本發(fā)明涉及細(xì)胞治療領(lǐng)域，尤其涉及syn-car-t細(xì)胞的制備方法及其細(xì)胞和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、car-t細(xì)胞療法是將特異性抗原嵌合受體car的編碼基因轉(zhuǎn)入t細(xì)胞，然后再將細(xì)胞重新輸入患者體內(nèi)，通過t細(xì)胞表達(dá)的car識別腫瘤細(xì)胞表面的靶向抗原，激活t細(xì)胞殺傷活性，進(jìn)而釋放穿孔素、顆粒酶、細(xì)胞因子等發(fā)揮腫瘤殺傷作用的療法。car-t細(xì)胞會直接發(fā)揮抗腫瘤殺傷作用，無需主要組織相容性復(fù)合體(mhc)識別限制。

2、car-t細(xì)胞療法副作用包括細(xì)胞因子釋放綜合征，血細(xì)胞減少，神經(jīng)毒性綜合征，移植物抗宿主病(gvhd)，“on?target?off?tumor”毒性等等，其中“on?target?off?tumor”毒性與car-t細(xì)胞單一的機(jī)械的殺傷識別模式有關(guān)。

3、roybal等在2016年新開發(fā)一種synnotch系統(tǒng)，是一種“and?gate”回路系統(tǒng)，并成功應(yīng)用到car-t細(xì)胞治療中。synnotch系統(tǒng)作用方式：腫瘤細(xì)胞表面需同時表達(dá)相應(yīng)的2種抗原，才能激活synnotch?car-t(syn-car-t)細(xì)胞特異殺傷功能。因此，syn-car-t細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)智能型識別殺傷腫瘤這一目標(biāo)，從而提高car-t細(xì)胞治療的安全性。synnotch系統(tǒng)只改造替換了野生型notch受體的胞外區(qū)，胞內(nèi)區(qū)，下游效應(yīng)元件，保留notch受體的核心調(diào)控區(qū)。胞外區(qū)(輸入識別信號)可用靶向各種腫瘤細(xì)胞的同源特異性抗體的scfv分子替換(如cd19-scfv)，下游效應(yīng)元件(輸出轉(zhuǎn)錄信號)可用抗體scfv分子、細(xì)胞因子、免疫激活或抑制分子、熒光蛋白等替換。轉(zhuǎn)錄調(diào)控所需的nicd替換成人工轉(zhuǎn)錄因子gal4-vp64，是2種天然轉(zhuǎn)錄因子組合得到的新的融合蛋白。gal4/vp16-uas表達(dá)系統(tǒng)作用原理是gal4的dna結(jié)合域與上游激活序列(uas)結(jié)合后可特異性激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，單純皰疹病毒vp16蛋白可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控的研究。

4、synnotch是一種合成的notch受體，將鼠的notch1受體改造，胞外域用單鏈抗體替換(a抗體scfv(單鏈抗體))，胞內(nèi)域用轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域gal4vp64替換，僅保留可以被蛋白酶識別切割的跨膜核心域(nc)。notch受體蛋白由胞外區(qū)片段(necd)，跨膜區(qū)片段(tmd)，胞內(nèi)區(qū)片段(nicd)構(gòu)成。當(dāng)胞外區(qū)的受體與配體結(jié)合后，改變構(gòu)象，暴露酶切位點(diǎn)，被金屬蛋白酶和γ-分泌酶作用識別，進(jìn)行切割，裂解后釋放胞內(nèi)區(qū)nicd，nicd可以通過核定位信號nsl易位到細(xì)胞核中并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而激活下游信號通路。

5、synnotch系統(tǒng)的響應(yīng)程序代表了一種重構(gòu)t細(xì)胞響應(yīng)的策略，以synnotch?car-t細(xì)胞為例，腫瘤細(xì)胞表面需同時表達(dá)相應(yīng)的2種抗原，才能激活car-t細(xì)胞特異殺傷功能。因此，synnotch?car-t細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)精確識別殺傷腫瘤這一目標(biāo)。但是，synnotch系統(tǒng)較大，系統(tǒng)控制元件包括notch受體核心區(qū)，胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子gal4vp64，uas識別序列，內(nèi)部啟動子，一共2.5kb左右，系統(tǒng)可編輯區(qū)的輸入信號分子(如cd19-scfv)和輸出信號分子(如bcma-car)一共2.5kb左右，整個系統(tǒng)占據(jù)5kb左右，需通過2個慢病毒載體質(zhì)粒傳遞，即一個gal4誘導(dǎo)載體和一個uas效應(yīng)載體。所以轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時不僅需要制備二種慢病毒載體，還需要進(jìn)行雙病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。

6、synnotch系統(tǒng)還面臨一個問題，uas效應(yīng)載體未激活時不表達(dá)效應(yīng)分子，流式無法檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，除非增加一個啟動子單獨(dú)表達(dá)一個熒光蛋白信號進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測。采用慢病毒載體進(jìn)行雙病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞會產(chǎn)生一個制備生產(chǎn)問題，即制備雙陽性t細(xì)胞的效率低，需要進(jìn)行流式分選富集才能獲得雙陽率高的t細(xì)胞。此外，慢病毒載體由于vsv-g包膜蛋白毒性問題以及采用的是第三代自失活慢病毒載體進(jìn)行包裝，只能進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染包裝，無法大規(guī)模制備，包裝滴度低，需要富集和純化，極大限制了syn-car-t細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用。由于上述原因極大限制了synnotch系統(tǒng)car-t細(xì)胞治療方面的應(yīng)用，需要進(jìn)一步進(jìn)行受體系統(tǒng)優(yōu)化或者載體優(yōu)化。

7、通過慢病毒載體傳遞synnotch系統(tǒng)所面臨的制備效率低下問題，可通過替換病毒載體進(jìn)行包裝來解決。目前常用的病毒載體包括γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(γ-rv)，γ-rv屬于簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒，直徑約為100nm，有包膜，基因組是2個拷貝的正鏈rna，基因組大小為8.3kb左右，基因組只包括2個ltr，gag-pol，env。γ-rv只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期細(xì)胞，無法轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，可以整合宿主基因組，包裝滴度高，插入外源目的基因大于4kb會極大降低載體包裝滴度。為了進(jìn)一步提高γ-rv的安全性，減少復(fù)制型rcr的產(chǎn)生，將γ-rv的3’ltr的u3啟動子刪除，改造成自失活γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(sin-rv)。

8、γ-rv載體具有成熟的大規(guī)模的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝方法，生產(chǎn)滴度高，但是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是隨機(jī)整合到宿主染色質(zhì)中，有插入突變誘發(fā)宿主原癌基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。sin-rv的u3增強(qiáng)子被刪除，致癌風(fēng)險(xiǎn)降低，極大提高了載體的安全性。sin-rv面臨的挑戰(zhàn)是大規(guī)模生產(chǎn)病毒載體的困難。由于缺失u3元件，無法構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，只有通過瞬時轉(zhuǎn)染包裝獲得，難以擴(kuò)大生產(chǎn)，而且使用傳統(tǒng)的方法很難篩選出產(chǎn)生sin-rv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供syn-car-t細(xì)胞的制備方法，所述方法包括：步驟1：利用piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的sin-γ-rv載體，即psr載體；步驟2：制備syncar質(zhì)粒載體：用步驟1制備的所述psr載體表達(dá)synnotch系統(tǒng)，將所述synnotch系統(tǒng)的gal4誘導(dǎo)載體和uas效應(yīng)載體合并在一個所述psr載體上，使得所述synnotch系統(tǒng)由一個所述psr載體進(jìn)行遞送，構(gòu)建syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒；和步驟3：將上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞，制備得到所述syn-car-t細(xì)胞。

2、piggybac轉(zhuǎn)座子(pb)系統(tǒng)屬于dna轉(zhuǎn)座子，通過“剪切-粘貼”機(jī)制可將itr之間的目的基因整合到靶細(xì)胞基因組中并長期穩(wěn)定表達(dá)。pb系統(tǒng)，pb轉(zhuǎn)座子的末端是長13bp的反向重復(fù)序列(itr)，pb轉(zhuǎn)座酶由單獨(dú)質(zhì)粒表達(dá)。pb整合機(jī)制，雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，pb轉(zhuǎn)座酶識別載體兩端的itr，從itr兩端切除成為游離的pb轉(zhuǎn)座子(攜帶目的基因)，基因組ttaa位點(diǎn)被切開形成黏性末端，pb轉(zhuǎn)座子被插入到基因組的“ttaa”位點(diǎn)進(jìn)行整合。

3、在一種實(shí)施方式中，所述syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向cd19分子，bcma分子，cd38分子，或gpc3分子的psr.synnotch載體的質(zhì)粒。

4、在一種實(shí)施方式中，所述syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向cd19分子的psr.synnotch載體的質(zhì)粒。

5、在一種實(shí)施方式中，步驟1中，在所述piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的pb轉(zhuǎn)座子5’itr和3’itr序列之間順序地插入sin-γ-rv載體的5’ltr，5’utr，和3’sin-ltr序列；所述非編碼區(qū)utr包括為病毒載體包裝信號的ψ元件和為剪切供體位點(diǎn)的sd，所述3’sin-ltr序列中u3區(qū)刪除，只保留r區(qū)和u5區(qū)。

6、在一種實(shí)施方式中，5’utr刪除所有g(shù)ag和pol編碼區(qū)序列以及起始密碼子atg。

7、在一種實(shí)施方式中，5’ltr和3’sin-ltr之間分別插入synnotch系統(tǒng)的效應(yīng)分子uas?tagbfp和誘導(dǎo)受體sffv_scfv?notch?gal4vp64，誘導(dǎo)受體蛋白由sffv啟動子啟動表達(dá)。

8、在一種實(shí)施方式中，在gal4vp64蛋白下游添加p2a-egfp熒光蛋白，作為載體受體蛋白cd19?scfv、bcma?scfv、cd38?scfv或gpc3?scfv的檢測標(biāo)簽。

9、在一種實(shí)施方式中，提供上述方法構(gòu)建的syn-car-t細(xì)胞。

10、在一種實(shí)施方式中，提供上述syn-car-t細(xì)胞在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用。

11、在一種實(shí)施方式中，提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物含有權(quán)利要求8所述的car-t細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

12、在一種實(shí)施方式中，提供一種體外抑制腫瘤細(xì)胞的方法，包括將腫瘤細(xì)胞與上述car-t細(xì)胞或上述藥物組合物接觸，從而抑制所述腫瘤細(xì)胞。

13、piggybac轉(zhuǎn)座子(pb)系統(tǒng)屬于dna轉(zhuǎn)座子，通過“剪切-粘貼”機(jī)制可將itr之間的目的基因整合到靶細(xì)胞基因組中并長期穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明結(jié)合piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和sin-rv可構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sin-rv的載體(psr)。為了方便快速篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sin-rv的細(xì)胞克隆，在載體設(shè)計(jì)時插入熒光蛋白copgfp和嘌呤霉素藥篩基因。理論上，本發(fā)明設(shè)計(jì)的新型psr載體包裝元件只有1.1kb，而經(jīng)典mfg載體包裝元件有2.6kb，極大提高了載體包裝容量，而且psr載體上的copgfp和嘌呤霉素藥篩基因極大提高了sin-rv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆的篩選效率。

14、本發(fā)明利用psr載體表達(dá)synnotch系統(tǒng)，將gal4誘導(dǎo)載體和uas效應(yīng)載體合并在一個psr載體上(單載體系統(tǒng))，只需構(gòu)建一個psr.synnotch載體進(jìn)行病毒包裝，單獨(dú)一個病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，uas效應(yīng)元件未激活不表達(dá)時可用gal4誘導(dǎo)元件的標(biāo)簽檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本發(fā)明的psr.synnotch系統(tǒng)不僅解決了原系統(tǒng)雙載體下游效應(yīng)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)效率難以檢測問題，而且解決了雙載體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞制備雙陽細(xì)胞效率低的問題，最重要的是可以構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)，非常有利于synnotch系統(tǒng)的應(yīng)用。

15、為了進(jìn)一步驗(yàn)證psr.syn載體中synnotch系統(tǒng)的誘導(dǎo)效率，本發(fā)明選取了4種腫瘤抗原(人源bcma抗原，人源cd38抗原，人源cd19抗原，人源gpc3抗原)作為靶點(diǎn)，分別構(gòu)建psr.syncar載體，為了方便檢測synnotch系統(tǒng)的誘導(dǎo)效率，uas下游效應(yīng)分子將選擇熒光蛋白tagbfp，與相應(yīng)腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以通過檢測tagbfp的表達(dá)效率評價psr.syn載體中synnotch受體激活效率，篩選出誘導(dǎo)效率最優(yōu)的靶點(diǎn)。結(jié)果表明，靶點(diǎn)bcma，cd38，gpc3的誘導(dǎo)效率極低，不適合synnotch系統(tǒng)；靶點(diǎn)cd19誘導(dǎo)效率最高，最適合應(yīng)用于synnotch系統(tǒng)，因?yàn)閏d19-syn-car-t細(xì)胞識別cd19抗原陽性腫瘤細(xì)胞，暴露酶切位點(diǎn)，裂解釋放人工轉(zhuǎn)錄因子gal4-vp64，gal4-vp64通過核定位信號nsl進(jìn)入細(xì)胞核與上游激活序列uas結(jié)合才能激活下游效應(yīng)分子的表達(dá)。