本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)，尤其涉及一種持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法及其應用。

背景技術(shù)：

1、細胞因子誘導的殺傷細胞(cik)是人外周血單個核細胞(pbmc)經(jīng)體外誘導培養(yǎng)得到的以cd3+細胞、cd56+細胞為主的效應細胞群，能夠表現(xiàn)出t淋巴細胞的抗腫瘤活性和nk細胞的非mhc限制性殺瘤活性，具有增殖速度快、殺傷活性高、殺瘤譜廣和副作用小等特點。樹突狀細胞(dc)是一種具有強大抗原呈遞功能的特殊細胞，能夠高效攝取、加工和呈遞抗原，從而激活初始t淋巴細胞，引發(fā)針對腫瘤細胞的特異性免疫應答。

2、dc-cik細胞是將腫瘤抗原誘導成熟的dc細胞與cik細胞共培養(yǎng)得到的細胞群，研究發(fā)現(xiàn)，將dc細胞與cik細胞共培養(yǎng)既可以促進dc細胞成熟，又能夠增強cik細胞的細胞毒t細胞含量，從而發(fā)揮對腫瘤細胞的特異性殺傷作用，有效清除患者體內(nèi)殘留病灶，并在患者體內(nèi)誘發(fā)免疫記憶以維持持久的抗瘤效應。

3、然而，現(xiàn)有的dc-cik細胞共培養(yǎng)方法中，dc細胞生存期較短，而cik細胞的培養(yǎng)時間較長，使得dc細胞和cik細胞的培養(yǎng)時間不同步，并且cik細胞的培養(yǎng)環(huán)境不利于dc細胞的增殖和生長，因此培養(yǎng)得到的dc-cik細胞中有效細胞含量過少、殺傷活性較低，無法長時間維持dc-cik細胞的腫瘤殺傷活性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法及其應用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中dc-cik細胞的有效細胞含量少、腫瘤殺傷活性不足和有效性維持時間短的問題。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以無血清培養(yǎng)基為溶劑，包括如下濃度的組分：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子150～270μg/l、重組人白細胞介素-121.2～2.8μg/l、重組人腫瘤壞死因子-α65～105μg/l、重組人干擾素-γ1200～1500iu/ml、l-半胱氨酸180～360μmol/l、谷胱甘肽80～200μmol/l、人參多糖12～20mg/l、硫酸鏈霉素25～75mg/l。

4、優(yōu)選的，所述無血清培養(yǎng)基包括x-vivo15培養(yǎng)基和gt-t551?h3培養(yǎng)基；

5、所述x-vivo15培養(yǎng)基和gt-t551?h3培養(yǎng)基的體積比為1:2～5。

6、本發(fā)明還提供了所述的培養(yǎng)基在培養(yǎng)持久型dc-cik細胞中的應用。

7、本發(fā)明還提供了一種持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

8、(1)將dc細胞和cik細胞接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～36h，得到細胞液；

9、(2)向步驟(1)所述的細胞液中加入重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，培養(yǎng)10～15d，得到持久型dc-cik細胞；

10、步驟(1)所述的培養(yǎng)基為所述的持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基。

11、優(yōu)選的，步驟(1)所述dc細胞在培養(yǎng)基中的接種量為2.0×103～5.0×103個/ml；

12、所述cik細胞在培養(yǎng)基中的接種量為2.0×105～5.0×105個/ml。

13、優(yōu)選的，步驟(2)中加入的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和細胞液的質(zhì)量體積比為7～12mg:1l。

14、優(yōu)選的，步驟(1)～(2)所述培養(yǎng)的溫度為35～38℃，所述培養(yǎng)的co2濃度為4％～8％。

15、本發(fā)明還提供了所述的培養(yǎng)方法在培養(yǎng)持久型dc-cik細胞中的應用。

16、本發(fā)明還提供了所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的持久型dc-cik細胞。

17、本發(fā)明還提供了所述的持久型dc-cik細胞在制備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。

18、本發(fā)明具有如下技術(shù)效果和優(yōu)點：

19、本發(fā)明制備的持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基中，將x-vivo15培養(yǎng)基和gt-t551?h3培養(yǎng)基混合得到無血清培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分的種類和含量更高，更有利于dc-cik細胞的培養(yǎng)；重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子能夠促進dc細胞存活，增強細胞的抗原呈遞功能；重組人白細胞介素-12能夠誘導細胞分泌gm-csf、ifn-γ、tnf-α等細胞因子，啟動cik細胞培養(yǎng)、促進cik細胞增殖，同時有助于提高cik細胞的毒性作用；重組人腫瘤壞死因子-α能夠促使未成熟的dc細胞分化為成熟的dc細胞，同時顯著增強細胞的抗原呈遞能力；重組人干擾素-γ能夠促進cik細胞成熟，增強細胞的抗原呈遞功能，同時介導th1型免疫應答；l-半胱氨酸能夠刺激和促進dc-cik細胞的增殖和生長；谷胱甘肽能夠保護dc-cik細胞免受氧化應激的損害，維持正常的腫瘤殺傷功能；人參多糖能夠顯著增強和維持dc-cik細胞的腫瘤殺傷功能。本發(fā)明制備的持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基能夠進行dc細胞和cik細胞共培養(yǎng)，同時可以促進dc-cik細胞的增殖生長，長期維持dc-cik細胞很高的腫瘤殺傷活性；

20、本發(fā)明的持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比培養(yǎng)步驟簡單、培養(yǎng)時間較短，并且能夠提高dc-cik細胞中具有腫瘤殺傷活性的nkt細胞和ctl細胞的比例。

技術(shù)特征：

1.一種持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以無血清培養(yǎng)基為溶劑，包括如下濃度的組分：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子150～270μg/l、重組人白細胞介素-121.2～2.8μg/l、重組人腫瘤壞死因子-α65～105μg/l、重組人干擾素-γ1200～1500iu/ml、l-半胱氨酸180～360μmol/l、谷胱甘肽80～200μmol/l、人參多糖12～20mg/l、硫酸鏈霉素25～75mg/l。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基包括x-vivo15培養(yǎng)基和gt-t551?h3培養(yǎng)基；

3.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基在培養(yǎng)持久型dc-cik細胞中的應用。

4.一種持久型dc-cik細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)所述dc細胞在培養(yǎng)基中的接種量為2.0×103～5.0×103個/ml；

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中加入的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和細胞液的質(zhì)量體積比為7～12mg:1l。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)～(2)所述培養(yǎng)的溫度為35～38℃，所述培養(yǎng)的co2濃度為4％～8％。

8.權(quán)利要求4～7任一項所述的培養(yǎng)方法在培養(yǎng)持久型dc-cik細胞中的應用。

9.權(quán)利要求4～7任一項所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的持久型dc-cik細胞。

10.權(quán)利要求9所述的持久型dc-cik細胞在制備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種持久型DC?CIK細胞的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法及其應用，屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領域。本發(fā)明提供了一種持久型DC?CIK細胞的培養(yǎng)基，以無血清培養(yǎng)基為溶劑，包括重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素?12、重組人腫瘤壞死因子?α、重組人干擾素?γ、L?半胱氨酸、谷胱甘肽、人參多糖和硫酸鏈霉素。本發(fā)明的持久型DC?CIK細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法能夠促進DC?CIK細胞的增殖生長，長期維持DC?CIK細胞很高的腫瘤殺傷活性。

技術(shù)研發(fā)人員：謝院榮,韓文浩,李卓衡,陳熾鋒
受保護的技術(shù)使用者：廣東壹加再生醫(yī)學研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30