本發(fā)明涉及用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)的pcr的引物對(duì)和探針，還涉及一種能夠鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr檢測試劑盒，屬于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，為外觀有囊膜的單股正鏈rna病毒。prrsv全長約為15kb，含10個(gè)開放閱讀框，其中由保守基因orf6所編碼的蛋白為m蛋白(membrane?protein,m?protein)，是糖基化的膜蛋白，也是prrsv中保守的結(jié)構(gòu)蛋白之一，長度約為18～19kda。ⅰ型prrsv和ⅱ型prrsv的m蛋白分別由173和174個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)由16個(gè)氨基酸殘基組成的短n末端外結(jié)構(gòu)域、三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由84個(gè)氨基酸殘基組成的c末端內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

2、prrsv野生毒株與重組毒株長期在中國流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖場經(jīng)濟(jì)效益。因此，防控prrsv急需快速高效、準(zhǔn)確靈敏的檢測手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的檢測引物對(duì)及探針；

2、本發(fā)明的目的之二是提供一種用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr檢測試劑盒。

3、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

4、本發(fā)明的一方面是提供用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的檢測引物對(duì)及探針，所述檢測引物對(duì)選自以下(1)-(5)任何一種所述的引物對(duì)：

5、(1)由seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)1；

6、(2)由seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)2；

7、(3)由seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)3；

8、(4)由seq?id?no.10和seq?id?no.11所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)4；

9、(5)由seq?id?no.13和seq?id?no.14所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)5；

10、所述的探針的核苷酸序列選自seq?id?no.3、seq?id?no.6、seq?idno.9、seq?idno.12或seq?id?no.15所示核苷酸序列中的任意一種。

11、本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實(shí)施方案，在探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，更優(yōu)選的，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)是fam熒光報(bào)告基團(tuán)；在探針的3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；其中，在seq?id?no.3、seq?id?no.6、seq?idno.12或seq?id?no.15所示的探針的3′端標(biāo)記有tamra熒光淬滅基團(tuán)，在seq?id?no.9所示的探針的3′端標(biāo)記有bhq1熒光淬滅基團(tuán)。

12、本發(fā)明對(duì)上述引物及探針的不同組合進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，應(yīng)用由seq?id?no.1和seq?id?no.2所示兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)1以及seq?id?no.3所示核苷酸序列的探針的組合鑒定豬繁殖與呼吸綜合征病毒ct值最低，特異性最強(qiáng)及敏感性最高。

13、本發(fā)明另一方面是提供一種鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr檢測試劑盒。包括：檢測引物對(duì)、探針、premix?ex?taq和雙蒸水；其中所述引物對(duì)優(yōu)選是由seq?id?no.1和seq?idno.2所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)1；所述探針優(yōu)選為seq?id?no.3所示的核苷酸序列。

14、本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr檢測試劑盒在鑒別鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的檢測方法，包括：提取待檢測樣品的dna；以待檢測樣品的dna為模板，采用引物與探針作為pcr引物建立pcr反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析；如果擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)308bp的條帶，說明待檢測的樣品中含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒；其中所述引物由seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)1；所述探針為seq?idno.3所示的核苷酸序列。

15、其中，所述鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr反應(yīng)體系包括：上、下游引物各0.4μl、探針0.8μl、premix?ex?taq?10μl、模板2μl、無酶滅菌水6.4μl；其中上、下游引物的核苷酸序列分別是seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的核苷酸序列；所述探針為seq?id?no.3所示的核苷酸序列。

16、所述鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr擴(kuò)增條件包括：95℃3min，98℃15s，55℃15s，70℃1min，72℃5min，4℃10min。

17、本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

18、本發(fā)明根據(jù)已報(bào)道和最新報(bào)道的美洲型與歐洲型豬繁殖與綜合征病毒各毒株基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和檢測探針，檢測引物及探針覆蓋的毒株來源、種類和范圍更廣，能夠有效解決現(xiàn)有prrsv試劑盒對(duì)prrsv的新的變異株或重組毒株檢測覆蓋力不足，降低了假陰性漏檢的可能。

19、本發(fā)明檢測試劑prrsv陽性檢出率為7％，但競品試劑prrsv陽性檢出率為4％。本發(fā)明的方法對(duì)真實(shí)樣本的檢測更為快速、且真實(shí)樣本的陽性檢出率更高。本發(fā)明的試劑盒較傳統(tǒng)的檢測試劑盒具有更高的陽性檢出率，存在顯著的優(yōu)勢。

技術(shù)特征：

1.用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的檢測引物對(duì)及探針，其特征在于，所述檢測引物對(duì)選自以下(1)-(5)任何一種所述的引物對(duì)：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)引物對(duì)及探針，其特征在于，所述引物對(duì)是由：seq?idno.1和seq?id?no.2所示的兩條核苷酸序列組成的引物對(duì)1；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測引物對(duì)及探針，其特征在于：在探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，在探針的3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測引物對(duì)及探針，其特征在于：所述的熒光報(bào)告基團(tuán)是fam熒光報(bào)告基團(tuán)；在seq?id?no.3、seq?id?no.6、seq?idno.12或seq?id?no.15所示的探針的3′端標(biāo)記有tamra熒光淬滅基團(tuán)，在seq?id?no.9所示的探針的3′端標(biāo)記有bhq1熒光淬滅基團(tuán)。

5.權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的檢測引物對(duì)及探針在制備檢測或診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株試劑或藥物中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株包括prrsv?nadc-30株或prrsv?nadc-34株；所述的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株包括：prrsvnandc-30株或prrsv?nadc-34株。

7.用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒株或重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的pcr檢測試劑盒，包括：檢測引物及探針；其特征在于，所述檢測引物及探針為權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的檢測引物及探針。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的pcr檢測試劑盒，其特征在于，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株包括prrsv?nadc-30株或prrsv?nadc-34株；所述的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒株包括：prrsv?nandc-30株或prrsv?nadc-34株。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了鑒別PRRSV的PCR檢測引物和探針及檢測試劑盒。本發(fā)明首先針對(duì)PRRSV保守基因ORF6設(shè)計(jì)并篩選得到特異性引物和探針，所述引物分別由SEQ?ID?No.1?2所示的兩條核苷酸序列組成，所述探針序列為SEQ?ID?No.3所示。本發(fā)明進(jìn)一步公開用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的TaqMan熒光定量PCR檢測試劑盒，包括：特異性引物、TaqMan探針及陽性對(duì)照。應(yīng)用本發(fā)明提供的特異性引物和探針可以快速準(zhǔn)確鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒，具有良好的敏感性和特異性，有效解決現(xiàn)有檢測方法對(duì)PRRSV的新的變異株或重組毒株檢測覆蓋力不足的缺陷，降低了假陰性漏檢的可能。

技術(shù)研發(fā)人員：周晗,田知鑫,崔進(jìn)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30