本發(fā)明涉及植物病理學(xué)，具體為一種基于分子標(biāo)記的芝麻枯萎病鑒定方法。

背景技術(shù)：

1、芝麻作為一種重要的油料作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植，但是芝麻枯萎病的頻繁發(fā)生給芝麻的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來了嚴(yán)重威脅，芝麻枯萎病是由多種病原菌引起的病害，其發(fā)病過程復(fù)雜，早期癥狀不明顯，一旦病情加重，往往會導(dǎo)致芝麻植株大面積死亡，給種植戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，準(zhǔn)確、快速地鑒定芝麻枯萎病對于及時采取防治措施、保障芝麻生產(chǎn)至關(guān)重要。

2、然而，在芝麻枯萎病的鑒定方法中，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和病原菌分離培養(yǎng)方法，在形態(tài)學(xué)觀察往往依賴于經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員，主觀性較強(qiáng)，且在病害早期難以準(zhǔn)確判斷，病原菌分離培養(yǎng)則耗時較長，操作復(fù)雜，容易受到環(huán)境因素的干擾，而現(xiàn)有的基于分子標(biāo)記的鑒定方法，大多采用常規(guī)的dna片段或短鏈rna作為分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記在特異性和靈敏度方面存在不足，與其他病害和非病害狀態(tài)下的芝麻植株存在一定的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致誤判，同時，傳統(tǒng)的鑒定方法通常采用已知的蛋白質(zhì)編碼基因作為標(biāo)記，這些方法往往不能精確地反映疾病的早期狀態(tài)。

3、綜上所述，現(xiàn)有的芝麻枯萎病鑒定方法難以滿足實(shí)際生產(chǎn)中對芝麻枯萎病快速、精準(zhǔn)鑒定的需求，因此，開發(fā)一種新的基于特定長鏈非編碼rna作為分子標(biāo)記的芝麻枯萎病鑒定方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，為芝麻枯萎病的防治提供更加可靠的技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于分子標(biāo)記的芝麻枯萎病鑒定方法，它能夠通過采用特定長鏈非編碼lncrna作為分子標(biāo)記，這些lncrna具有高度的序列特異性和表達(dá)特異性，能夠更準(zhǔn)確地反映芝麻枯萎病的發(fā)生情況，通過pcr擴(kuò)增、高通量測序，在較短時間內(nèi)完成大量樣本的檢測，大大提高了鑒定效率，實(shí)現(xiàn)對芝麻枯萎病的早期預(yù)測和快速響應(yīng)，有助于及時采取防控措施，減少病害損失。

2、本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，提供如下技術(shù)方案：一種基于分子標(biāo)記的芝麻枯萎病鑒定方法，該鑒定方法包括以下步驟：

3、s100，rna提取與純化：從待測芝麻樣本中提取總dna和蛋白質(zhì)污染rna，采用高效的rna提取試劑盒，對提取的rna進(jìn)行純化，通過去除存在的雜質(zhì)和抑制劑，以保證后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和pcr擴(kuò)增的效率；

4、s200，反轉(zhuǎn)錄與cdna合成：利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將純化后的rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，在反轉(zhuǎn)錄過程中，使用針對lncrna-x123設(shè)計的特異性引物和酶，對合成的cdna進(jìn)行質(zhì)量檢測和濃度測定，通過電泳法，使其滿足pcr擴(kuò)增的要求；

5、s300，pcr擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測：合成針對特定lncrna的引物對準(zhǔn)確擴(kuò)增出目標(biāo)lncrna片段，以cdna為模板，利用特定的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過優(yōu)化pcr反應(yīng)條件，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測，包括產(chǎn)物大小、純度和濃度；

6、s400，測序與數(shù)據(jù)分析：對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到特定lncrna的序列信息，與已知的芝麻枯萎病相關(guān)lncrna序列進(jìn)行比對和分析，對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，以得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果；

7、s500，鑒定結(jié)果判斷：根據(jù)比對結(jié)果，判斷待測芝麻樣本是否感染枯萎病，測序結(jié)果與已知的芝麻枯萎病相關(guān)lncrna序列一致，則判斷待測芝麻樣本感染枯萎病，并設(shè)置多個特定的lncrna分子標(biāo)記進(jìn)行聯(lián)合鑒定，檢驗(yàn)鑒定的靈敏度和特異性。

8、更進(jìn)一步地，所述s100的具體步驟為：

9、s101，樣本準(zhǔn)備與組織破壞：選取健康的和已知感染枯萎病的芝麻植株作為待測樣本，迅速冷凍保存在液氮中，將冷凍的芝麻組織取出，在液氮中研磨成粉末狀；

10、s102，rna提取：使用rna提取試劑盒trizol試劑，加入裂解液到研磨后的組織中，使細(xì)胞裂解并釋放出rna，通過離心操作去除細(xì)胞碎片和不溶物，得到含有rna的上清液，使用紫外分光光度計測定rna濃度和純度；

11、s103，去除dna污染：在上清液中加入dna酶，以去除殘留的dna，通過熱失活和加入抑制劑方法使dna酶失活；

12、s104，rna純化：使用柱狀純化試劑盒進(jìn)一步純化rna，去除提取過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和抑制劑，通過紫外分光光度計再次測定純化后的rna濃度和純度；

13、s105，rna沉淀與洗滌：加入異丙醇和乙醇沉淀劑，使rna沉淀下來，通過離心收集rna沉淀，并用75％乙醇洗滌以去除殘留的鹽和小分子雜質(zhì)。

14、更進(jìn)一步地，所述s100rna提取與純化通過紫外分光光度計測定rna的a260/a280比值和a260/a230比值，以評估rna的純度，其中，對于a260/a280比值接近2.0，a260/a230比值接近2.0-2.2時，認(rèn)為rna質(zhì)量良好，將提取和純化后的rna儲存在-80℃條件下，以防止rna降解并為反轉(zhuǎn)錄和pcr擴(kuò)增使用。

15、更進(jìn)一步地，所述s200反轉(zhuǎn)錄與合成的具體步驟為：

16、s201，反轉(zhuǎn)錄體系準(zhǔn)備：根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄所需的反應(yīng)體系，包括反轉(zhuǎn)錄酶、針對lncrna-x123設(shè)計特異性引物、rna酶抑制劑、脫氧核糖核苷三磷酸以及緩沖液；

17、s202，rna模板加入：將純化后并經(jīng)過質(zhì)量評估的rna樣本加入到反轉(zhuǎn)錄體系中；

18、s203，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：對含有rna模板的反轉(zhuǎn)錄體系設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使rna完全反轉(zhuǎn)錄為cdna；

19、s204，cdna質(zhì)量評估與濃度測定：對反轉(zhuǎn)錄得到的cdna進(jìn)行初步的質(zhì)量評估，使用分光光度計測定cdna的濃度，同時，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察cdna的完整性和大小分布，檢查是否有降解和非特異性產(chǎn)物的存在；

20、s205，cdna存儲：將質(zhì)量合格的cdna樣本存儲在-20℃，以防止降解并備pcr擴(kuò)增使用。

21、更進(jìn)一步地，所述s203反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將純化后的rna樣品與特異性引物混合，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒加入反轉(zhuǎn)錄酶，設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為65℃，預(yù)熱為5分鐘以使rna變性，隨后置于冰上冷卻，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置反應(yīng)溫度和時間為42℃和1小時，并70℃加熱15分鐘以終止反應(yīng)，通過s204使用紫外分光光度計測定cdna的濃度和純度，使cdna的a260/a280比值接近2.0，即cdna純度較高，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查cdna的質(zhì)量，確保沒有降解現(xiàn)象。

22、更進(jìn)一步地，所述s300pcr擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測的具體步驟為：

23、s301，pcr反應(yīng)體系準(zhǔn)備：在無菌的pcr管中，依次加入cdna模板、特異性引物對、dna聚合酶、緩沖液、dntps和無菌水，組成pcr反應(yīng)體系；

24、s302，pcr反應(yīng)條件設(shè)置：根據(jù)引物和dna聚合酶的特性，設(shè)置pcr反應(yīng)條件，包括預(yù)變性溫度和時間、變性溫度和時間、退火溫度和時間、延伸溫度和時間以及循環(huán)次數(shù)；

25、s303，pcr擴(kuò)增反應(yīng)：將pcr反應(yīng)體系放入pcr儀中，設(shè)定的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，觀察pcr儀的運(yùn)行狀態(tài)；

26、s304，產(chǎn)物檢測初步觀察：pcr擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出一部分產(chǎn)物進(jìn)行初步觀察，觀察pcr管中產(chǎn)物的顏色變化和渾濁度，初步判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn)物生成；

27、s305，瓊脂糖凝膠電泳檢測：制備瓊脂糖凝膠，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，在電泳過程中，控制電壓和時間，通過觀察電泳結(jié)果，判斷pcr產(chǎn)物的條帶位置與已知的目標(biāo)產(chǎn)物大小進(jìn)行對比，確定是否為正確的擴(kuò)增產(chǎn)物；

28、s306，產(chǎn)物濃度測定：使用分光光度計，測定pcr產(chǎn)物的濃度，根據(jù)測定結(jié)果，判斷pcr反應(yīng)的效率和產(chǎn)物的產(chǎn)量。

29、更進(jìn)一步地，所述s303pcr擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)置pcr擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘、94℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分鐘、重復(fù)35個循環(huán)、以72℃延伸5分鐘以完成終延伸，將配置好的pcr反應(yīng)體系放入pcr儀中進(jìn)行擴(kuò)增，并將pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為100v電壓下運(yùn)行30分鐘，記錄條帶的位置和清晰度，以評估產(chǎn)物的純度。

30、更進(jìn)一步地，所述s400測序與數(shù)據(jù)分析選取測序深度、堿基質(zhì)量分布均勻度、低質(zhì)量堿基比例作為評估指標(biāo)，通過計算不同位置的堿基質(zhì)量對鑒定結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，即對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括去除接頭序列、過濾掉低質(zhì)量的堿基，計算相鄰堿基間的相關(guān)性以及每個堿基的背景頻率，提高測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估精度，其公式為：p(e|i是在位置i上發(fā)生錯誤的概率，f(bi)堿基b在位置i的背景頻率，δ是權(quán)重因子，用于調(diào)整相鄰位置堿基錯誤概率的影響程度，η是權(quán)重因子，用于調(diào)整相鄰位置堿基背景頻率的影響程度，q(i)是位置i的新質(zhì)量評分，通過考慮讀段長度和位置偏差因素，更準(zhǔn)確地估計每個位置的錯誤概率，即p(e|i)＝αe-β|i-μ|+γ，α是影響錯誤概率的基礎(chǔ)值，β是控制位置偏差對錯誤概率的影響程度，γ代表背景錯誤率，μ讀段的中心位置，引入一個讀段長度的函數(shù)l(i)，讀段長度對錯誤率的影響，即lmax是讀段的最大長度，通過考慮讀段長度對錯誤率的影響，準(zhǔn)確估計錯誤率。

31、更進(jìn)一步地，所述s400測序與數(shù)據(jù)分析通過考慮堿基的影響，準(zhǔn)確地估計每個位置的背景頻率，即f(bi)＝f0(bi)×(1+ω1f1(bi-1)+ω2f2(bi+1))，f0(bi)為沒有影響的基本背景頻率，f1(bi-1)是前一個堿基的背景頻率，f2(bi+1)使后一個堿基的背景頻率，ω1和ω2調(diào)節(jié)影響強(qiáng)度的權(quán)重因子，將上述算法應(yīng)用于測序數(shù)據(jù)上，計算每個讀段中每個堿基的新質(zhì)量評分，比較同一讀段中不同位置的質(zhì)量評分。

32、更進(jìn)一步地，所述s500鑒定結(jié)果判斷的具體步驟為：

33、s501，結(jié)果初步判斷：對于每個待測芝麻樣本，根據(jù)各個分子標(biāo)記的測序結(jié)果與已知序列的比對情況；

34、s502，不確定性處理：對于出現(xiàn)部分分子標(biāo)記結(jié)果不一致和結(jié)果處于模糊區(qū)間的情況，進(jìn)行進(jìn)一步的分析，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、增加樣本量；

35、s503，最終結(jié)果確定：綜合所有信息，包括各個分子標(biāo)記的結(jié)果、分析的結(jié)果以及對不確定性的處理結(jié)果，確定待測芝麻樣本是否感染枯萎病，以明確的報告形式呈現(xiàn)最終結(jié)果，包括樣本編號、各個分子標(biāo)記的具體情況以及最終的判斷結(jié)論。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，該一種基于分子標(biāo)記的芝麻枯萎病鑒定方法具備如下有益效果：

37、一、本發(fā)明采用特定長鏈非編碼rna作為分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分芝麻枯萎病與其他病害以及健康植株，通過數(shù)據(jù)分析，能夠大大降低誤判的概率，為芝麻枯萎病的準(zhǔn)確鑒定提供了可靠的保障，同時，特定長鏈非編碼rna在不同環(huán)境條件下具有較好的穩(wěn)定性，通過pcr擴(kuò)增、高通量測序，可以在較短時間內(nèi)完成大量樣本的檢測，大大提高了鑒定效率，實(shí)現(xiàn)對芝麻枯萎病的早期預(yù)測和快速響應(yīng)，有助于及時采取防控措施，減少病害損失。

38、二、本發(fā)明在核酸提取過程中，采用高效的rna提取試劑盒和純化方法，能夠在較短時間內(nèi)獲得高質(zhì)量的總rna，長鏈非編碼rna的檢測采用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測目標(biāo)分子標(biāo)記的存在與否及含量，結(jié)果判斷依據(jù)明確，能夠在短時間內(nèi)得出準(zhǔn)確的鑒定結(jié)論，這種快速高效的鑒定過程使得種植戶和農(nóng)技人員能夠及時了解芝麻植株的健康狀況，采取相應(yīng)的防治措施，最大限度地減少芝麻枯萎病帶來的損失。

39、本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進(jìn)行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。