本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵，具體涉及一種紅法夫酵母發(fā)酵合成蝦青素的方法。

背景技術(shù)：

1、蝦青素，化學(xué)名稱為3,?3'-二羥基-4,?4'-二酮基-β,?β'-胡蘿卜素，分子式為c40h52o4，是一種強(qiáng)效的含氧類胡蘿卜素，具有極高的抗氧化能力，其抗氧化效果遠(yuǎn)優(yōu)于β-胡蘿卜素和維生素e。其分子結(jié)構(gòu)中的共軛雙鍵鏈及其末端的不飽和酮基和羥基使其具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能夠清除自由基、阻斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和抑制脂質(zhì)過氧化，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。除了抗衰老和提高免疫力外，蝦青素還具有防治腫瘤、心血管疾病和糖尿病的潛力。由于化學(xué)法合成蝦青素不僅可能殘留有害物質(zhì)的安全隱患，還存在價(jià)格昂貴的問題，目前主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素，如雨生紅球藻和紅法夫酵母等。

2、紅法夫酵母因具有生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)條件要求簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，其發(fā)酵已成為生產(chǎn)蝦青素的重要途徑。紅法夫酵母在利用葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后可轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵代謝中間體乙酰輔酶a，通過甲羥戊酸途徑合成異戊二烯焦磷酸，接著在異戊烯二磷酸異構(gòu)酶的作用下生成法尼基焦磷酸，再進(jìn)一步縮合生成香葉基香葉基焦磷酸，接著縮合生成八氫番茄紅素，八氫番茄紅素再經(jīng)過脫氫和環(huán)化生成β-胡蘿卜素，再經(jīng)過β-羥化酶作用生成終產(chǎn)物蝦青素。

3、然而，紅法夫酵母發(fā)酵合成蝦青素仍存在碳氮源利用率低、生物量低等技術(shù)問題，嚴(yán)重限制了紅法夫酵母合成蝦青素的產(chǎn)量水平。目前，研究人員已經(jīng)通過誘變育種、基因工程改造等手段獲得了產(chǎn)蝦青素能力更強(qiáng)的發(fā)酵菌株。然而，針對(duì)微生物菌株發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過程控制方面的研究，尤其是發(fā)酵過程控制，仍具有較大的提升空間。

4、通常，微生物的生長(zhǎng)增殖條件與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成條件存在差異，例如：發(fā)酵溫度、碳氮源比例等。此外，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成階段因受高密度的微生物細(xì)胞以及其代謝途徑中關(guān)鍵酶活性的影響，從而限制底物的傳輸效率以及蝦青素的轉(zhuǎn)化得率。精準(zhǔn)控制發(fā)酵產(chǎn)蝦青素條件以及提升底物的傳輸效率與轉(zhuǎn)化得率，將有助于增加紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的產(chǎn)量。

5、深度共熔溶劑是一類由兩種或多種組分以特定比例通過氫鍵相互作用形成的液體，具有較低的熔點(diǎn)。它們常被用作綠色溶劑替代傳統(tǒng)溶劑用于生物催化轉(zhuǎn)化，增加底物的溶解度，從而增強(qiáng)底物的傳質(zhì)效率以及目標(biāo)產(chǎn)物合成代謝流，提高生物催化轉(zhuǎn)化效率以及產(chǎn)率。

6、但關(guān)于深度共熔溶劑在蝦青素發(fā)酵中的應(yīng)用和相關(guān)效果還未可知。因此，本技術(shù)通過結(jié)合變溫發(fā)酵以及含深度共熔溶劑的補(bǔ)料發(fā)酵作為提升紅法夫酵母合成蝦青素產(chǎn)量的重要技術(shù)手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的是提供一種提高紅法夫酵母發(fā)酵合成蝦青素產(chǎn)量的方法，旨在解決現(xiàn)有發(fā)酵技術(shù)中存在紅法夫酵母合成蝦青素產(chǎn)量低的問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種提高紅法夫酵母發(fā)酵合成蝦青素產(chǎn)量的方法，該方法包括：結(jié)合變溫發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵方法利用紅法夫酵母高效生產(chǎn)蝦青素，其中，變溫發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，包括精準(zhǔn)控制發(fā)酵體系溫度和補(bǔ)加含深度共熔溶劑的碳氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，深度共熔溶劑可以增加酵母細(xì)胞膜的通透性、酶活力和激發(fā)酵母細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，促使?fàn)I養(yǎng)成分進(jìn)入細(xì)胞和增強(qiáng)蝦青素合成途徑代謝流以提高紅法夫酵母蝦青素的產(chǎn)量；具體地，所述紅法夫酵母發(fā)酵合成蝦青素的方法如下：

3、紅法夫酵母種子液按5-8%（v/v）接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行第一階段的發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為25-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速100-200?rpm，第一階段發(fā)酵時(shí)間為36-60h；在完成第一階段的36-60h發(fā)酵后進(jìn)行第二階段的變溫和分批補(bǔ)料發(fā)酵，其中：溫度調(diào)整為15-20℃，其余條件不變，進(jìn)入第二階段開始進(jìn)行一次補(bǔ)料，之后每隔12h補(bǔ)料一次，每次補(bǔ)料體積為初始培養(yǎng)基的50%（v/v），共補(bǔ)料3次；

4、進(jìn)一步地，發(fā)酵全過程中用氨水控制ph為5.0-6.5，發(fā)酵罐通氣量控制為50-200ml/min，溶解氧控制為20-60%；

5、進(jìn)一步地，所述補(bǔ)料采用的補(bǔ)料培養(yǎng)基為含深度共熔溶劑的碳氮源培養(yǎng)基，按照g/l濃度計(jì)，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基包括：甘油60-150?g/l、酵母粉30-60?g/l、深度共熔溶劑a?15-30?g/l，深度共熔溶劑b?15-30?g/l，其余為水，ph?6.0-6.5；

6、所述深度共熔溶劑a由氯化膽堿和尿素組成，氯化膽堿和尿素摩爾比為1：2；所述深度共熔溶劑b由氯化膽堿和檸檬酸組成，氯化膽堿和檸檬酸摩爾比為1：1；

7、進(jìn)一步地，按照g/l濃度計(jì)，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括：麥芽糖10-50?g/l、甘油20-50?g/l、酵母粉10-20?g/l、大豆蛋白胨5-10?g/l、磷酸二氫鉀1-3?g/l、磷酸氫二鉀1-3g/l、七水硫酸鎂1-2?g/l、氯化鈣0.2-0.5?g/l、生物素0.5-1?g/l，其余為水，ph?6.0-6.5；

8、進(jìn)一步地，發(fā)酵體系中的發(fā)酵溫度通過發(fā)酵罐控溫夾套控制；

9、進(jìn)一步地，經(jīng)過上述發(fā)酵，紅法夫酵母生物量為143.4-178.5g/l，蝦青素產(chǎn)量為667.2-725.8mg/l。

10、進(jìn)一步地，將紅法夫酵母從保藏的斜面培養(yǎng)基中接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200-400?rpm，培養(yǎng)時(shí)間為48-60h，培養(yǎng)基ph?6.0-6.5，獲得一級(jí)種子液。

11、進(jìn)一步地，將一級(jí)種子液按0.5-1.0%（v/v）接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200-400?rpm，培養(yǎng)時(shí)間為48-60h，培養(yǎng)基ph?6.0-6.5，獲得二級(jí)種子液。

12、優(yōu)選地，所述紅法夫酵母為紅法夫酵母（ phaffia?rhodozyma）ncupfr001，保藏編號(hào)為cgmcc?no.31951。

13、本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案，是深度共熔溶劑在提高紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量中的應(yīng)用；

14、進(jìn)一步地，是在增加微生物細(xì)胞膜的通透性中的應(yīng)用；

15、進(jìn)一步地，是在調(diào)節(jié)蝦青素代謝合成關(guān)鍵酶的活性以及引起胞內(nèi)酸堿失衡中的應(yīng)用，更進(jìn)一步地，所述關(guān)鍵酶包括但不限于乙酰輔酶a，異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶，β-羥化酶；

16、進(jìn)一步地，所述深度共熔溶劑包括深度共熔溶劑a和深度共熔溶劑b；所述深度共熔溶劑a由氯化膽堿和尿素組成，氯化膽堿和尿素摩爾比為1：2；所述深度共熔溶劑b由氯化膽堿和檸檬酸組成，氯化膽堿和檸檬酸摩爾比為1：1。

17、通過實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明具有的有益效果有：

18、本發(fā)明根據(jù)紅法夫酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)條件與蝦青素合成條件的最適條件不同，采用了變溫和補(bǔ)料分批培養(yǎng)策略，通過在補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加復(fù)合深度共熔溶劑，使得紅法夫酵母在產(chǎn)蝦青素階段因深度共融溶液的作用，一方面增加微生物細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)胞外底物輸送至胞內(nèi)發(fā)酵代謝利用，另一方面深度共熔溶劑還可以進(jìn)入胞內(nèi)調(diào)節(jié)蝦青素代謝合成關(guān)鍵酶的活性以及引起胞內(nèi)酸堿失衡，促使紅法夫酵母合成蝦青素的代謝流增強(qiáng)，從而有效增加紅法夫酵母生物量和其胞內(nèi)蝦青素產(chǎn)量。