本發(fā)明屬于分子生物檢測(cè)，尤其涉及一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、昆蟲(chóng)細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)、重組蛋白表達(dá)、病毒研究等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。如來(lái)源自草地貪夜蛾(spodoptera?frugiperda)的sf9和sf21細(xì)胞，來(lái)源自粉紋夜蛾(trichoplusia?ni)的high?five細(xì)胞，來(lái)源自果蠅(drosophilamelanogaster)的d.mel-2細(xì)胞等。而在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中，外源性病毒被認(rèn)為是一個(gè)主要的安全性問(wèn)題，因此檢測(cè)生物制品乃至生產(chǎn)用細(xì)胞系中的外源病毒因子污染顯得尤為重要。

2、常見(jiàn)的感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的dna病毒包括桿狀病毒科、囊泡病毒科、多分dna病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科等，其中具有代表性的包括隸屬于桿狀病毒科的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(acmnpv)和家蠶核型多角體病毒(bmnpv)，煙芽夜蛾囊泡病毒3h毒株、黑腿絨繭蜂病毒，以及被報(bào)道感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的帶喙伊蚊虹彩病毒、二化螟虹彩病毒、桑燈蛾痘病毒和棉鈴蟲(chóng)痘病毒等。

3、傳統(tǒng)基于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(elisa)的血清學(xué)檢測(cè)法以及基于核酸分析的pcr檢測(cè)法都存在一定的局限性，前者需要了解病毒的血清學(xué)特性，并針對(duì)某種或某類(lèi)病毒的特異性檢測(cè)，后者同樣需要了解病毒的基因組結(jié)構(gòu)、核酸序列等。大部分的檢測(cè)方法都存在操作繁瑣，耗時(shí)，靈敏度差，特異性差，僅能檢測(cè)某種或某一類(lèi)病毒，不同病毒檢測(cè)條件及程序相差較大，無(wú)法滿(mǎn)足多種病毒同時(shí)檢測(cè)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物、方法及試劑盒，可以準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)樣品中的昆蟲(chóng)病毒。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物，所述檢測(cè)組合物包括檢測(cè)如下dna病毒的引物和探針：

4、檢測(cè)桿狀病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：1所示，下游引物如seq?idno：2所示，探針如seq?id?no：3所示；

5、檢測(cè)囊泡病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：4所示，下游引物如seq?idno：5所示，探針如seq?id?no：6所示；

6、檢測(cè)多分dna病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：7所示，下游引物如seqid?no：8所示，探針如seq?id?no：9所示；

7、檢測(cè)虹彩病毒的兩組引物和探針：上游引物如seq?id?no：10所示，下游引物如seqid?no：11所示，探針如seq?id?no：12所示；以及上游引物如seq?id?no：13所示，下游引物如seq?id?no：14所示，探針如seq?id?no：15所示；

8、檢測(cè)痘病毒的兩組引物和探針：上游引物如seq?id?no：16所示，下游引物如seqid?no：17所示，探針如seq?id?no：18所示；以及上游引物如seq?id?no：19所示，下游引物如seq?id?no：20所示，探針如seq?id?no：21所示。

9、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含上述檢測(cè)組合物。

10、探針熒光報(bào)告基團(tuán)可選擇fam、vic或cy5，熒光淬滅基團(tuán)選擇bhq1或bhq2，

11、在以上技術(shù)方案中，所述檢測(cè)試劑盒包含陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品以及熒光定量pcr反應(yīng)試劑。

12、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑為熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液，包括探針?lè)╭pcr專(zhuān)用試劑premix?ex?taq、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無(wú)核酶水、以及上述檢測(cè)組合物。

13、在以上技術(shù)方案中，所述陽(yáng)性對(duì)照品包含陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，濃度均為2×108copies/μl。

14、在以上技術(shù)方案中，所述檢測(cè)試劑盒中的熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測(cè)樣品的dna、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

15、在以上技術(shù)方案中，所述反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。

16、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法非診斷或治療目的，包括如下步驟：

17、(1)提取待測(cè)樣品的dna模板；

18、(2)采用上述檢測(cè)組合物建立熒光定量pcr反應(yīng)體系；

19、(3)進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)；

20、(4)待測(cè)樣品的結(jié)果分析。

21、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測(cè)樣品的dna、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液包括探針?lè)╭pcr專(zhuān)用試劑premix?ex?taq、rox?referencedye內(nèi)參染料、無(wú)核酶水、以及上述檢測(cè)組合物。

22、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。

23、本發(fā)明的有益效果在于：

24、1、本發(fā)明篩選設(shè)計(jì)引物時(shí)分別選取病毒基因組保守序列，有較強(qiáng)的特異性；可檢出絕大部分亞型的病毒。

25、2、本發(fā)明所述檢測(cè)組合物，其中探針熒光報(bào)告基團(tuán)可選擇fam、vic或cy5，熒光淬滅基團(tuán)選擇bhq1或bhq2，即可滿(mǎn)足檢測(cè)上述任意一種的dna病毒，同時(shí)可檢測(cè)任意組合的dna病毒。

26、3、通過(guò)對(duì)病毒保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)探針引物，最終篩選特異性好、靈敏度高的引物探針，可準(zhǔn)確定量4×106copies/μl至4copies/μl的病毒含量，所有病毒檢測(cè)靈敏度均能達(dá)到4copies/μl，部分病毒最低靈敏度可達(dá)2copies/μl。

27、4、本發(fā)明所述檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的檢測(cè)試劑盒，含有用于檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)對(duì)qpcr檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)試，引物特異性強(qiáng)，且引物探針間不具有交叉反應(yīng)，通過(guò)探針上攜帶不同熒光報(bào)告基團(tuán)，能夠滿(mǎn)足在一個(gè)程序里同時(shí)檢測(cè)多種dna病毒。

28、5、通過(guò)反復(fù)篩選優(yōu)化反應(yīng)體系，包括引物和探針的濃度，最終該檢測(cè)方法需要的樣本量極少，每次檢測(cè)最低僅需5μl核酸樣本且依然能穩(wěn)定檢出。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物，其特征在于：所述檢測(cè)組合物包括檢測(cè)如下dna病毒的引物和探針：

2.一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒包含權(quán)利要求1所述檢測(cè)組合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒包含陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品以及熒光定量pcr反應(yīng)試劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑為熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液，包括探針?lè)╭pcr專(zhuān)用試劑premix?ex?taq、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無(wú)核酶水、以及權(quán)利要求1所述檢測(cè)組合物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述陽(yáng)性對(duì)照品包含陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，濃度均為2×108copies/μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述檢測(cè)試劑盒中的熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測(cè)樣品的dna、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。

8.一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種dna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法，其特征在于：所述檢測(cè)方法非診斷或治療目的，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)方法，其特征在于：所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測(cè)樣品的dna、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液包括探針?lè)╭pcr專(zhuān)用試劑premix?extaq、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無(wú)核酶水、以及權(quán)利要求1所述檢測(cè)組合物。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)方法，其特征在于：所述熒光定量pcr反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種DNA病毒的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)組合物、方法及試劑盒，該檢測(cè)方法非診斷或治療目的，包括如下步驟：(1)提取待測(cè)樣品的DNA模板；(2)采用本發(fā)明所述檢測(cè)組合物建立熒光定量PCR反應(yīng)體系；(3)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)；(4)待測(cè)樣品的結(jié)果分析。本發(fā)明引物特異性強(qiáng)，且引物探針間不具有交叉反應(yīng)，通過(guò)探針上攜帶不同熒光報(bào)告基團(tuán)，能夠滿(mǎn)足在一個(gè)程序里同時(shí)檢測(cè)多種DNA病毒。另外，通過(guò)反復(fù)篩選優(yōu)化反應(yīng)體系，包括引物和探針的濃度，最終該檢測(cè)方法需要的樣本量極少，每次檢測(cè)最低僅需5μL核酸樣本且依然能穩(wěn)定檢出。

技術(shù)研發(fā)人員：吳濤,曾煒佳,高志建,陳惠,胡孟軍,朱向瑩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江恒馭生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2