本發(fā)明涉及海洋生物活性肽，具體涉及太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、高血壓是近年來影響我國居民健康的常見慢性疾病之一，其以動脈血壓持續(xù)升高為主要臨床特征，是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、心力衰竭等心腦血管疾病的重要危險因素。在未使用降壓藥物的情況下，三次非同日測量血壓值均高于正常，即收縮壓≥140mmhg或舒張壓≥90mmhg，即考慮為高血壓。

2、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-i?converting?enzyme，ace，ec?3.2.1.41)在調(diào)節(jié)血壓平衡中發(fā)揮重要作用，其通過將血管緊張素ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素ⅱ(血管收縮劑)、使具有舒張血管作用的緩激肽失活、促進(jìn)醛固酮分泌而引起血壓升高，通過抑制ace活性可以達(dá)到治療高血壓的效果。目前臨床使用的降血壓藥物如卡托普利和依那普利等化學(xué)合成的ace抑制劑具有明顯治療效果，但長期服用易引發(fā)腎臟損害、血管水腫、高血鉀癥等不良反應(yīng)，尋找天然來源且安全可靠的ace抑制劑顯得尤為迫切。

3、生物活性肽具有多種生理學(xué)功能，可分為抗氧化肽、免疫活性肽、降壓肽、降尿酸肽、抗菌肽等。與化學(xué)合成ace抑制劑相比，食源性多肽類ace抑制劑具有安全性更高、生理活性更強、吸收效果更好等優(yōu)勢，能夠為預(yù)防和治療高血壓提供新的途徑。

4、我國是世界上最重要的魷魚生產(chǎn)、加工和消費國家之一。據(jù)《2023年全國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)統(tǒng)計公報》數(shù)據(jù)顯示，2023年我國頭足類捕撈產(chǎn)量59.36萬t，在遠(yuǎn)洋漁業(yè)捕撈總產(chǎn)量中占比達(dá)到25.56％。近年來，我國魷魚年加工量保持在40萬t～50萬t，行業(yè)產(chǎn)值超百億元。魷魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展質(zhì)量影響著我國遠(yuǎn)洋捕撈業(yè)和水產(chǎn)品加工業(yè)的提質(zhì)升級，然而目前捕獲的魷魚主要用來加工生產(chǎn)魷魚絲、魷魚干、魷魚脆片等初級加工產(chǎn)品，精深加工利用程度較低。此外，在魷魚初級加工產(chǎn)品生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物，包括內(nèi)臟團(tuán)、皮、眼等，約達(dá)到魷魚總重量的25％左右，而該部分資源通常只被簡單加工為魷魚膏、魷魚油等產(chǎn)品或直接應(yīng)用于飼料行業(yè)，尚未被最有效加工利用，造成資源浪費和環(huán)境污染等問題，一定程度上影響著產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。太平洋褶柔魚(todarodes?pacificus)，又稱太平洋斯氏柔魚、日本飛魷魚，主要分布于西北太平洋海域，資源量豐富，是我國主要的魷魚經(jīng)濟(jì)品種。在太平洋褶柔魚加工過程中所產(chǎn)生的內(nèi)臟團(tuán)，蛋白質(zhì)含量約可達(dá)到干重的50％左右，并且氨基酸組成符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織規(guī)定的優(yōu)質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)，是制備生物活性肽的良好原料?？茖W(xué)利用太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)中的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，開發(fā)多肽類ace抑制劑，可為推進(jìn)實現(xiàn)魷魚資源綜合高值全利用提供新途徑，可為食源性多肽類降壓產(chǎn)品的研制拓展新思路，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽，另一目的是提供其制備方法和具體應(yīng)用，以彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。

2、為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、一種太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽，該ace抑制肽包括：gfagddapr、或gtalp、或wcpspd、或svptdv、或gvavp、或lgglp、或svavp、或svienp其中的一種。

4、其中，gfagddapr具體序列為seq?no.1：

5、gly-phe-ala-gly-asp-asp-ala-pro-arg；

6、gtalp具體序列為seq?no.2：gly-thr-ala-leu-pro；

7、wcpspd具體序列為seq?no.3：trp-cys-pro-ser-pro-asp；

8、svptdv具體序列為seq?no.4：ser-val-pro-thr-asp-val；

9、gvavp具體序列為seq?no.5：gly-val-ala-val-pro；

10、lgglp具體序列為seq?no.6：leu-gly-gly-leu-pro；

11、svavp具體序列為seq?no.7：ser-val-ala-val-pro；

12、svienp具體序列為seq?no.8：ser-val-ile-glu-asn-pro。

13、優(yōu)選的，一種太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽，該ace抑制肽包括：gfagddapr、或gtalp、或wcpspd、或svptdv。

14、一種太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽的制備方法，包括以下步驟：

15、(1)原料預(yù)處理；

16、(2)酶解；

17、(3)高溫滅酶；

18、(4)固液分離得到太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)酶解上清液；

19、(5)將所述步驟(4)所得的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)酶解上清液進(jìn)行脫鹽處理，處理液經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥，得到太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)酶解液干燥粉，即太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物1；

20、(6)對所述步驟(5)所得的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物1，使用去離子水復(fù)溶后進(jìn)行純化，選用超濾法，收集截留液，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥即得初步純化后的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物2；

21、(7)對所述步驟(6)所得的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物2，使用去離子水復(fù)溶后進(jìn)行再次純化，選用凝膠過濾層析法，收集層析分離組分，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥即得太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物3；

22、(8)經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用方法對所述步驟(7)所得的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物3進(jìn)行鑒定，最終得到8種太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽：gfagddapr、gtalp、wcpspd、svptdv、gvavp、lgglp、svavp、svienp。

23、作為優(yōu)選的，所述步驟(1)中將太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)按照料液比1:4～1:8g/ml加入緩沖液并混勻，通過高速剪切勻漿法使太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)充分均質(zhì)化，處理時間1～15min；優(yōu)選料液比1:6，處理時間5min。

24、作為優(yōu)選的，所述步驟(2)進(jìn)行酶解，調(diào)節(jié)緩沖液ph?2.0～12.0，根據(jù)底物質(zhì)量加入200～8000u/g的蛋白酶啟動酶解反應(yīng)，酶解時間為1～6h，酶解溫度為25～75℃；所述蛋白酶選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或多種混合；優(yōu)選堿性蛋白酶，添加量4000u/g，酶解ph?7.5，酶解時間3.5h，酶解溫度55℃。

25、作為優(yōu)選的，所述步驟(3)中的滅酶溫度為90～100℃，滅酶時間為10～20min；優(yōu)選滅酶溫度100℃，滅酶時間20min。

26、作為優(yōu)選的，所述步驟(4)中的離心速度為3000～8000r/min，離心時間10～30min；優(yōu)選離心速度為7500r/min，離心時間20min。

27、作為優(yōu)選的，所述步驟(5)中的脫鹽方法為：將太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)酶解上清液使用截留分子量為200da的納濾膜進(jìn)行脫鹽，處理壓力0.6～1.4mpa，循環(huán)處理1～5次；優(yōu)選處理壓力1.2mpa，循環(huán)處理3次。

28、作為優(yōu)選的，所述步驟(6)中的超濾條件為：將太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物1使用去離子水復(fù)溶至質(zhì)量濃度0.5～10g/l的溶液，采用截留分子量為1kda或3kda或5kda的超濾膜進(jìn)行超濾處理，處理壓力0.5～1.5mpa，處理量0.5～10l/h；優(yōu)選溶液質(zhì)量濃度5g/l，超濾膜截留分子量為1kda，處理壓力1.0mpa，處理量3l/h。

29、作為優(yōu)選的，所述步驟(7)中的凝膠過濾層析條件為：將太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽混合物2使用去離子水復(fù)溶至質(zhì)量濃度10～100mg/ml的溶液，采用akta蛋白分離純化系統(tǒng)經(jīng)葡聚糖凝膠sephadex?g-15進(jìn)行純化，上樣量1～10ml，洗脫液為去離子水，洗脫流速為0.2～1.0ml/min；優(yōu)選溶液質(zhì)量濃度30mg/ml，上樣量5ml，洗脫流速為0.5ml/min。

30、作為優(yōu)選的，所述步驟(8)液質(zhì)聯(lián)用方法具體包括如下步驟：

31、1)樣品前處理：太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽3進(jìn)行脫鹽處理，真空冷凍干燥后復(fù)溶，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行檢測；

32、2)儀器檢測條件：進(jìn)樣到c18毛細(xì)管捕獲柱(100μm×20mm，5μm，dr.maisch?gmbh)后經(jīng)過c18分離柱(75μm×150mm，3μm，dr.maisch?gmbh)進(jìn)行梯度分離；流動相a為0.1％(v/v)甲酸溶液，流動相b為80％(v/v)的乙腈溶液(含0.1％甲酸)；色譜柱以92％的流動相a充分平衡后進(jìn)行梯度洗脫，0min?a與b體積比92:8，98min?a與b體積比為76:28，113min?a與b體積比為63:37，117min?a與b體積比為0:100，120min?a與b體積比為0:100，125min?a與b體積比為92:8，130min洗脫程序結(jié)束；流速為300nl/min；進(jìn)樣量1μl；檢測模式：正離子模式。

33、3)多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(full?scan)后采集20個碎片圖譜(ms2?scan)；掃描范圍：400～1800m/z；一級分辨率：60000@m/z200，二級分辨率：150000@m/z200；碰撞能ce28ev。

34、所述太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽在制備抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)制品中的應(yīng)用；所述制品包括普通食品、保健食品、藥品等。

35、所述太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽在制備降血壓功效制品中的應(yīng)用；所述制品包括普通食品、保健食品、藥品等。

36、本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

37、本發(fā)明利用太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)制備ace抑制肽，所獲得的多肽具有優(yōu)異的ace抑制活性。通過質(zhì)譜鑒定，共篩選得到了8種小分子多肽：gfagddapr、gtalp、wcpspd、svptdv、gvavp、lgglp、svavp和svienp，這8種多肽具有不同程度的ace抑制活性。

38、本發(fā)明制備獲得的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽，其ace抑制能力是目前已確認(rèn)的太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)蛋白肽ace抑制能力的幾倍甚至幾十倍，具有優(yōu)異的ace抑制效果。太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)ace抑制肽能夠應(yīng)用于普通食品、保健食品、藥品等領(lǐng)域。本發(fā)明對太平洋褶柔魚內(nèi)臟團(tuán)這一加工副產(chǎn)物資源進(jìn)行高值精準(zhǔn)利用，能夠有效提高資源利用率和產(chǎn)業(yè)價值。