本發(fā)明屬于多糖提取純化，涉及山楂籽中多糖的提取、純化方法。

背景技術(shù)：

1、山楂屬于薔薇科蘋(píng)果亞科山楂屬，是薔薇科中的一種重要植物，也是我國(guó)的特產(chǎn)果樹(shù)。山楂因風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥食兩用而著稱。我國(guó)山楂制品主要有山楂糕、果丹皮等山楂果膠類食品，山楂罐頭、山楂蜜餞等山楂整果制品以及山楂酒、山楂飲料等。山楂加工副產(chǎn)品主要包括山楂籽和山楂渣。山楂籽為山楂的種子，占山楂總重的1/3?，F(xiàn)在初步研究，山楂籽中成分與果肉差不多，山楂籽中還富含豐富的活性物質(zhì)黃酮，是開(kāi)發(fā)黃酮的優(yōu)質(zhì)資源。雖然山楂籽的開(kāi)發(fā)利用越來(lái)越收到青睞，但未有對(duì)山楂籽中成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，尤其是山楂籽中多糖成分，未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的在于提供一種山楂籽中多糖的提取、純化方法，該方法制備的多糖收率和純度較高，具有較好的抗氧化活性。

2、本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：

3、山楂籽中多糖的提取、純化方法，主要包括以下步驟：

4、步驟a，將山楂籽粉碎，過(guò)篩，得山楂籽粉末，加入β-谷甾醇混勻后，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-12%的h2o2溶液中浸泡1.5-2h，后去離子水洗滌，在90-100℃條件下加熱40-60min，冷卻至室溫，干燥，得初料備用；

5、步驟b，調(diào)整初料含水量至40-50%，調(diào)節(jié)ph至7.0-7.2，接種木蹄層孔菌菌液，在25-30℃條件下發(fā)酵1.5-2天；發(fā)酵完成后，在90-100℃條件下加熱20-30min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)ph至6.0-6.5，接種巴斯德畢赤酵母菌液，在25-30℃條件下再次發(fā)酵1-1.5天，再次發(fā)酵完成后，再次置于90-100℃條件下加熱20-30min，冷卻至室溫，得發(fā)酵物備用；

6、步驟c，將發(fā)酵物按照1:（8-10）kg/l的料液比與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-12%乙醇溶液混合后，在60-65℃條件下回流提取，冷卻至室溫，加入吸附劑0.08-0.1kg/l，靜置6-8h，離心，上清液備用；

7、步驟d，調(diào)整上清液ph至5.0-5.5，加入10-12g/l甘露聚糖酶、6-8g/lβ-葡聚糖酶混勻，在35-40℃條件下酶解3-4h，加熱至70-80℃滅酶，冷卻至室溫，采用乙醇溶液依次調(diào)整酶解液中乙醇體積分?jǐn)?shù)至10%、30%、50%、70%，每調(diào)整一次，靜置30-40min，離心，得沉淀備用；

8、步驟e，將沉淀加水溶解后，sephadex?g型葡聚糖凝膠上樣，以甲醇-水混合溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，截留分子量為2×106~5×107da的洗脫液，合并洗脫液，去除甲醇，干燥，即得目標(biāo)山楂籽多糖。

9、作為優(yōu)選的方式，上述步驟a中，β-谷甾醇的加入量為山楂籽粉末質(zhì)量10-15%。

10、作為優(yōu)選的方式，上述步驟b中，木蹄層孔菌菌液中菌落數(shù)為8×107個(gè)/ml，巴斯德畢赤酵母菌液中菌落數(shù)為3×107個(gè)/ml。

11、作為優(yōu)選的方式，上述步驟b中木蹄層孔菌種子液的接種量為初料質(zhì)量的3-5%，巴斯德畢赤酵母種子液的接種量為初料質(zhì)量的8-10%。

12、作為優(yōu)選的方式，上述步驟c中吸附劑為改性啤酒糟微球。

13、本發(fā)明提供改性啤酒糟微球的制備方法，具體包括以下步驟：

14、步驟1，將啤酒糟干燥后，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30-40%的磷酸溶液中浸泡6-8h，過(guò)濾，干燥；置于400-500℃的無(wú)氧環(huán)境中煅燒1-1.5h，冷卻至室溫，得初產(chǎn)物備用；

15、步驟2，將初產(chǎn)物置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-12%的高錳酸鉀溶液中浸泡2-4h，過(guò)濾，干燥；加入牡蠣殼粉混勻后，置于700-800℃無(wú)氧環(huán)境中煅燒2.5-3h，冷卻至室溫，去離子水洗滌至中性，干燥，得次產(chǎn)物備用；

16、步驟3，將次產(chǎn)物、丁二酸酐、fecl3、聚甲基丙烯酸乙酯加入到熔融狀態(tài)的殼聚糖中，置于磁力攪拌器上攪拌1-1.5h，得混合液；在攪拌狀態(tài)下，向混合液中滴加2mol/l的naoh溶液，靜置6-8h后，去離子水洗滌，即得改性啤酒糟微球。

17、進(jìn)一步的，上述步驟2中，初產(chǎn)物、牡蠣殼粉的質(zhì)量比為1:(0.3-0.5)。

18、進(jìn)一步的，上述步驟3中，次產(chǎn)物、丁二酸酐、fecl3、聚甲基丙烯酸乙酯、殼聚糖的質(zhì)量比為1:(0.08-0.12):(0.1-0.15):(0.2-0.3):(1.5-1.8)。

19、進(jìn)一步的，上述步驟3中，naoh溶液的加入量為混合液體積的8-10倍。

20、作為優(yōu)選的方式，上述步驟e中甲醇-水混合溶液中甲醇、水的體積比為(0.1-0.12):1。

21、本發(fā)明具有以下有益效果：

22、本發(fā)明中所制備的山楂籽多糖的純度較高，且具有較好的抗氧化效果；山楂籽中木質(zhì)素成分較多，在制備過(guò)程中，將山楂籽采用雙氧水浸泡及高溫加熱的方式改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，對(duì)山楂籽進(jìn)行活化，為避免高溫對(duì)多糖成分的影響，加入了β-谷甾醇作為穩(wěn)定劑；經(jīng)初步活化的山楂籽采用木蹄層孔菌發(fā)酵、高溫加熱方式進(jìn)一步改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，再利用酵母發(fā)酵、高溫加熱方式，更進(jìn)一步對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行改性，使其提高溶解性以及經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵作用，將木質(zhì)素分解為單糖；經(jīng)過(guò)改性后的山楂籽在進(jìn)行回流提取時(shí)，能夠顯著提高多糖的提取率；在經(jīng)過(guò)提取后，提取液中成分較為復(fù)雜，存在多糖、黃酮、蛋白質(zhì)等多種成分，加入本發(fā)明制備的吸附劑后，可以有效的去除雜質(zhì)。在吸附劑的制備過(guò)程中，采用啤酒糟進(jìn)行高溫煅燒，形成生物炭，在其煅燒過(guò)程中，加入牡蠣殼粉，利用牡蠣殼粉煅燒產(chǎn)生二氧化碳?xì)怏w，對(duì)啤酒糟的孔隙進(jìn)行刻蝕，能夠得到小孔徑且豐富孔徑的生物炭，在與其他成分制備成微球，可以有效吸附蛋白質(zhì)等成分，且不影響多糖，能夠降低非期望吸附的發(fā)生，有效除雜；得到的山楂籽粗多糖經(jīng)過(guò)酶解后利用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行純化，得到目標(biāo)山楂籽多糖，在經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，其具有較高的抗氧化活性。

技術(shù)特征：

1.山楂籽中多糖的提取、純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，β-谷甾醇的加入量為山楂籽粉末質(zhì)量10-15%。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，木蹄層孔菌菌液中菌落數(shù)為8×107個(gè)/ml，巴斯德畢赤酵母菌液中菌落數(shù)為3×107個(gè)/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟b中木蹄層孔菌種子液的接種量為初料質(zhì)量的3-5%，巴斯德畢赤酵母種子液的接種量為初料質(zhì)量的8-10%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c中吸附劑為改性啤酒糟微球。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述改性啤酒糟微球的制備方法包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟2中，初產(chǎn)物、牡蠣殼粉的質(zhì)量比為1:(0.3-0.5)。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中，次產(chǎn)物、丁二酸酐、fecl3、聚甲基丙烯酸乙酯、殼聚糖的質(zhì)量比為1:(0.08-0.12):(0.1-0.15):(0.2-0.3):(1.5-1.8)。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中，naoh溶液的加入量為混合液體積的8-10倍。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟e中甲醇-水混合溶液中甲醇、水的體積比為(0.1-0.12):1。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及山楂籽中多糖的提取、純化方法，屬于多糖提取純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述方法中包括微生物發(fā)酵、酶解、吸附劑除雜后醇沉得到粗多糖，后經(jīng)凝膠柱分離、純化后得到目標(biāo)山楂籽多糖。利用本發(fā)明方法制備得到的山楂籽多糖具有較高的收率，且純度較高，得到的山楂籽多糖具有較好的抗氧化作用。

技術(shù)研發(fā)人員：張文娜,張曉艷,劉玉珊,孫杰,張寶運(yùn)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)山東（臨沂）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2