糖尿病患者通常表現(xiàn)出低度的慢性炎癥，并伴有高水平的循環(huán)促炎細(xì)胞因子。scs2等多株植物乳桿菌被發(fā)現(xiàn)可以通過降低?t2dm?小鼠?mda?和?ros?水平，增加抗氧化酶水平，表現(xiàn)出良好的降血糖和胰島素調(diào)節(jié)作用。

4、植物乳桿菌引起的免疫調(diào)節(jié)深受研究者的關(guān)注。研究表明，植物乳桿菌能通過細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分提高黏膜表面和血清中?iga、igg?和?igm?水平，增強(qiáng)體液免疫；促進(jìn)t?淋巴細(xì)胞和?b?淋巴細(xì)胞的增殖，加強(qiáng)細(xì)胞免疫；增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞(?單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)?的活力，刺激活性氧、溶酶體酶和單核因子的分泌，加強(qiáng)非特異性免疫反應(yīng)。據(jù)報道從發(fā)酵食品中分離的 l.plantaruml-37(hk-lp)是一株在小鼠體內(nèi)、外對il-12具有強(qiáng)誘導(dǎo)作用的菌株。飼喂hk-lp可抑制ige的產(chǎn)生，抵抗小鼠因自然飲食引起的食物過敏，還可抑制腫瘤增長以及腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)移植。hk-lp已被證實(shí)能夠通過誘導(dǎo)il-12的產(chǎn)生，形成th1型免疫反應(yīng)。臨床實(shí)驗(yàn)表明，每日攝取hk-lp可增強(qiáng)健康成人的獲得性免疫，尤其是與th1相關(guān)的免疫功能。dong?等發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌?ncimb?8826?能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞、t?細(xì)胞、t?細(xì)胞亞群以及?nk?細(xì)胞的活性，同時使?il-1β、il-6、il-10、tnf-α?等細(xì)胞因子的活性也有不同程度地提升。植物乳桿菌所起的免疫調(diào)節(jié)作用與其菌本身和代謝產(chǎn)物有關(guān)，甚至死的菌體也有免疫調(diào)節(jié)作用。就目前所知，可起免疫調(diào)節(jié)作用的乳酸菌種類很多，如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌等。

5、植物乳桿菌對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌有抑制作用。它通過與病原菌對限制性營養(yǎng)素的能力競爭，來抑制病原菌的生長，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的組成，形成生物學(xué)屏障，并通過其代謝所產(chǎn)生的乳酸、細(xì)菌素以及雙乙酰等物質(zhì)對其他細(xì)菌的作用，調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢組合通過拮抗致病菌的生長及其毒素的粘附阻止其侵入和定植。maragkoudakisa等對乳制品中29株乳桿菌的益生特性在體外進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有菌株都有不同程度的膽鹽水解活性，絕大多數(shù)菌株對萬古霉素和替考拉寧有耐受性，而對四環(huán)素、氯霉素敏感。其中， l.plantarumaca-dc?146能夠抑制大腸桿菌和沙門氏菌對caco-2細(xì)胞的黏附，并能夠誘導(dǎo)人體外圍血單核細(xì)胞中某些細(xì)胞因子的分泌。anukam等從尼日利亞健康女性陰道中分離得到了具有益生特性的植物乳桿菌，其中有6份樣品中的植物乳桿菌能夠產(chǎn)生大量的生物表面活性劑，同時其產(chǎn)生的h2o2對腸道和陰道致病菌具有抑制作用。

6、對于植物乳桿菌全基因組序列的測定，以及結(jié)合功能基因組學(xué)研究，有助于我們?nèi)?、系統(tǒng)地了解植物乳桿菌基因組的結(jié)構(gòu)和組成?？v觀植物乳桿菌全基因組的基本信息，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌具有以下特點(diǎn)：(1)全基因組的長度在?2.9~3.7?mb?之間，是乳酸菌中基因組最大的種類；(2)g?+?c：百分含量通常為45%?左右，而雙歧桿菌gc%含量高達(dá)?60%?左右，唾液乳桿菌?gc%?含量則低至?33%?左右。而植物乳桿菌與其他種類乳桿菌的重要差異在于已報道的植物乳桿菌基因組中，均有不編碼細(xì)胞壁的蛋白酶存在。

7、綜上所述，植物乳桿菌對動物體有著特殊的生理作用，并且在食品、飼料及醫(yī)療保健領(lǐng)域中將占主導(dǎo)地位。隨著科學(xué)的發(fā)展，研究的不斷深入，人類對植物乳桿菌生理功能的研究發(fā)現(xiàn)在不斷增多，使用乳桿菌菌株的范圍也在不斷擴(kuò)大，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷增多。在其眾多應(yīng)用領(lǐng)域中需解決的問題還有：益生乳桿菌的安全性問題；乳桿菌活菌制劑在加工、運(yùn)輸過程中的失活問題；乳酸菌對低ph的胃酸、膽汁酸及胰液的耐受問題，以確保有足夠數(shù)量的活菌到達(dá)腸道而發(fā)揮作用；在具體的應(yīng)用領(lǐng)域選擇適當(dāng)?shù)木N并確定其添加量。待進(jìn)一步研究的領(lǐng)域還有：確立載體對益生乳桿菌的影響；通過對菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高其性能和活性，并通過臨床試驗(yàn)確定菌株的生理學(xué)功能、作用機(jī)理及其產(chǎn)生的影響程度；評價益生乳桿菌對免疫系統(tǒng)、癌癥和腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)功能；評價益生乳桿菌在腸道內(nèi)的基因表達(dá)方式以及對腸道微生物的數(shù)量和活性的影響；合理利用各種乳酸菌代謝產(chǎn)物，評價其具體作用及用在何處等等。其中任何領(lǐng)域都值得深入研究，開發(fā)應(yīng)用前景不可估量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種植物乳桿菌新菌株及其外囊泡c9bevs在抗炎及抗感染中的用途；在制備天然免疫佐劑活性或免疫增強(qiáng)劑的用途；在制備優(yōu)良黏膜免疫制劑中的用途；在制備具有優(yōu)良免疫調(diào)節(jié)特性制劑中的用途；特別的是在制備天然高效黏膜遞送載體中的用途。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

3、本發(fā)明菌株分離自中國黑龍江省大興安嶺原始森林野生健康野豬的盲腸粘膜上，經(jīng)mrs接種培養(yǎng)、純化后獲得的一株植物乳桿菌菌株，經(jīng)鑒定其屬于植物乳桿菌，命名為c9，分類命名為植物乳桿菌（ lactobacillus?plantarum），保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所，其微生物保藏號是cgmcc?no.30435保藏日期為2024年4月25日。該菌株為植物乳桿菌c9株，是從健康野生豬腸道粘膜上分離的天然菌株，不會危及人類健康，也不是動、植物病原，更不會污染環(huán)境；動物長期飼喂結(jié)果表明，可顯著增加采食量，動物無任何可見及解剖等不良變化，動物健康活潑；體外實(shí)驗(yàn)表明，該菌株具有較強(qiáng)的抗致病菌的作用；并且該菌株發(fā)酵液具有明顯的抗菌活性（抗沙門菌、大腸桿菌等致病菌）和較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。該菌株的微生物學(xué)特征是：①革蘭氏染色典型陽性，菌體為中等偏大，形態(tài)規(guī)則的桿菌；需氧或兼性厭氧菌，在固體和液體mrs培養(yǎng)基上生長良好；②具有耐酸特性，可在ph?4.0的mrs上生長良好；③具有耐膽鹽特性，可在含50%的雞膽汁mrs的培養(yǎng)液中存活并生長；④具有獨(dú)特的抗炎、抗感染特性；⑤該菌培養(yǎng)最適溫度為37℃，可在4℃生長，mrs培養(yǎng)基上菌落為乳白色，邊緣整齊，表面光滑濕潤，隆起，不透明的中等大小的菌落，有一種酸香的味道。

4、在上述研究的基礎(chǔ)上，首先，本發(fā)明提出了一株植物乳桿菌菌株，命名為 c9，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所，其微生物保藏號是cgmcc?no.30435，保藏日期為2024年4月25日。

5、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的植物乳桿菌菌株在以下方面的用途：

6、（1）在制備高效天然免疫佐劑或免疫增強(qiáng)制劑中的用途；

7、（2）在制備保健型或增強(qiáng)免疫力型飼料添加劑中的用途；

8、（3）在制備黏膜免疫疫苗中的用途；

9、（4）在制備抗感染以及抗炎癥制劑中的用途。

10、其中，優(yōu)選的，所述的植物乳桿菌菌株具有增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答和促進(jìn)黏膜分泌特異性抗體的作用。

11、其次，本發(fā)明還提出了一種植物乳桿菌外囊泡，所述的植物乳桿菌外囊泡是所述的植物乳桿菌菌株 c9的培養(yǎng)液中提取得到。

12、其中，優(yōu)選的，所述的植物乳桿菌外囊泡是通過以下方法提取得到：

13、（1）?接種：按照植物乳桿菌菌株 c9菌液與mrs培養(yǎng)基體積比為1：100的比例，接種mrs培養(yǎng)基，37℃活化培養(yǎng)8h，之后按照體積比1：100接種mrs培養(yǎng)基，37℃，繼續(xù)培養(yǎng)16h；

14、（2）向每1l培養(yǎng)液中加入10%?w/v?nahco3溶液10ml、20%w/v葡萄糖溶液25ml，同時加入5mg/ml的半胱氨酸鹽酸鹽溶液2ml，繼續(xù)培養(yǎng)至40h時，收獲培養(yǎng)液；

15、（3）收獲的培養(yǎng)基使用離心桶，3000g/min，10分鐘，獲得上清液；

16、（4）?上清液依次使用0.45μm濾膜、中控纖維切向流750kd過濾，獲得濾液；

17、（5）?濾液35000g/min離心1h，然后120000g/min離心1h；

18、（6）?棄上清，pbs重懸下部沉淀，即獲得植物乳桿菌c9株的細(xì)胞外囊泡，命名為c9bevs。

19、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的植物乳桿菌外囊泡在以下方面的用途：

20、（1）在制備高效天然免疫佐劑或免疫增強(qiáng)制劑中的用途；

21、（2）在制備保健型或增強(qiáng)免疫力型飼料添加劑中的用途；

22、（3）在制備黏膜免疫疫苗中的用途；

23、（4）在制備抗感染以及抗炎癥制劑中的用途。

24、其中，優(yōu)選的，所述的植物乳桿菌外囊泡具有增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答和促進(jìn)黏膜分泌特異性抗體的作用。

25、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：

26、本發(fā)明公開了一株植物乳桿菌新菌株及其用途。所述的植物乳桿菌新菌株，命名為c9，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號是cgmccno.?30435。研究表明該菌株具有獨(dú)特的抗炎和抗感染雙重特性，同時還具有耐酸、耐膽鹽等特性。特別的，該菌株可以產(chǎn)生具有很強(qiáng)免疫佐劑活性和免疫增強(qiáng)活性的細(xì)胞外囊泡c9bevs，僅滴鼻點(diǎn)眼該菌株外囊泡c9bevs可直接激活雞黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，顯著增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答；特別的，該菌株外囊泡c9bevs可直接作為滅活病毒或抗原的高效佐劑黏膜遞送載體，可以通過黏膜免疫的方式實(shí)現(xiàn)滅活疫苗或抗原的的黏膜免疫系統(tǒng)高效遞送，利用該菌株外囊泡c9bevs，可以獲取新型滅活疫苗或亞單位抗原的黏膜疫苗。本發(fā)明公開的一株植物乳桿菌新菌株c9株及其外囊泡可用于飼料和藥物的添加劑，添加于飼料或藥物中，實(shí)現(xiàn)其增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答及保健的作用，并有望作為天然遞送載體對開展新型口服疫苗和黏膜遞送疫苗提供重要工具。