本發(fā)明涉及體外診斷，具體涉及一種谷氨酸測定試劑盒及測定方法。

背景技術(shù)：

1、谷氨酸（glutamic?acid,?glu）是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有重要意義。谷氨酸是蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分，谷氨酸鹽在自然界普遍存在的。多種食品以及人體內(nèi)都含有谷氨酸鹽，它既是蛋白質(zhì)或肽的結(jié)構(gòu)氨基酸之一，又是游離氨基酸。glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最高的一種興奮性氨基酸。在腦的發(fā)育過程中，glu可以易化ca2+的運(yùn)輸，對神經(jīng)元的分化、遷移、生長和生存過程中具有重要的生理作用，它既參與學(xué)習(xí)、記憶、突觸可塑性調(diào)節(jié)等一系列復(fù)雜的生理過程，又與神經(jīng)細(xì)胞死亡及精神性疾病、神經(jīng)性疾病等的發(fā)病密切相關(guān)，如癲癇、精神分裂癥、帕金森癥、阿爾茨海默癥等。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血、腦梗死、偏頭痛等病理情況下，腦內(nèi)glu濃度升高的同時(shí)，血液中g(shù)lu也會相應(yīng)升高，故測定血液中g(shù)lu變化可反映腦組織損害的進(jìn)展情況。另外，定量檢測血液中的glu在健康評估及藥物篩選方面也具有重要意義。

2、常規(guī)不同的分析方法已經(jīng)應(yīng)用于谷氨酸的檢測，例如高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、熒光檢測法、化學(xué)發(fā)光法，其中最常用的是高效液相色譜法。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。高效液相色譜具有分離效率高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”，在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。

3、因此，尋找新的且高效、準(zhǔn)確度高、簡便可行的谷氨酸含量測定方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種谷氨酸測定試劑盒及測定方法，以實(shí)現(xiàn)簡便、準(zhǔn)確且可靠地檢測血液樣品中的谷氨酸含量。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種谷氨酸測定試劑盒，包括r1試劑和r2試劑；其中，

4、r1試劑由第一緩沖液、4-氨基安替比林（4-aap）、谷氨酸氧化酶（l-glutamateoxidase?,?glod）、抗壞血酸酶（aso酶）、表面活性劑、穩(wěn)定劑和防腐劑組成；上述第一緩沖液選自3-(n-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸（mopso）、3-嗎啉丙磺酸（mops）、哌嗪-n,n’-雙(2-乙磺酸)（pipes）、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀中的一種或幾種，且其濃度為50mmol/l~150mmol/l，ph為6.5~7.5；

5、r2試劑由第二緩沖液、顯色底物、過氧化物酶（pod）和防腐劑組成。

6、優(yōu)選地，在上述谷氨酸測定試劑盒中，r1試劑由第一緩沖液、0.1g/l~2g/l?4-氨基安替比林、1ku/l~10ku/l谷氨酸氧化酶、1ku/l~6ku/l抗壞血酸氧化酶、0.1%~0.5%（g/l）表面活性劑、1g/l~50g/l穩(wěn)定劑和0.1%~1.0%（g/l）防腐劑組成。

7、在上述谷氨酸測定試劑盒中，表面活性劑選自曲拉通x-100、曲拉通x-405、聚氧乙烯蓖麻油（cremophor?el）、丙二醇嵌段聚醚（pluranic?l64）、聚氧乙烯月桂醚（brij?35）、吐溫-80（tween-80）和吐溫-20（tween-20）中的一種或幾種。

8、在上述谷氨酸測定試劑盒中，穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白（bsa）、乙二胺四乙酸二鈉（edta-2na）、乙二胺四乙酸二鉀（edta-2k）、蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一種或幾種。

9、優(yōu)選地，在上述谷氨酸測定試劑盒中，r2試劑由第二緩沖液、1g/l~5g/l顯色底物、10ku/l~20ku/l過氧化物酶和0.1%~1.0%（g/l）防腐劑組成；其中，第二緩沖液選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸（hepes）、n-三羥甲基甲基-2-氨基乙磺酸（tes）、n-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸（taps）、三羥甲基氨基甲烷（tris）和n,n-二羥乙基甘氨酸（bicine）中的一種或幾種，且其濃度為50mmol/l~150mmol/l，ph為7.5~8.5。

10、在上述谷氨酸測定試劑盒中，顯色底物選自n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽（toos）、n-乙基-n-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽（tops）、3,5-二氯-2-羥基苯磺酸鈉（dhbs）、n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉鹽（daos）、n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉鹽（hdaos）、3,5二氯-2-羥基苯磺酸（dhba）和n-乙基(2-羥-3-磺丙基)-3,5二甲氧基-4-氟苯胺（f-daos）中的一種或幾種。

11、優(yōu)選地，在上述谷氨酸測定試劑盒中，防腐劑為疊氮化鈉和/或proclin300。

12、第二方面，本發(fā)明提供了一種上述谷氨酸測定試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

13、r1試劑的配制：配制50mmol/l～150mmol/l且ph為6.5～7.5的第一緩沖液，向第一緩沖液中依次加入顯色劑4-aap、glod、aso酶、表面活性劑、穩(wěn)定劑和防腐劑，定容后混勻，即得到r1試劑；

14、r2試劑的配制：配制第二緩沖液，向第二緩沖液中依次加入顯色底物、pod和防腐劑，定容后混勻，即得到r2試劑。

15、第三方面，本發(fā)明提供了一種利用上述谷氨酸測定試劑盒對谷氨酸進(jìn)行定性和/或定量測定的方法，包括以下步驟：

16、將待測樣本與r1試劑孵育后，測定吸光度a1；再加入r2試劑孵育后，測定吸光度a2；計(jì)算吸光度差值，根據(jù)兩點(diǎn)定標(biāo)法計(jì)算出待測樣本中谷氨酸的含量。

17、在上述方法中，待測樣本包括但不限于為血清樣本。

18、在本發(fā)明的方案中，所用谷氨酸氧化酶是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）為輔基的黃素蛋白酶類，其可以專一地氧化谷氨酸生成α-酮戊二酸、氨和過氧化氫；待測樣本中的谷氨酸與谷氨酸氧化酶反應(yīng)，在色原性氧受體4-氨基安替比林偶聯(lián)酚的存在下，過氧化物酶催化過氧化氫，氧化色素原，生成紅色醌類化合物，其顏色深淺與谷氨酸濃度成正比，與經(jīng)過同樣處理的校準(zhǔn)品進(jìn)行比較，即可計(jì)算出樣品中谷氨酸的含量。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

20、本發(fā)明利用谷氨酸氧化酶對催化反應(yīng)底物有高度的立體異構(gòu)選擇性以及催化效率高的特點(diǎn)，構(gòu)建了一種新型谷氨酸測定試劑盒和測定方法，該試劑盒制備過程簡單且原料易于采購、成本低，該方法具有不依賴大型儀器、操作簡單、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，對于基層檢測、大規(guī)模樣品批量檢測等具有重要意義。

21、基于上述谷氨酸氧化酶催化以及4-氨基安替比林顯色原理，本發(fā)明在大量探索實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過在合適的緩沖液濃度和ph范圍內(nèi)，確定適宜濃度的色原底物和顯色劑，并添加適宜濃度的表面活性劑，使得所制備的谷氨酸測定試劑盒準(zhǔn)確度、精密度和開瓶穩(wěn)定性得到明顯提高，達(dá)到了準(zhǔn)確、可靠檢測谷氨酸的目的。