本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肉桂醇又稱(chēng)桂皮醇、3-苯基-2-丙烯-1-醇、β-苯丙烯醇等，分子式c9h10o，相對(duì)分子量134.18。肉桂醇是一種芳香醇，具有溫和、持久而舒適的類(lèi)似風(fēng)信子與膏香的香氣特征，也有一定甜味。肉桂醇具有多種重要的功能和用途：第一，肉桂醇可用于調(diào)配香精，也可用作定香劑，還可用于合成乙酸肉桂酯、肉桂基丙烯酸甲酯等香料；第二，肉桂醇具有良好的抗炎和抑菌活性；第三，肉桂醇是一種重要的醫(yī)藥中間體，被應(yīng)用于制備真菌感染藥物萘替芬、抗癌物托瑞米芬和鈣拮抗劑西尼地平。目前，肉桂醇產(chǎn)品在全球市場(chǎng)上的銷(xiāo)量激增，供不應(yīng)求。

2、現(xiàn)有技術(shù)主要通過(guò)化學(xué)合成法制備肉桂醇，但化學(xué)合成法副產(chǎn)物較多，提純困難，且提取廢棄物對(duì)環(huán)境污染較大，并非制備肉桂醇最佳的方法。為此，技術(shù)人員也嘗試采用皂化法從蘇合香油、秘魯香油和肉桂油中提取肉桂醇，但天然原料中肉桂醇含量低，最終也存在提取得率低、提取難度大等問(wèn)題。為此尋找一種提取效率高且環(huán)境友好的肉桂醇制備方法是很有必要的。

3、近年來(lái)，生物合成技術(shù)因具備反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、特異性高、制備速度快、產(chǎn)量高、可持續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)型化合物的生產(chǎn)制備中。生物合成技術(shù)主要是特異性工程菌利用底物經(jīng)過(guò)一系列的生物合成路徑來(lái)生產(chǎn)化合物的過(guò)程，但目前用于高效制備肉桂醇的工程菌還未見(jiàn)報(bào)道。

4、本發(fā)明旨在解決上述問(wèn)題中的至少一個(gè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在利用基因工程技術(shù)，提供一種以野生型釀酒酵母kmly1-2的ura3基因敲除菌株kmly1-8為底盤(pán)細(xì)胞，將來(lái)源于金線(xiàn)蘭(anoectochilus?roxburghii)的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal、來(lái)源于枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因bssfp以及來(lái)源于艾阿華諾卡氏菌(nocardia?iowensis)羧酸還原酶基因nicar，或豚鼠耳炎諾卡菌(nocardia?otitidiscaviarum)羧酸還原酶基因nocar，或草分枝桿菌(mycolicibacterium?phlei)的羧酸還原酶基因mpcar克隆至質(zhì)粒py26tef-gpd上，然后構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)工程菌方法，采用該方法獲得的工程菌可高效生產(chǎn)肉桂醇。本發(fā)明在肉桂醇生物合成領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一發(fā)明提供一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌，所述工程菌為重組釀酒酵母，所述重組釀酒酵母包括來(lái)源于金線(xiàn)蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal、來(lái)源于枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因bssfp以及來(lái)源于艾阿華諾卡氏菌的還原酶基因nicar，或豚鼠耳炎諾卡菌還原酶基因nocar，或草分枝桿菌的羧酸還原酶基因mpcar。

4、本發(fā)明第二方面提供一種產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，是以野生型釀酒酵母kmly1-2的ura3基因敲除菌株kmly1-8為底盤(pán)菌株，將來(lái)源于金線(xiàn)蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal、來(lái)源于枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因bssfp、以及來(lái)源于艾阿華諾卡氏菌的還原酶基因nicar，或豚鼠耳炎諾卡菌還原酶基因nocar，或草分枝桿菌的羧酸還原酶基因mpcar整合至所述底盤(pán)菌株的基因組上，所述構(gòu)建方法包括以下具體步驟：

5、步驟(1)、敲除野生型釀酒酵母kmly1-2中的ura3基因，得到底盤(pán)菌株，命名為釀酒酵母kmly1-8；

6、步驟(2)、將釀酒酵母kmly1-8制備成感受態(tài)細(xì)胞；

7、步驟(3)、構(gòu)建arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒；

8、步驟(4)、以步驟(3)所得arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒為模板構(gòu)建arpal-bssfp-nicar三基因表達(dá)質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)化體系中，使用peg-醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將所述arpal-bssfp-nicar三基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至步驟(2)所得kmly1-8感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落,分別使用引物py-vf(pal)和+py-vr(pal)，引物py-vf和py-vr以及引物mcs1-vf1、mcs1-vr1進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株即為所述產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌，命名為kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-nicar；

9、或以步驟(3)所得arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒為模板構(gòu)建arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)化體系中，使用peg-醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將所述arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至步驟(2)所得kmly1-8感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落,分別使用引物py-vf(pal)和+py-vr(pal)，引物py-vf和py-vr以及引物mcs1-vf1、mcs1-vr1進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株即為所述產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌，命名為kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-nocar；

10、或以步驟(3)所得arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒為模板構(gòu)建arpal-bssfp-mpcar三基因表達(dá)質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)化體系中，使用peg-醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將所述arpal-bssfp-mpcar三基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至步驟(2)所得kmly1-8感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落,分別使用引物py-vf(pal)和+py-vr(pal)，引物py-vf和py-vr以及引物mcs1-vf1、mcs1-vr1進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株即為所述產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌，命名為kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-mpcar。

11、其中上述釀酒酵母kmly1-2由發(fā)明人前期分離獲得，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?m?2018457。

12、進(jìn)一步的，所述步驟(1)中敲除野生型釀酒酵母kmly1-2中的ura3基因的方法為：構(gòu)建重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna，在轉(zhuǎn)化體系中，使用peg-醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將表達(dá)cas9蛋白的質(zhì)粒pcfb2312、重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna和donor?dna轉(zhuǎn)化至kmly1-2菌株感受態(tài)細(xì)胞中，使用引物ura3-vf1和ura3-vr1對(duì)單菌落進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證成功的菌株為釀酒酵母kmly1-2?ura3基因敲除菌株，釀酒酵母kmly1-8。

13、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：以自金線(xiàn)蘭的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后在其5′和3′端分別合成上啟動(dòng)子padh1(如seq?id?no.31所示)和終止子tpdc1(如seq?id?no.32所示)，以所合成的dna為模版(如seq?id?no.33所示)，使用引物pal-f1①、pal-r1①進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因arpal表達(dá)框；以自枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶基因bssfp進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以所合成的dna為模版(如seq?id?no.34所示)，使用引物bssfp-f1、bssfp-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因bssfp編碼區(qū)；以質(zhì)粒py26tfe-gpd為模板，使用引物py26-f1①、py26-r1①進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到線(xiàn)性化表達(dá)載體；將基因arpal、bssfp和線(xiàn)性化載體進(jìn)行無(wú)縫克隆，并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，獲得arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒，命名為

14、py26tef-gpd-arpal-bssfp。

15、進(jìn)一步的，所述步驟(4)中arpal-bssfp-nicar三基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：以艾阿華諾卡氏菌的羧酸還原酶基因nicar進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以所合成的dna為模版(如seqid?no.35所示)，使用引物nicar-f1、nicar-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因nicar編碼區(qū)；以步驟(3)所制備得到的arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒為模板，使用引物mcs1-f1、mcs1-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到線(xiàn)性化表達(dá)載體；將基因nicar和線(xiàn)性化載體進(jìn)行無(wú)縫克隆，并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，獲得所述arpal-bssfp-nicar三基因表達(dá)質(zhì)粒；

16、arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：以豚鼠耳炎諾卡菌的羧酸還原酶基因nocar進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以所合成的dna為模版(如seq?id?no.36所示)使用引物nocar-f1、nocar-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因nocar表達(dá)框；以步驟(3)所制備得到的arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒為模板，使用引物mcs1-f1、mcs1-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到線(xiàn)性化表達(dá)載體；將基因nocar和線(xiàn)性化載體進(jìn)行無(wú)縫克隆，并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，獲得arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒；

17、arpal-bssfp-mpcar三基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：以草分枝桿菌的羧酸還原酶基因mpcar進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以所合成的dna為模版(如seq?id?no.37所示)，使用引物mpcar-f1、mpcar-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因mpcar編碼區(qū)；以步驟(3)所制備得到的arpal-bssfp雙基因表達(dá)質(zhì)粒為模板，使用引物mcs1-f1、mcs1-r1進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到線(xiàn)性化表達(dá)載體；將基因mpcar和線(xiàn)性化載體進(jìn)行無(wú)縫克隆，并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，獲得arpal-bssfp-mpcar三基因表達(dá)質(zhì)粒。

18、進(jìn)一步的，所述重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna的構(gòu)建方法為：從釀酒酵母kmly1-2全基因組中找出ura3基因編碼框，在線(xiàn)設(shè)計(jì)sgrna，合成出50bp?dna單鏈ura3-20bp-f1，ura3-20bp-r1，將兩條50bp?dna單鏈退火形成50bp?dna雙鏈，利用引物3052f和3052r對(duì)質(zhì)粒pcfb3052進(jìn)行線(xiàn)性化，然后將其與50bp?dna雙鏈進(jìn)行無(wú)縫克隆連接，并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒p3052-ura3-sgrna。

19、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中pcr擴(kuò)增得到基因arpal表達(dá)框的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性15s，50.9℃退火15s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min后使用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，獲得基因arpal表達(dá)框；pcr擴(kuò)增得到基因bssfp表達(dá)框的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，49℃退火15s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min后使用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，獲得基因bssfp表達(dá)框；pcr擴(kuò)增得到線(xiàn)性化表達(dá)載體pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，50.9℃退火15s，72℃延伸7min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min后采用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，獲得線(xiàn)性化表達(dá)載體。

20、進(jìn)一步的，所述步驟(4)arpal-bssfp-nicar三基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因nicar的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，49℃退火15s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min，然后采用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，得到nicar編碼區(qū)；

21、arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因nocar的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，49℃退火15s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min，然后采用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，獲得基因nocar編碼區(qū)；

22、arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到基因mpcar的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，49℃退火15s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min，然后采用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，獲得基因mpcar編碼區(qū)；

23、所述arpal-bssfp-nocar三基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到線(xiàn)性化表達(dá)載體的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，51.2℃退火15s，72℃延伸9min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min后采用通用型dna純化回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物，獲得線(xiàn)性化表達(dá)載體。

24、本發(fā)明第三方面還提供了第一方面所述釀酒酵母工程菌用于生產(chǎn)肉桂醇的用途。

25、本發(fā)明第四方面還提供了一種生產(chǎn)肉桂醇的方法，將第一方面所述的釀酒酵母工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中獲得肉桂醇。

26、進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)過(guò)程是在sc-ura液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24h。

27、其中，本發(fā)明肉桂醇生物合成途徑為：苯丙氨酸(phenylalanine,phe)在苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalanine?ammonia?lyase,pal)作用下生成肉桂酸，肉桂酸在羧酸還原酶(carboxylic?acid?reductase,car)催化下形成肉桂醛，最后肉桂醛在還原型輔酶ii的作用下通過(guò)肉桂醇脫氫酶(cinnamyl?alcohol?dehydrogenase,cad)還原產(chǎn)生肉桂醇。其中羧酸還原酶(carboxylic?acid?reductase,car)需要磷酸泛酰巰基乙胺基磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphopantetheine?transferase,sfp)激活。

28、本發(fā)明具有以下有益效果：

29、(1)本發(fā)明共構(gòu)建了3株產(chǎn)肉桂醇的釀酒酵母工程菌，分別為kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-nicar、kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-nocar、kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-mpcar，其中，kmly1-8/py26tef-gpd-arpal-bssfp-mpcar的產(chǎn)量最高，為30.30mg/l。

30、(2)本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了肉桂醇在釀酒酵母中的全合成。