本發(fā)明屬于生物，涉及一株干酪乳桿菌或其組合菌劑在發(fā)酵制備多肽中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳酸菌是一類革蘭氏陽性、厭氧或兼性厭氧、耐酸的球菌或桿菌，能將糖類發(fā)酵為乳酸。乳酸菌主要包括干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等。乳酸菌在固態(tài)發(fā)酵中可以利用原料中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過自身的酶將蛋白質(zhì)水解為多肽。這種發(fā)酵方式對(duì)于多肽的提取機(jī)械化要求低，因此，乳酸菌生物發(fā)酵現(xiàn)已發(fā)展為生物研究的熱點(diǎn)之一。

2、糖尿病是全球常見的疾病，約有90％的糖尿病患者都患有2型糖尿病。通過阻止分解碳水化合物的消化酶作用來延緩碳水化合物的分解，是預(yù)防糖尿病的有效策略。食物中的碳水化合物在腸道主要以單糖的形式被人體吸收利用。人體攝入的淀粉等多糖物質(zhì)被唾液和胰α-淀粉酶講解生成寡糖及二糖后，還需要在α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成葡萄糖后才能夠被吸收利用。因此，α-葡萄糖苷酶成為了抑制碳水化合物吸收的有效靶點(diǎn)。目前，已經(jīng)在臨床上應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制了降血糖藥物主要為阿卡波糖和伏格列糖，但是這些藥物的治療或多或少會(huì)引起不良反應(yīng)或副作用。研究表明，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽是一類誘導(dǎo)型物質(zhì)，主要通過活性多肽分子對(duì)多糖與酶之間的結(jié)合產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，降低酶與多糖之間的結(jié)合率，使得大量多糖因沒有相應(yīng)的酶的催化而無法分解成為葡萄糖。

3、薄殼山核桃，又稱碧根果，原產(chǎn)北美洲，現(xiàn)在我國(guó)的江蘇、浙江、河南、河北等省均有栽培。薄殼山核桃堅(jiān)果營(yíng)養(yǎng)豐富、含油量高，作為重要的木本油料樹種之一，是國(guó)家糧油安全的重要保障。此外，薄殼山核桃還含有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸以及鉀、鈣等人體必需的礦物質(zhì)元素，可以滿足大多數(shù)人群的日常營(yíng)養(yǎng)的需求。目前，我國(guó)大部分薄殼山核桃作為廢棄物丟棄或僅僅作為飼料肥料使用，忽略了其榨油后副產(chǎn)物——薄殼山核桃餅粕的再利用及相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)，其副產(chǎn)物薄殼山核桃餅粕蛋白含量高達(dá)30％。這些蛋白及肽類具有多種生理功能，包括抗氧化，調(diào)節(jié)血糖和免疫調(diào)節(jié)等，具有成為功能性食品的重要潛力。但是篩選具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽仍舊存在困難和運(yùn)氣成分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一株干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)gyx-1或其組合菌劑在發(fā)酵制備多肽中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了由上述方法制備得到的多肽。

3、本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了一種分子量≤3kda，再通過計(jì)算機(jī)輔助篩選和分子對(duì)接的方法快速篩選出具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽，進(jìn)而得到能夠具有降血糖功能的肽。

4、本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供了所述的多肽在制備降低血糖的藥物或制劑中的應(yīng)用。

5、技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)gyx-1或其組合菌劑在發(fā)酵制備多肽中的應(yīng)用，所述干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)gyx-1于2018年6月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.15956。

6、其中，所述應(yīng)用包括將干酪乳桿菌(lactobacillus?casei)gyx-1和德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckii?subsp?bulgaricus)gyx-2組合發(fā)酵制備多肽，所述德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckii?subsp?bulgaricus)gyx-2于2020年12月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.21287。

7、其中，所述組合發(fā)酵的步驟為：將干酪乳桿菌(lactobacillus?casei)gyx-1和德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckii?subsp?bulgaricus)gyx-2組合制備的發(fā)酵劑在薄殼山核桃餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵后的發(fā)酵液稀釋后超濾得到。

8、本發(fā)明還提供了一種乳酸菌組合固態(tài)發(fā)酵制備薄殼山核桃多肽的方法，所述方法包括將干酪乳桿菌(lactobacillus?casei)gyx-1和德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckii?subsp?bulgaricus)gyx-2組合制備的發(fā)酵劑在薄殼山核桃餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵后的發(fā)酵液稀釋后超濾得到，所述干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)gyx-1于2018年6月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.15956，所述德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckiisubsp?bulgaricus)gyx-2于2020年12月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.21287。

9、其中，所述發(fā)酵劑的制備包括：將干酪乳桿菌(lactobacillus?casei)gyx-1和德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckii?subsp?bulgaricus)gyx-2按照菌液接種量1.50wt％～3.00wt％，分別接入mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后按照一定體積比混合得到。

10、其中，所述干酪乳桿菌(lactobacillus?casei)gyx-1和德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus?delbrueckii?subsp?bulgaricus)gyx-2的體積比為0.3～5:1。

11、優(yōu)選地，所述的干酪乳桿菌gyx-1和德氏乳桿菌保加利亞亞種gyx-2的培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)，按照2％的接種量接種于mrs培養(yǎng)基。

12、其中，所述薄殼山核桃餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法包括：將薄殼山核桃餅粕進(jìn)行粉碎，烘干，過篩，得到薄殼山核桃餅粕粉，取薄殼山核桃餅粕粉加入蒸餾水滅菌即得。本發(fā)明所述的薄殼山核桃餅粕來源的降血糖肽來源于重要的木本油料作物薄殼山核桃餅粕榨油加工后的副產(chǎn)物——薄殼山核桃餅粕。

13、其中，所述發(fā)酵步驟包括：將上述薄殼山核桃餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基加熱到110～130℃，保溫10-30分鐘后，冷卻至室溫，在無菌操作條件下，加入12.00％～21.00wt％的發(fā)酵劑；將以上接種后的薄殼山核桃餅粕培養(yǎng)基于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵6～16h。

14、優(yōu)選地，所述的薄殼山核桃餅粕培養(yǎng)基中加入1.5ml菌液于37℃的恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵12h。

15、其中，所述發(fā)酵液稀釋按照1:5～10(g/ml)的發(fā)酵液和水的重量體積比進(jìn)行稀釋，常溫震蕩1～3h進(jìn)行提取，3000～5000×g離心5-20min，取上清液進(jìn)行超濾。

16、其中，所述超濾的超濾膜壓力為0.1～0.5mpa。

17、優(yōu)選地，所述超濾膜壓力為0.3mpa。

18、本
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
還包括所述的方法制備得到的多肽。

19、其中，所述多肽的氨基酸序列為fagddapr或lagnpddefrpq。

20、本發(fā)明內(nèi)容還包括將超濾液進(jìn)行冷凍干燥測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

21、本發(fā)明內(nèi)容還包括降血糖肽序列分析：采用lc-ms/ms分析降血糖肽的氨基酸序列。

22、本發(fā)明內(nèi)容還包括分子對(duì)接篩選：利用peptide?ranker軟件對(duì)所鑒定的肽段進(jìn)行潛在生物活性預(yù)測(cè)，篩選到15條具有潛在α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽段。利用autodockvina對(duì)10條肽段進(jìn)行分子對(duì)接，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲取α-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)文件，去除配體和h2o與肽段對(duì)接，篩選出對(duì)接后結(jié)合能最低肽段fagddapr和lagnpddefrpq。

23、本發(fā)明內(nèi)容還包括外合成驗(yàn)證：根據(jù)篩選出來的2個(gè)多肽進(jìn)行固相合成，收集測(cè)定其α-葡萄糖苷酶抑制活性。

24、優(yōu)選地，所述的lc-ms/ms采用的液相色譜分析柱為packing:reprosil-pur120c18-aq(75μm?i.d.×250mm,1.9μm)。儀器采用的是easy?nlc?1200/orbitrapexploris480。

25、優(yōu)選地，所述α-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)文件從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(proteindatabank,pdb)中獲取，代碼為3wy1。

26、本發(fā)明內(nèi)容還包括所述的多肽在制備降血糖的藥物或制劑中的應(yīng)用。

27、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明所述的薄殼山核桃餅粕來源的降血糖肽來源于薄殼山核桃榨油后的副產(chǎn)物，蛋白含量較高，有較高的利用價(jià)值；(2)本發(fā)明所述方法采用干酪乳桿菌，德氏乳桿菌保加利亞亞種進(jìn)行發(fā)酵，在衛(wèi)生部發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》中，不僅產(chǎn)多肽能力強(qiáng)，還具有安全性高的優(yōu)勢(shì)；(3)本發(fā)明采用分子對(duì)接的方法進(jìn)行篩選具有潛在降血糖功能的肽段，具有效率高，準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點(diǎn)；(4)本發(fā)明所述的薄殼山核桃餅粕來源的降血糖肽能夠用于制備功能性制劑，通過抑制α-葡萄糖苷酶活性達(dá)到降低血糖的功效。