本發(fā)明涉及一種用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵。

背景技術(shù)：

1、γ-聚谷氨酸（γ-pga）是微生物如枯草芽孢桿菌（bacillus?subtilis）在特定的條件下產(chǎn)生的一種胞外多聚氨基酸，能為微生物提供保護(hù)作用以及營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。γ-pga由谷氨酸單體之間通過(guò)α-氨基上的氫原子和γ-羧基上的羥基脫水縮合形成酰胺鍵而組成的，其相對(duì)分子質(zhì)量通常在10kda-8000kda之間。由于γ-pga具有安全無(wú)毒、可生物降解、吸水性強(qiáng)、無(wú)免疫原性等特性，因此γ-pga及其衍生物被廣泛應(yīng)用于肥料、環(huán)保、食品、化妝品、醫(yī)藥、水處理等多個(gè)領(lǐng)域，具有巨大的商業(yè)價(jià)值以及應(yīng)用潛力。

2、不同相對(duì)分子質(zhì)量的γ-pga?特性有所不同，因此γ-pga的相對(duì)分子質(zhì)量與其應(yīng)用領(lǐng)域息息相關(guān)。在化妝品方面，不同分子量γ-pga則體現(xiàn)出不同的功效，高分子量的γ-pga具有成膜性，可有效防止水分流失；而低分子量的γ-pga利于透皮吸收，能夠深層保濕并護(hù)理皮膚。在醫(yī)藥領(lǐng)域，高分子量的γ-pga可以應(yīng)用于癌癥的臨床治療，而低分子量的γ-pga可以作為藥物載體。目前，大多數(shù)關(guān)于生產(chǎn)不同分子量γ-pga的研究均著重在菌種改造、酶法及物理化學(xué)法調(diào)控等方面，過(guò)程復(fù)雜且漫長(zhǎng)，不利于γ-pga的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，一種簡(jiǎn)單便捷的發(fā)酵生產(chǎn)γ-pga的方法，對(duì)于γ-pga的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，實(shí)現(xiàn)高分子量或低分子量γ-pga的簡(jiǎn)單合成，同時(shí)還能有效提高γ-pga的產(chǎn)量。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

3、一種用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，該方法為：在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程中，添加金屬離子，使枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)高分子量或低分子量的γ-聚谷氨酸，并提高其產(chǎn)量。

4、進(jìn)一步的，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌bacillus?subtilis?frd518，其保藏編號(hào)為cgmcc?no.6772，保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

5、進(jìn)一步的，所述金屬離子為二價(jià)錳離子或三價(jià)鐵離子。

6、進(jìn)一步的，所述金屬離子是以一水合硫酸錳或六水合三氯化鐵的形式加入。

7、進(jìn)一步的，所述高分子量γ-聚谷氨酸為相對(duì)平均分子量≥3400kd的γ-聚谷氨酸，低分子量γ-聚谷氨酸為相對(duì)平均分子量≤220kd的γ-聚谷氨酸。

8、進(jìn)一步的，在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加二價(jià)錳離子，提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)高分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。

9、進(jìn)一步的，所述二價(jià)錳離子在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2.37-9.47mmol/l。

10、進(jìn)一步的，在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加三價(jià)鐵離子，提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。

11、進(jìn)一步的，所述三價(jià)鐵離子在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.296-0.739mmol/l。

12、進(jìn)一步的，所述用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，包括如下步驟：

13、（1）菌種的活化：將枯草芽孢桿菌bacillus?subtilis?frd518菌種接種在固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24h，得到活化的枯草芽孢桿菌菌種；

14、（2）種子液的制備：取兩環(huán)活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌種子液；

15、（3）搖瓶發(fā)酵：將金屬離子溶液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到含有金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基。將枯草芽孢桿菌種子液接種到含有金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，得含γ-聚谷氨酸的發(fā)酵液。

16、進(jìn)一步的，步驟（3）中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量為：葡萄糖20-120g/l、蛋白胨5-25g/l、無(wú)機(jī)氮源2-20g/l、谷氨酸鈉10-100g/l、磷酸氫二鉀0.2-5g/l、檸檬酸2-15g/l和七水合硫酸鎂0.1-2g/l，其余為水，ph6.0-?8.0。

17、進(jìn)一步的，步驟（3）中，所述枯草芽孢桿菌種子液的接種量為5%；發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，振幅26-50mm。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

19、（1）本發(fā)明將金屬離子應(yīng)用到γ-聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，一步法發(fā)酵生產(chǎn)γ-pga，可以直接得到相對(duì)高分子量或低分子量的γ-聚谷氨酸，使枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的γ-聚谷氨酸從分子量約2000kd升高到3400kd以上或下降到220kd以下，操作簡(jiǎn)單便捷。

20、（2）本發(fā)明可以在發(fā)酵條件不變的情況下，僅通過(guò)添加金屬離子，增加γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量，使其產(chǎn)量提高17-34%，具有良好的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

21、（3）本發(fā)明通過(guò)添加金屬離子發(fā)酵生產(chǎn)高分子量或低分子量γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的方法成本低廉，效果明顯，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：該方法為：在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程中，添加金屬離子，使枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)高分子量或低分子量的γ-聚谷氨酸，并提高其產(chǎn)量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌bacillus?subtilis?frd518，其保藏編號(hào)為cgmccno.6772，保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：所述金屬離子為二價(jià)錳離子或三價(jià)鐵離子。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：所述金屬離子是以一水合硫酸錳或六水合三氯化鐵的形式加入。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：所述高分子量γ-聚谷氨酸為相對(duì)平均分子量≥3400kd的γ-聚谷氨酸，低分子量γ-聚谷氨酸為相對(duì)平均分子量≤220kd的γ-聚谷氨酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加二價(jià)錳離子，提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)高分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：所述二價(jià)錳離子在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2.37-9.47mmol/l。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加三價(jià)鐵離子，提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：所述三價(jià)鐵離子在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.296-0.739mmol/l。

10.一種權(quán)利要求1所述的用金屬離子調(diào)控γ-聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，其特征在于：包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種用金屬離子調(diào)控γ?聚谷氨酸的分子量的發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。該方法為：在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程中，添加金屬離子，使枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)高分子量或低分子量的γ?聚谷氨酸，并提高其產(chǎn)量，所述金屬離子為二價(jià)錳離子或三價(jià)鐵離子；所述高分子量γ?聚谷氨酸為相對(duì)平均分子量≥3400kD的γ?聚谷氨酸，低分子量γ?聚谷氨酸為相對(duì)平均分子量≤220kD的γ?聚谷氨酸。本發(fā)明通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加金屬離子，實(shí)現(xiàn)高分子量或低分子量γ?PGA的簡(jiǎn)單合成，同時(shí)還能有效提高γ?PGA的產(chǎn)量。

技術(shù)研發(fā)人員：李海軍,陳炎,馬雙雙,張英華,李善玲,王慶波,韓玉婷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東福瑞達(dá)生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6