本發(fā)明涉及蛋白分離制備，具體地說，涉及一種制備牛血清白蛋白的方法。

背景技術(shù)：

1、牛血清白蛋白（bovineserum?albumin,?bsa）是一種在牛血漿中發(fā)現(xiàn)的主要蛋白質(zhì)，與人類血清白蛋白（humanserum?albumin,hsa）具有高度的結(jié)構(gòu)同源性。bsa由約583個(gè)氨基酸殘基組成，分子量大約為66.43?kda，具有心形的三維結(jié)構(gòu)，包含三個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（i、ii和iii），每個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分為兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域a和b。這種蛋白質(zhì)在生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中扮演著重要角色，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、藥物遞送、酶固定化、生物傳感器以及作為食品添加劑等。

2、bsa在維持血液滲透壓、ph緩沖、藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的載體功能以及參與多種代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于其豐富的氨基酸殘基和特定的結(jié)合位點(diǎn)，bsa能夠與多種化合物，包括脂肪酸、金屬離子、藥物分子等發(fā)生相互作用。此外，bsa在臨床診斷和生物制藥領(lǐng)域中也有重要應(yīng)用，例如作為免疫化學(xué)檢測的標(biāo)準(zhǔn)蛋白、用于疫苗生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分，以及作為藥物遞送系統(tǒng)中的納米粒子基質(zhì)。

3、目前所有的bsa制備工藝的原料都為牛血或牛血清，生產(chǎn)成本較高、來源限制較大。而生牛乳或乳清中同樣含有bsa，若可以它們?yōu)樵线M(jìn)行bsa的制備，可極大地降低生產(chǎn)成本和原料來源的難度，但相比牛血或牛血清，生牛乳或乳清的物質(zhì)環(huán)境更為復(fù)雜，不利于bsa的分離。使用生牛乳或乳清為原料制備bsa的方案未見報(bào)道。

4、目前bsa分離主要使用兩種制備方法——沉淀法和分子層析法，但它們存在明顯問題，沉淀法破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致bsa活性降低，分子層析法制備成本極高且無法解決制備過程中原料受熱的問題，制備過程中蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)被不同程度破壞。

5、具體地，bsa目前的制備方法包括：

6、1.硫酸銨鹽析法：其是一種傳統(tǒng)的bsa分離方法，通過硫酸銨的加入使蛋白質(zhì)沉淀，但這種方法存在生產(chǎn)過程繁瑣，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或變性的問題。

7、2.冷乙醇沉淀法：利用乙醇作為沉淀劑，通過降低溫度促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀。盡管這種方法在人血清白蛋白生產(chǎn)中較為常見，但在bsa制備中存在純度不高和可能引起蛋白質(zhì)變性的風(fēng)險(xiǎn)。

8、3.peg沉淀法：聚乙二醇（peg）作為一種非離子型聚合物，通過增加溶液的粘度促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀。然而，peg的去除較為困難，可能在bsa溶液中留下殘留。

9、4.色譜法：包括疏水層析、分子篩層析和離子交換層析等技術(shù)，通過不同的物理或化學(xué)特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。色譜法可以有效地提高bsa的純度，但在去除熱原或外源病毒和其他潛在污染物方面仍存在局限，而這對(duì)于bsa在臨床應(yīng)用中的安全性至關(guān)重要。

10、此外，硫酸銨鹽析法和冷乙醇沉淀法還可能導(dǎo)致bsa中含有小分子物質(zhì)殘留，如氯化鈉、硫酸銨、氨基酸等，這些殘留物可能影響bsa的生物活性和應(yīng)用效果。peg沉淀法雖然避免了蛋白質(zhì)聚集或變性，但其在工業(yè)生產(chǎn)中的去除問題限制了其應(yīng)用范圍，peg殘留可能影響bsa的安全性。

11、因此，有必要對(duì)bsa的分離制備方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種可從牛乳或乳清中有效分離出高純度bsa的方法。

2、本發(fā)明提供了一種制備牛血清白蛋白的方法，以牛乳或牛乳清為原料進(jìn)行牛血清白蛋白的制備，具體包括：

3、（1）制備乳清蛋白溶液：

4、當(dāng)所述原料為牛乳時(shí)，先將所述原料制備為牛乳清，之后以檸檬酸在ph值3.0-3.4下進(jìn)行酸化，之后進(jìn)行老化，使雜蛋白充分沉淀，獲得老化后的乳清蛋白溶液；

5、當(dāng)所述原料為牛乳清時(shí)，直接以檸檬酸在ph值3.0-3.4下進(jìn)行酸化，之后進(jìn)行老化，使雜蛋白充分沉淀，獲得老化后的乳清蛋白溶液；

6、（2）將所述乳清蛋白溶液進(jìn)行微濾，微濾膜的孔徑為0.1-0.4?微米，以透過液作為第一料液；

7、（3）調(diào)整所述第一料液的ph值為6.7-7.0后，采用超濾膜將ph值調(diào)整后的第一料液以水進(jìn)行滲濾處理，以滲濾后的截留液作為第二料液，所述第二料液的蛋白質(zhì)濃度為4%-7%，電導(dǎo)率小于250μs/cm；所述超濾膜的孔徑為3000-10000da；

8、（4）將所述第二料液以等電聚焦-自由流電泳進(jìn)行分離，收集分離出的牛血清白蛋白；所述等電聚焦-自由流電泳中，電泳溶液包括所述第二料液和兩性電解質(zhì)體系，所述兩性電解質(zhì)體系為甘氨酸-鹽酸。

9、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，牛乳或乳清中同樣含有bsa，且來源簡單易獲取，價(jià)格便宜成本低，產(chǎn)量大，來源廣，是更加穩(wěn)定的原料來源，若可將它們作為原料進(jìn)行bsa的制備，可極大地降低生產(chǎn)成本，但相比牛血或牛血清，生牛乳或乳清的物質(zhì)環(huán)境更為復(fù)雜，其中的多種組分均會(huì)影響bsa的分離，采用傳統(tǒng)沉淀法和分子層析法均不利于高純度、高活性bsa的獲得。

10、經(jīng)研究后，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ffe-ief（free?flow?electrophoresis?isoelectricfocusing）等電聚焦自由流電泳結(jié)合了等電聚焦（ief）和自由流電泳（ffe）的優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)、多肽或其他帶電生物分子的高分辨率分離。在ffe-ief技術(shù)中，樣品首先在無凝膠的電泳槽中通過等電聚焦進(jìn)行預(yù)處理，使得分子根據(jù)其等電點(diǎn)（pi）聚集在特定的ph區(qū)域。隨后，這些分子在電場的作用下沿著電泳槽流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)按電荷和大小的進(jìn)一步分離。ffe-ief技術(shù)的關(guān)鍵特點(diǎn)包括其無凝膠的分離環(huán)境，這不僅避免了樣品與凝膠基質(zhì)的非特異性相互作用，還提供了更為溫和的分離條件，特別適合于對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象和活性敏感的分析。此外，ffe-ief具有連續(xù)流動(dòng)的特性，允許對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的分析，從而提高了分離過程的通量和效率。該技術(shù)還具備高度的可定制性，通過調(diào)整電場強(qiáng)度、ph梯度和電泳時(shí)間等參數(shù)，可以針對(duì)不同的樣品特性進(jìn)行優(yōu)化。因此，ffe-ief技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)從更復(fù)雜的牛乳/乳清環(huán)境中分離出高純度bsa的效果。

11、但本發(fā)明進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然ffe-ief技術(shù)在蛋白質(zhì)分離時(shí)有較好的優(yōu)勢，但牛乳/乳清環(huán)境中存在多種蛋白，有些與bsa的性質(zhì)接近，在通過ffe-ief技術(shù)進(jìn)行分離時(shí)，明顯影響了bsa的純度，無法獲得理想的制備效果。

12、為此，本發(fā)明對(duì)牛乳/乳清原料進(jìn)行了特定的前處理設(shè)置，在自由流電泳之前盡可能富集純度較高的目標(biāo)蛋白物質(zhì)，去除影響電泳分離的物質(zhì)，并配合ffe-ief中特定兩性電解質(zhì)的選擇，最終獲得了理想的分離效果，獲得了高純度的bsa產(chǎn)品。

13、具體地，本發(fā)明在前處理時(shí)，特別以檸檬酸來對(duì)原料的ph值進(jìn)行調(diào)整，通過酸化老化結(jié)合微濾來去除影響bsa等電聚焦-自由流電泳分離的雜質(zhì)（雜蛋白），之后再將ph值調(diào)高，以超濾方法調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，去除原料中的鹽和其他雜質(zhì)，進(jìn)一步避免對(duì)后續(xù)電泳分離的影響。尤其發(fā)現(xiàn)，若酸化時(shí)使用其他酸，則不利于雜質(zhì)的沉淀、去除，進(jìn)而不利于等電聚焦-自由流電泳體系的溫度控制，并會(huì)影響分離效率，最終整體影響bsa的分離純化效果，無法獲得高純度的產(chǎn)品。

14、此外，本發(fā)明還研究發(fā)現(xiàn)，常見的蛋白質(zhì)電泳分離時(shí)所用的兩性電解質(zhì)體系，在應(yīng)用于本發(fā)明制備方法中時(shí)，會(huì)出現(xiàn)分離效率降低、分離目標(biāo)物純度下降的情況，本發(fā)明最終摸索發(fā)現(xiàn)使用甘氨酸-鹽酸作為兩性電解質(zhì)，配合特定前處理過程，可以提升bsa的分離效率，提高最終分離目標(biāo)蛋白的純度，保證了bsa的有效制備。

15、本發(fā)明的方法中，以檸檬酸進(jìn)行牛乳清的酸化和老化時(shí)，先將所述牛乳清的ph值調(diào)節(jié)至3.0-3.4，溫度調(diào)節(jié)至50-70℃，保持40-80min實(shí)現(xiàn)酸化，之后在30-40℃下靜置老化10-60h（優(yōu)選，22-26h）。

16、優(yōu)選，以檸檬酸進(jìn)行牛乳清的酸化和老化時(shí)，先將所述牛乳清的ph值調(diào)節(jié)至3.1-3.3，溫度調(diào)節(jié)至63-67℃，保持50-70min實(shí)現(xiàn)酸化，之后在35-40℃下靜置老化22-26h。

17、本發(fā)明的酸化、老化條件溫和，既可使雜蛋白有效沉淀，又利于保持目標(biāo)蛋白的活性。且優(yōu)選酸化的溫度高于老化的溫度，以在酸化時(shí)促進(jìn)雜蛋白迅速變性，并在后續(xù)老化階段更好地聚集。

18、本發(fā)明的方法中，所述微濾時(shí)的溫度為10-70℃；

19、所述滲濾時(shí)的溫度為10-50℃，壓力為0.3-0.7mpa，所述ph值調(diào)整后的第一料液和水的體積比為1：（0.5-3）。

20、本發(fā)明中以水進(jìn)行滲濾處理時(shí)，水的用量過多，會(huì)影響處理效率，用量過少不利于充分洗滌除雜，影響后續(xù)的制備效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)滲濾除雜的情況、截留液蛋白質(zhì)含量情況和生產(chǎn)需求對(duì)水的用量和超濾壓力進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

21、優(yōu)選，本發(fā)明的方法中，所述微濾時(shí)的溫度為45-55℃；所述微濾膜的孔徑為0.1-0.2微米；

22、所述滲濾時(shí)的溫度為45-55℃，所述ph值調(diào)整后的第一料液和水的體積比為1：（0.8-1.2）；所述超濾膜的孔徑為5000-6000da。

23、本發(fā)明的方法中，所述等電聚焦-自由流電泳中，所述電泳溶液包括甘氨酸-鹽酸的溶液和所述第二料液；所述甘氨酸-鹽酸的溶液中，甘氨酸的濃度為0.05mol/l-0.3mol/l，鹽酸的濃度為0.05mol/l-0.3mol/l；所述甘氨酸-鹽酸的溶液與所述第二料液的體積比為（0.3-1）：100；過程電壓為100-600v，分離溫度為2-25℃，所述電泳溶液的循環(huán)流速為10ml/min-30ml/min，循環(huán)次數(shù)為1-7次，收集ph值為5.4的組分為β-乳球蛋白，收集ph值為4.7-4.8的組分為牛血清白蛋白。

24、所述甘氨酸-鹽酸的溶液中，甘氨酸和鹽酸的摩爾比優(yōu)選為1:1，以提供適宜的離子環(huán)境（獲得在離子濃度最低的情況下提供廣泛的ph?1-14范圍的兩性電解質(zhì)體系）。

25、本發(fā)明根據(jù)特定前處理獲得的料液情況，以有效分離牛血清白蛋白和β-乳球蛋白并盡量保持它們的活性為目標(biāo)，對(duì)等電聚焦-自由流電泳的設(shè)置參數(shù)進(jìn)行了設(shè)置，在本發(fā)明的上述電壓、循環(huán)流速和分離循環(huán)次數(shù)配合下，可保證在電流減小至無法繼續(xù)分離之前完成分離純化，有利于保證生產(chǎn)效率和產(chǎn)品活性。此外，在本發(fā)明的等電聚焦-自由流電泳中，優(yōu)選在上述ph值范圍內(nèi)進(jìn)行牛血清白蛋白和β-乳球蛋白的收集，若改為僅在本領(lǐng)域常規(guī)的牛血清白蛋白等電點(diǎn)ph值4.7下收集，則會(huì)產(chǎn)生回收率降低的情況，改為在本領(lǐng)域常規(guī)的β-乳球蛋白等電點(diǎn)ph值5.1-5.3下收集，也會(huì)產(chǎn)生回收率降低的情況。

26、本發(fā)明的等電聚焦-自由流電泳中，通過正極電解液和負(fù)極電解液的不斷循環(huán)流動(dòng)來提供并維持穩(wěn)定的電泳電壓，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)進(jìn)行正極電解液和負(fù)極電解液的選擇。例如，正極電解液包括硫酸、磷酸及醋酸等，負(fù)極電解液包括氫氧化鈉、氨水等。

27、以本發(fā)明方法可在制備高純度、高活性bsa的同時(shí)制備高純度、高活性的β-乳球蛋白。

28、優(yōu)選，所述等電聚焦-自由流電泳中，過程電壓為350-450v，分離溫度為2-6℃，分離循環(huán)為4-5次。

29、本發(fā)明的方法中，當(dāng)所述原料為牛乳時(shí)，先將所述牛乳進(jìn)行脫脂、巴氏殺菌后，再以檸檬酸調(diào)節(jié)ph值為4.2-4.6后，分離獲得牛乳清。

30、本發(fā)明優(yōu)選使用檸檬酸進(jìn)行牛乳清的制備，以利于蛋白活性的保持。且ph范圍設(shè)定為4.2-4.6，有利于保證乳清蛋白的純化效率。

31、本發(fā)明中，脫脂、巴氏殺菌和乳清分離均可采用本領(lǐng)域常規(guī)方式進(jìn)行。

32、本發(fā)明的方法中，所述脫脂后所述牛乳中脂肪含量＜0.06%（可采用本領(lǐng)域常規(guī)離心方式進(jìn)行，如，以溫度為50℃，離心的轉(zhuǎn)速為5000rpm的條件進(jìn)行離心）；所述巴氏殺菌的溫度為70-90℃，時(shí)間為10-60s。

33、本發(fā)明的方法中，可采用離心方式分離獲得牛乳清，所述離心的溫度為20-70℃，轉(zhuǎn)速為5000-10000rpm，時(shí)間為20-60min，優(yōu)選，所述離心分離溫度25℃，離心時(shí)間為30-60min，離心轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm，更優(yōu)選所述離心的溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為8000rpm，時(shí)間為30min。

34、本發(fā)明的有益效果至少在于：

35、本發(fā)明的制備方法可利用原料來源廣泛且成本低的牛乳/乳清實(shí)現(xiàn)bsa的制備，獲得的bsa純度高，且可同時(shí)獲得高純度的β-乳球蛋白。