本發(fā)明涉及低聚半乳糖制備，特別是涉及一種利用固定化生物酶制備低聚半乳糖的制備方法。

背景技術(shù)：

1、低聚半乳糖是一種重要的功能性糖，其分子由2～10?個(gè)半乳糖基和1個(gè)葡萄糖基組成，半乳糖基之間以β-（1，3）、β-（1，4）和β-（1，6）等鍵相連結(jié)，以β-（1，4）鍵為主，而半乳糖與葡萄糖之間以β-（1，4）連接。

2、現(xiàn)有技術(shù)中常見(jiàn)的低聚半乳糖的制備方法多使用酶法合成低聚半乳糖，以牛乳中的乳糖為底物，通過(guò)β-半乳糖苷酶催化合成，但是酶法合成的gos產(chǎn)物為混合物，包含例如葡萄糖、半乳糖和乳糖等物質(zhì)，需要通過(guò)之后配合分離純化得到低聚半乳糖，一般低聚半乳糖的純度為85.03％，二次上柱可以達(dá)到89.39％。

3、授權(quán)公告號(hào)為cn111978423b的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種高純度低聚半乳糖的制備方法，采用六床式順式模擬移動(dòng)床色譜分離技術(shù)，采用鈉型大孔陽(yáng)離子樹(shù)脂，相對(duì)于鈣型陽(yáng)離子樹(shù)脂對(duì)低聚半乳糖的分離效果更好，能實(shí)現(xiàn)葡萄糖、乳糖、半乳糖和低聚半乳糖的精細(xì)分離，得到98%以上高純度低聚半乳糖產(chǎn)品。可見(jiàn)現(xiàn)有技術(shù)中多針對(duì)低聚半乳糖的分離提純，關(guān)于酶的分離和回收以及重復(fù)使用也是亟需解決的問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種低聚半乳糖的制備方法，本發(fā)明以果膠鈣凝膠顆粒為芯通過(guò)將殼聚糖聚集在凝膠顆粒表面并進(jìn)一步吸附和交聯(lián)β-半乳糖苷酶，配合在反應(yīng)過(guò)程中的液體循環(huán)，有效提升低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率。

2、為解決此技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種低聚半乳糖的制備方法，?包括以下步驟：

3、s1、以乳糖溶液為原料泵入反應(yīng)罐，反應(yīng)罐中沿著罐體的軸向通過(guò)n層篩網(wǎng)逐層分隔得到的n-1個(gè)隔層裝載由果膠鈣凝膠-殼聚糖固定化的β-半乳糖苷酶，其中n為≥3的整數(shù)；

4、其中作為載體的果膠鈣凝膠-殼聚糖的組成方式如下：

5、殼聚糖通過(guò)靜電吸附組裝在果膠鈣凝膠顆粒表面，β-半乳糖苷酶交聯(lián)于殼聚糖；

6、投入經(jīng)固定的β-半乳糖苷酶的質(zhì)量與乳糖溶液的體積比為18mg至25mg/1l；

7、s2、循環(huán)的溫度為45℃至52℃，循環(huán)時(shí)間為10小時(shí)至14小時(shí)；

8、乳糖溶液流經(jīng)果膠鈣凝膠-殼聚糖的表面與β-半乳糖苷酶接觸反應(yīng)；

9、s3、將反應(yīng)液泵出，使用連續(xù)化模擬移動(dòng)床技術(shù)分離得到低聚半乳糖，分離乳糖回收繼續(xù)反應(yīng)。

10、優(yōu)選，由果膠鈣凝膠-殼聚糖固定化的β-半乳糖苷酶的制備方法，包括以下步驟：

11、s11、將果膠鈣凝膠微米顆粒置于殼聚糖溶液中，殼聚糖溶液ph為4.0至4.5，攪拌，殼聚糖富集在果膠鈣凝膠顆粒表面形成聚電解質(zhì)復(fù)合物；

12、s12、向體系中添加β-半乳糖苷酶，通過(guò)殼聚糖吸附β-半乳糖苷酶；

13、s13、將s12所得的果膠鈣凝膠-殼聚糖吸附的β-半乳糖苷酶置于戊二醛水溶液中交聯(lián)，得果膠鈣凝膠-殼聚糖固化的β-半乳糖苷酶。本發(fā)明以果膠鈣凝膠顆粒作為用于負(fù)載殼聚糖的芯結(jié)構(gòu)，且后續(xù)配合戊二醛交聯(lián)殼聚糖和β-半乳糖苷酶，其中戊二醛交聯(lián)包括分布在果膠鈣凝膠顆粒表面的殼聚糖，殼聚糖作為載體的殼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定果膠鈣凝膠顆粒的結(jié)構(gòu)；在低聚半乳糖的生產(chǎn)過(guò)程中，由于果膠高凝膠顆粒中水的不流動(dòng)性，乳糖溶液從果膠鈣凝膠-殼聚糖的表面處流過(guò)，從而保證乳糖溶液與β-半乳糖苷酶的接觸，且本發(fā)明利用乳糖的流動(dòng)，流經(jīng)載體堆疊形成具有三維結(jié)構(gòu)的空間流道即流經(jīng)了載體表面，提升乳糖與酶的接觸，本發(fā)明所得載體可以反復(fù)多次使用，并保持較為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率。

14、優(yōu)選通過(guò)吸水溶脹為果膠鈣凝膠微米顆粒的果膠鈣凝膠與殼聚糖的質(zhì)量比為（1.1至1.3）：1。本發(fā)明利用果膠鈣凝膠顆粒有效實(shí)現(xiàn)對(duì)殼聚糖的負(fù)載，并通過(guò)殼聚糖提升果膠鈣凝膠顆粒的穩(wěn)定性。

15、優(yōu)選β-半乳糖苷酶與殼聚糖的質(zhì)量比為(0.8mg至1.0mg):1g。本發(fā)明將β-半乳糖苷酶分布在三維流道內(nèi)，配合乳糖溶液的流動(dòng)保證乳糖與酶的充分接觸。

16、優(yōu)選步驟s12中通過(guò)殼聚糖吸附β-半乳糖苷酶的工藝條件如下：

17、10℃-15℃，200r/min-280r/min搖床振蕩吸附，振蕩時(shí)間為3小時(shí)至5小時(shí)。

18、優(yōu)選果膠鈣凝膠微米顆粒的制備方法包括以下步驟：

19、s111、使用去離子水配置低酯果膠和葡萄糖混合液，調(diào)節(jié)混合液的ph為3.0；

20、s112、將s111所得混合液置于沸水中加熱；

21、s113、向經(jīng)s112加熱的混合液中加入氯化鈣,迅速攪拌均勻；將所得混合液置于3℃至5℃環(huán)境中冷卻放置得果膠鈣凝膠；

22、s114、果膠鈣凝膠冷凍干燥，粉碎，過(guò)篩250目至300目；

23、s115、將s114所得果膠鈣粉末置于酸溶液中溶脹得果膠鈣凝膠微米顆粒。

24、優(yōu)選步驟s115果膠鈣凝膠顆粒吸水溶脹為果膠鈣凝膠微米顆粒包括以下步驟：

25、a1、在4℃條件下，將步驟s114干燥得到的果膠鈣凝膠顆粒投入吡咯單體水溶液中浸泡4小時(shí)至8小時(shí)，使吡咯單體均勻滲透于果膠鈣凝膠顆粒；

26、a2、將步驟a1得到的水凝膠浸泡在0.089mol/l硝酸鐵水溶液中，吡咯單體交聯(lián)為聚吡咯。本發(fā)明通過(guò)將吡咯單體通過(guò)浸潤(rùn)的方式滲透到凝膠顆粒內(nèi)部，伴隨著水分的分散均勻分布，硝酸鐵作為引發(fā)劑引發(fā)吡咯可以自身聚合成聚吡咯從而通過(guò)聚吡咯形成對(duì)果膠鈣凝膠顆粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；且由于吡咯是隨著水連續(xù)滲透的，因此聚吡咯有效貫穿凝膠顆粒，穩(wěn)定凝膠顆粒結(jié)構(gòu)；隨后將凝膠顆粒投入至殼聚糖溶液中，殼聚糖靜電吸附在凝膠顆粒表面，再利用戊二醛實(shí)現(xiàn)殼聚糖和殼聚糖以及殼聚糖和酶之間的交聯(lián)，獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的用于酶固定的載體。

27、優(yōu)選步驟s2中液體循環(huán)泵以50ml/min至80ml/min的流速循環(huán)反應(yīng)液。

28、優(yōu)選所述篩網(wǎng)為100目至200目的鋼絲網(wǎng)。本發(fā)明利用鋼絲網(wǎng)配合載體的顆粒形態(tài)進(jìn)一步有效分散乳糖溶液的分散，溶液通過(guò)鋼絲網(wǎng)小孔流速瞬間增加，與載體的相互作用力較大，更容易接觸酶。

29、進(jìn)一步改進(jìn)，每一篩網(wǎng)螺紋連接于反應(yīng)罐內(nèi)壁。本發(fā)明的篩網(wǎng)可拆卸鏈接于反應(yīng)罐內(nèi)壁，方便固定化酶的投入。

30、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

31、本發(fā)明以果膠鈣凝膠顆粒為芯通過(guò)將殼聚糖聚集在凝膠顆粒表面并進(jìn)一步吸附和交聯(lián)β-半乳糖苷酶，配合在反應(yīng)過(guò)程中的液體循環(huán)，有效提升低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率；在乳糖的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，反應(yīng)罐中沿著罐體的軸向通過(guò)n層篩網(wǎng)逐層分隔得到的n-1個(gè)隔層裝載由果膠鈣凝膠-殼聚糖固定化的β-半乳糖苷酶，防止大量的果膠鈣凝膠-殼聚糖堆疊保證乳糖溶液沿著酶的分布流動(dòng)，利于反應(yīng)物和產(chǎn)物的傳質(zhì)；本發(fā)明中用于固定β-半乳糖苷酶的載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物相容性好，可以重復(fù)使用；通過(guò)篩網(wǎng)的配合，反應(yīng)溶液的循環(huán)流動(dòng)過(guò)程中形成微區(qū)間的流速變化，提升低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化效率。

技術(shù)特征：

1.一種低聚半乳糖的制備方法，其特征在于：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述篩網(wǎng)為100目至200目的鋼絲網(wǎng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于：每一篩網(wǎng)螺紋連接于反應(yīng)罐內(nèi)壁。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種低聚半乳糖的制備方法，包括以下步驟：S1、以乳糖溶液為原料，隔層裝載由果膠鈣凝膠?殼聚糖固定化的β?半乳糖苷酶，其中作為載體的果膠鈣凝膠?殼聚糖的組成方式如下：殼聚糖通過(guò)靜電吸附組裝在果膠鈣凝膠顆粒表面，β?半乳糖苷酶交聯(lián)于殼聚糖；S2、循環(huán)；乳糖溶液流經(jīng)果膠鈣凝膠?殼聚糖的表面與β?半乳糖苷酶接觸反應(yīng)；S3、將反應(yīng)液泵出，使用連續(xù)化模擬移動(dòng)床技術(shù)分離得到低聚半乳糖，分離乳糖回收繼續(xù)反應(yīng)；本發(fā)明以果膠鈣凝膠顆粒為芯通過(guò)將殼聚糖聚集在凝膠顆粒表面并進(jìn)一步吸附和交聯(lián)β?半乳糖苷酶，配合在反應(yīng)過(guò)程中的液體循環(huán)，有效提升低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率。

技術(shù)研發(fā)人員：黃強(qiáng),陳曼萍,朱嘯峰,周坤宇,倪益金,陳達(dá)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江晟格生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6