本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種可遞送核酸藥物的靶向性外泌體及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、核酸類(lèi)藥物，又稱(chēng)為核苷酸類(lèi)藥物，是各種具有不同功能的寡聚核糖核酸（rna）與寡聚脫氧核糖核酸（dna）的總稱(chēng)。這類(lèi)藥物能夠直接作用于靶基點(diǎn)或靶基因，在基因水平上發(fā)揮治療作用，尤其在基因治療中展現(xiàn)出較好的療效。然而，核酸類(lèi)藥物在臨床應(yīng)用中也面臨一些挑戰(zhàn)，如體內(nèi)穩(wěn)定性差、容易被核酸酶降解、難以跨越體內(nèi)屏障、靶向性弱等問(wèn)題。為了克服這些障礙，研究人員正在不斷探索核酸類(lèi)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和遞送載體的優(yōu)化，以提高藥物的穩(wěn)定性和靶向性，降低免疫原性，從而實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。

2、外泌體（exosome）是一類(lèi)由細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，直徑通常在30-150納米之間。它們攜帶著豐富的生物信息分子，包括蛋白質(zhì)、核酸（如mrna）和脂質(zhì)等，能夠在細(xì)胞間傳遞信息。外泌體具有良好的生物相容性和低免疫原性，這使得它們成為遞送核酸類(lèi)藥物的理想載體。

3、外泌體對(duì)核酸類(lèi)分子的裝載方式一般分為預(yù)裝載法和后裝載法兩種。其中，預(yù)裝載法是指在細(xì)胞自然分泌外泌體的過(guò)程中，將核酸類(lèi)分子封裝到外泌體中。這可以通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)的生物合成途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，如通過(guò)基因工程手段調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的mrna合成和分泌過(guò)程。而后裝載法是在外泌體分泌后，通過(guò)物理或化學(xué)方法將核酸分子裝載到外泌體中。這通常需要利用特定的試劑或技術(shù)來(lái)打開(kāi)外泌體的膜結(jié)構(gòu)，使核酸分子能夠進(jìn)入其內(nèi)部。

4、后加載法裝載核酸分子到外泌體中雖然具有一定的可行性，但在技術(shù)、效率、穩(wěn)定性、生物相容性、生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、成本和臨床應(yīng)用等方面仍存在諸多局限性。而預(yù)加載法具有自然高效、提高裝載效率、減少技術(shù)挑戰(zhàn)、更好的生物相容性和穩(wěn)定性以及潛在的廣泛應(yīng)用等好處。這些優(yōu)勢(shì)使得預(yù)加載法成為當(dāng)前外泌體遞送mrna領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

5、目前，通過(guò)預(yù)裝載法制備裝載有核酸分子的外泌體的成功案例較少，相關(guān)技術(shù)還不夠成熟，核酸分子裝載到外泌體中的效率依然有提升的空間；并且，這些裝載有核酸分子的外泌體并不具備靶向到特定細(xì)胞的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)外泌體進(jìn)行工程化修飾，在保證核酸分子高效裝載到外泌體中的同時(shí)，賦予外泌體靶向到特定靶細(xì)胞、組織、器官的能力；由此本發(fā)明提供了工程化修飾的外泌體，并提供制備靶向性外泌體遞送核酸類(lèi)藥物的方法。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種可裝載核酸分子并具有靶向性的外泌體，包含融合多肽，所述融合多肽包括靶向性蛋白分子、外泌體跨膜蛋白、核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述外泌體能夠通過(guò)所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而裝載核酸分子。

3、可選地，所述核酸分子為治療劑或預(yù)防劑，包括核酸類(lèi)藥物；所述外泌體內(nèi)裝載有所述核酸類(lèi)藥物。

4、可選地，所述核酸分子包括質(zhì)粒dna、shrna、sirna、mirna、mrna、grna、pri-mirna、pre-mirna、環(huán)狀rna、pirna、trna、rrna、snrna或lncrna中的一種或多種的組合。

5、可選地，所述靶向性蛋白分子為抗cd3單鏈抗體anti-cd3?scfv，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述外泌體跨膜蛋白為cd63截?cái)嗟鞍住?3?cd63，其氨基酸序列如seqid?no.2所示；所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閜uf，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

6、可選地，所述靶向性蛋白分子包括靶向肽、單克隆抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體或雙特異性t細(xì)胞接合器中的一種或多種的組合。

7、可選地，所述外泌體跨膜蛋白包括cd63截?cái)嗟鞍住?3?cd63或△103?cd63，其氨基酸序列分別如seq?id?no.2和seq?id?no.4所示。

8、可選地，所述外泌體跨膜蛋白包括cd9、cd63、cd81、flot1、flot2、notch1、notch2、tspan2、tspan8、lamb1、lamb2、ptgfrn、pdgfr、cd47、vsv-g、marcks、basp1、tcra、tcrb、tcrd、tcrg、annexin膜聯(lián)蛋白、cytokeratin細(xì)胞角蛋白、egfr或tgfβ受體及其變體。

9、本發(fā)明的第二方面，提供上述的外泌體的融合多肽表達(dá)載體，包括外泌體跨膜蛋白信號(hào)肽、標(biāo)簽分子、靶向性蛋白分子、連接肽、外泌體跨膜蛋白以及核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

10、可選地，所述外泌體跨膜蛋白信號(hào)肽的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，標(biāo)簽分子的氨基酸序列seq?id?no.6所示，連接肽的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

11、本發(fā)明的第三方面，提供上述的外泌體的制備方法，包括：（1）將構(gòu)建的外泌體融合多肽表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到生產(chǎn)細(xì)胞中，得到工程化修飾的生產(chǎn)細(xì)胞；（2）對(duì)工程化修飾的生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)及富集篩選；（3）從篩選的生產(chǎn)細(xì)胞中收集、純化，從而獲得工程化修飾的外泌體。

12、本發(fā)明的第四方面，提供預(yù)裝載核酸類(lèi)藥物的靶向性外泌體的制備方法，包括以下步驟：（1）設(shè)計(jì)與基因合成能夠表達(dá)所述融合多肽的序列，將所述序列構(gòu)建到帶有嘌呤霉素抗性的慢病毒表達(dá)載體中，得到第一重組表達(dá)載體；

13、（2）設(shè)計(jì)與基因合成帶有蛋白結(jié)合位點(diǎn)的核酸分子，構(gòu)建到帶有潮霉素抗性的慢病毒表達(dá)載體中，得到第二重組表達(dá)載體；

14、（3）將步驟（1）得到的第一重組表達(dá)載體和步驟（2）得到的第二重組表達(dá)載體分別進(jìn)行慢病毒包裝，獲得第一慢病毒和第二慢病毒；

15、（4）將步驟（3）得到的第一慢病毒和第二慢病毒同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，抗生素篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株；

16、（5）將步驟（4）獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集獲得外泌體；即獲得所述的具有靶向性并且裝載核酸分子或核酸類(lèi)藥物的外泌體。

17、本發(fā)明成功構(gòu)建了能夠靶向遞送核酸分子的外泌體；通過(guò)對(duì)外泌體進(jìn)行工程化修飾，在保證核酸分子高效裝載到外泌體的同時(shí)，賦予外泌體靶向到特定靶細(xì)胞、組織、器官的能力。通過(guò)靶向遞送核酸分子，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞或組織的精準(zhǔn)治療，提高藥物的生物利用度和靶向性，從而增加治療效果。相比傳統(tǒng)的全身給藥方式，靶向遞送可以顯著減少藥物在非靶標(biāo)組織中的積累，降低毒性和副作用。本發(fā)明還對(duì)外泌體跨膜蛋白進(jìn)行優(yōu)化與改進(jìn)，通過(guò)對(duì)外泌體跨膜蛋白進(jìn)行截?cái)喾治?，有效縮短了外泌體跨膜蛋白的大小，提高了外泌體裝載靶向蛋白、核酸分子的裝載效率。

技術(shù)特征：

1.一種外泌體，包含融合多肽，其特征在于，所述融合多肽包括靶向性蛋白分子、外泌體跨膜蛋白及核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述外泌體能夠通過(guò)所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而裝載核酸分子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體，其特征在于，所述核酸分子為治療劑或預(yù)防劑，包括核酸類(lèi)藥物；所述外泌體內(nèi)裝載有所述核酸類(lèi)藥物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體，其特征在于，所述核酸分子包括質(zhì)粒dna、shrna、sirna、mirna、mrna、grna、pri-mirna、pre-mirna、環(huán)狀rna、pirna、trna、rrna、snrna或lncrna中的一種或多種的組合。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體，其特征在于，所述靶向性蛋白分子為抗cd3單鏈抗體anti-cd3?scfv，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述外泌體跨膜蛋白為cd63截?cái)嗟鞍住?3?cd63，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閜uf，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體，其特征在于，所述靶向性蛋白分子包括靶向肽、單克隆抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體或雙特異性t細(xì)胞接合器中的一種或多種的組合。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體，其特征在于，所述外泌體跨膜蛋白包括cd63截?cái)嗟鞍住?3?cd63或△103?cd63，其氨基酸序列分別如seq?id?no.2和seq?id?no.4所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體，其特征在于，所述外泌體跨膜蛋白包括cd9、cd63、cd81、flot1、flot2、notch1、notch2、tspan2、tspan8、lamb1、lamb2、ptgfrn、pdgfr、cd47、vsv-g、marcks、basp1、tcra、tcrb、tcrd、tcrg、annexin膜聯(lián)蛋白、cytokeratin細(xì)胞角蛋白、egfr或tgfβ受體及其變體。

8.權(quán)利要求1-7任一所述的外泌體的融合多肽表達(dá)載體，其特征在于，所述融合多肽表達(dá)載體包括外泌體跨膜蛋白信號(hào)肽、標(biāo)簽分子、靶向性蛋白分子、連接肽、外泌體跨膜蛋白以及核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合多肽表達(dá)載體，其特征在于，所述外泌體跨膜蛋白信號(hào)肽的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，標(biāo)簽分子的氨基酸序列seq?id?no.6所示，連接肽的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

10.權(quán)利要求1-7任一所述的外泌體的制備方法，其特征在于，包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供一種可遞送核酸類(lèi)藥物的靶向性外泌體及其制備方法。本發(fā)明的外泌體包含融合多肽，所述融合多肽包括靶向性蛋白分子、外泌體跨膜蛋白、核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述外泌體能夠通過(guò)所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而裝載核酸分子。本發(fā)明通過(guò)對(duì)外泌體進(jìn)行工程化修飾，在保證核酸分子高效裝載到外泌體中的同時(shí)，賦予外泌體靶向到特定靶細(xì)胞、組織、器官的能力。

技術(shù)研發(fā)人員：莊寶程,吳庭鶴,李國(guó)坤,黃蓉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京科恩里斯生物醫(yī)藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30