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一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):40533945發(fā)布日期:2024-12-31 13:51閱讀:來源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌,其特征在于,所述工程菌為重組釀酒酵母,所述重組釀酒酵母包括來源于金線蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal、來源于枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因bssfp以及來源于艾阿華諾卡氏菌的還原酶基因nicar,或豚鼠耳炎諾卡菌還原酶基因nocar,或草分枝桿菌的羧酸還原酶基因mpcar。

2.一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法,其特征在于,以野生型釀酒酵母kmly1-2的ura3基因敲除菌株kmly1-8為底盤菌株,將來源于金線蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal、來源于枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因bssfp、以及來源于艾阿華諾卡氏菌的還原酶基因nicar,或豚鼠耳炎諾卡菌還原酶基因nocar,或草分枝桿菌的羧酸還原酶基因mpcar整合至所述底盤菌株的基因組上,所述構(gòu)建方法包括以下具體步驟:

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟(1)中敲除野生型釀酒酵母kmly1-2中的ura3基因的方法為:構(gòu)建重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna,在轉(zhuǎn)化體系中,使用peg-醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將表達(dá)cas9蛋白的質(zhì)粒pcfb2312、重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna和donor?dna轉(zhuǎn)化至kmly1-2菌株感受態(tài)細(xì)胞中,使用引物ura3-vf1和ura3-vr1對(duì)單菌落進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證,驗(yàn)證成功的菌株為釀酒酵母kmly1-2?ura3基因敲除菌株,釀酒酵母kmly1-8。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟(3)中arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:以自金線蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal進(jìn)行密碼子優(yōu)化,然后在其5′和3′端分別合成上啟動(dòng)子padh1和終止子tpdc1,以所合成的dna為模版,使用引物pal-f1①、pal-r1①進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因arpal表達(dá)框;

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟(4)中

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna的構(gòu)建方法為:從釀酒酵母kmly1-2全基因組中找出ura3基因編碼框,在線設(shè)計(jì)sgrna,合成出50bp?dna單鏈ura3-20bp-f1,ura3-20bp-r1,將兩條50bp?dna單鏈退火形成50bp?dna雙鏈,利用引物3052f和3052r對(duì)質(zhì)粒pcfb3052進(jìn)行線性化,然后將其與50bp?dna雙鏈進(jìn)行無縫克隆連接,并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒,獲得重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟(3)中pcr擴(kuò)增得到基因arpal表達(dá)框的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min,95℃變性15s,50.9℃退火15s,72℃延伸3min,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min后使用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物,獲得基因arpal表達(dá)框;

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟(4)

9.一種權(quán)利要求1所述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)肉桂醇的用途。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域,特別涉及一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用,所述工程菌為重組釀酒酵母,該重組釀酒酵母包括來源于金線蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因Arpal、來源于枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Bssfp以及來源于艾阿華諾卡氏菌的還原酶基因Nicar,或豚鼠耳炎諾卡菌還原酶基因Nocar,或草分枝桿菌的羧酸還原酶基因Mpcar。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了肉桂醇在釀酒酵母中的全合成,且利用所述重組釀酒酵母生產(chǎn)出的肉桂醇可高達(dá)30.30mg/L。

技術(shù)研發(fā)人員:鞏效偉,羅義勇,朱東來,趙楊,趙偉,秦云華,麻廣慧,張霞,吳恒,洪鎏,李世衛(wèi),李志強(qiáng),張帆,鄭聰悅,郭英,向能軍,鄭建鋒
受保護(hù)的技術(shù)使用者:云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2024/12/30
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