本發(fā)明涉及培養(yǎng)基制備，具體地說，涉及海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基及分離純化方法。

背景技術(shù)：

1、海洋甲殼類動(dòng)物，作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一環(huán)，以其多樣的種類和獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)在食物鏈中扮演著重要角色，然而，在這些看似堅(jiān)不可摧的甲殼之下，也潛藏著微生物世界，其中就包括了支原體這一微小卻不可忽視的生物群體，支原體作為一類原核微生物，以其獨(dú)特的生物學(xué)特性和廣泛的宿主范圍而著稱，在海洋甲殼類動(dòng)物體內(nèi)，支原體能夠利用宿主提供的營養(yǎng)和環(huán)境條件進(jìn)行生長繁殖，同時(shí)對宿主的健康狀況產(chǎn)生影響，引發(fā)宿主的感染癥狀，如生長遲緩、死亡率增加等。

2、然而現(xiàn)有的支原體培養(yǎng)基組分單一，易于出現(xiàn)其他微生物污染培養(yǎng)基，限制支原體的增長，活菌滴度低，并且有關(guān)海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基的相關(guān)研究較少，鑒于此，我們提出海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基及分離純化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基及分離純化方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基，包括以下組分：復(fù)合促生長劑1-3重量份、蛋白胨6-8重量份、酵母提取物3-5重量份、葡萄糖1-5重量份、牛血清10-20重量份、磷酸鹽緩沖液12-15重量份、β-巰基乙醇0.2-0.4重量份、紅景天提取物0.12-0.42重量份和dtpa螯合劑1.2-2.5重量份；其中，復(fù)合促生長劑由螺旋藻和海膽按質(zhì)量比為1：0.05～0.07混合酶解，再與磷脂酸復(fù)合而成。

3、作為優(yōu)選，所述復(fù)合促生長劑的制備方法如下：

4、使用勻漿機(jī)分別將預(yù)處理好的海膽和螺旋藻破碎成漿狀，然后按照比例混合兩種原料的漿狀物，經(jīng)粉碎和滅菌后，加入到含有復(fù)合酶抑制劑的溶液中，用磷酸鹽緩沖液配制復(fù)合酶解液，將預(yù)處理后的混合物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器中，加入復(fù)合酶解液，并調(diào)節(jié)ph值，反應(yīng)溫度設(shè)置為37-40℃，反應(yīng)時(shí)間5-7h，并使用磁力攪拌器保持?jǐn)嚢瑁ＷC反應(yīng)均勻進(jìn)行，將反應(yīng)混合物置于水浴中加熱至80-100℃，持續(xù)10-15min，自然冷卻至室溫，然后將反應(yīng)混合物4000-6000rpm/min離心10-15min，收集上清液，再用濾紙過濾上清液，去除殘余的固體顆粒，得到混合酶解液；稱取磷脂酸粉末溶解在二甲基亞砜中，配成濃度為5-10μg/ml的溶液，將混合均勻的磷脂酸溶液，邊攪拌邊加入到混合酶解液中，得到復(fù)合促生長劑。

5、螺旋藻是一種藍(lán)細(xì)菌，因其高營養(yǎng)價(jià)值而受到關(guān)注，它含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和抗氧化劑，當(dāng)螺旋藻經(jīng)過復(fù)合酶處理后，其內(nèi)部的細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)會(huì)被分解為多糖、多肽和氨基酸，可以為支原體提供生長所需的營養(yǎng)源，豐富培養(yǎng)基的營養(yǎng)；海膽是一種海洋無脊椎動(dòng)物，內(nèi)部含有可食用的部分，包括生殖腺（稱為“卵黃”或“海膽黃”），肌肉組織以及其他內(nèi)臟，它們的組織和內(nèi)臟含有蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等多種生物大分子，復(fù)合酶中的脂肪酶能夠處理海膽中的脂質(zhì)成分，得到甘油和游離脂肪酸等產(chǎn)物，海膽體內(nèi)還含有多種生物活性化合物，這些活性化合物能對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有抑制作用，因而能夠充當(dāng)抗生素，抑制革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌的生長，防止它們在培養(yǎng)基中過度繁殖，創(chuàng)造一個(gè)有利于支原體生長而不利于其他微生物生長的環(huán)境。

6、然而，螺旋藻中的抗菌肽能夠通過與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終引起細(xì)菌死亡，會(huì)對支原體細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響，為此通過酶解反應(yīng)，將抗菌多肽和藻藍(lán)蛋白通過復(fù)合酶制劑將其分解，破壞其抗菌組分，從而影響其活性，當(dāng)酶解反應(yīng)不完全時(shí)，還存在一定的抗菌組分，因此添加磷脂酸，用于提高其綜合其性能，由于磷脂酸是細(xì)胞膜的主要組成成分之一，能夠?yàn)榧?xì)胞膜提供的物理屏障，參與細(xì)胞信號傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生物化學(xué)過程，幫助維持細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，從而改善細(xì)胞膜的質(zhì)量，彌補(bǔ)其螺旋藻中的抗菌組分的不良影響。

7、作為優(yōu)選，所述復(fù)合酶制劑含有纖維素酶、脂肪酶、果膠酶和蛋白酶，其組分的質(zhì)量比為5：2～4：0.5～0.9：1～3。

8、作為優(yōu)選，所述復(fù)合酶解液的濃度為0.5-1%（w/v），復(fù)合酶解液與兩種原料的比例為1：8～10（v/w）。

9、作為優(yōu)選，所述混合酶解液與磷脂酸溶液的質(zhì)量比為1：0.8～1.2。

10、作為優(yōu)選，所述ph值調(diào)節(jié)為6.5-7.5。

11、另一方面，本發(fā)明提供了海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基的分離純化方法，用于上述中任意一項(xiàng)所述的海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基，包括如下步驟：

12、向去離子水中依次加入復(fù)合促生長劑、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、牛血清、β-巰基乙醇、紅景天提取物和dtpa螯合劑，攪拌溶解固體組分，用磷酸鹽緩沖液將混合液的ph值調(diào)節(jié)到適合支原體生長的范圍，使用0.22-0.45μm的無菌濾器過濾混合液，以去除雜質(zhì)，將過濾后的培養(yǎng)基分裝入無菌瓶中，在高壓蒸汽滅菌器中進(jìn)行121-125℃下的滅菌處理10-15min，并于2-4℃下冷藏保存，得到海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基；

13、選擇感染支原體的海洋甲殼類動(dòng)物作為樣本來源，使用無菌技術(shù)從動(dòng)物鰓組織中采集樣本，將收集到的樣本在無菌條件下使用研磨棒進(jìn)行均質(zhì)化處理，均質(zhì)后的樣本通過離心機(jī)去除較大的顆粒和細(xì)胞殘?jiān)?，將處理后的樣本接種到制備好的培養(yǎng)基上，在37-40℃溫度下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)2-4d；

14、當(dāng)觀察到菌落形成后，用接種環(huán)選取單個(gè)菌落，在新的培養(yǎng)基上進(jìn)行平行劃線，繼續(xù)培養(yǎng)1-3d，重復(fù)上述平板劃線步驟4-5次，直到觀察到單一形態(tài)的菌落為止，將純化的菌株冷凍保存即可。

15、紅景天提取物含有多種生物活性成分，主要包括紅景天苷和其他酚類化合物，具有抗氧化作用，可以用來幫助支原體細(xì)胞減少氧化應(yīng)激，增強(qiáng)培養(yǎng)基的效果，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害，促進(jìn)支原體的增殖；另外，額外添加的dtpa螯合劑也可以用于抵消螺旋藻中不利化合物對支原體細(xì)胞的的影響，能夠通過與金屬離子的螯合作用，來減少金屬離子的催化作用，進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合促生長劑與支原體培養(yǎng)基成分的結(jié)合效果，確保培養(yǎng)基不僅能夠提供足夠的營養(yǎng)，還能克服可能存在的抑制性因素，從而促進(jìn)支原體的生長。

16、作為優(yōu)選，所述磷酸鹽緩沖液將混合液的ph值調(diào)節(jié)至7.0-7.5。

17、作為優(yōu)選，所述離心溫度為2-4℃，離心速度2000-3000rpm/min，離心時(shí)間為5-10min。

18、作為優(yōu)選，所述厭氧條件下的氣體混合比例為80-85%的n2和15-20的%co2。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

20、該海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基及分離純化方法中，采用復(fù)合促生長劑，制備出海洋甲殼類動(dòng)物支原體培養(yǎng)基，通過螺旋藻內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)成分，對其水解釋放營養(yǎng)組分，為支原體提供生長所需的營養(yǎng)源，利用海膽體內(nèi)還含有多種生物活性化合物，抑制革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌的生長，防止它們在培養(yǎng)基中過度繁殖，為支原體提供優(yōu)異的生長環(huán)境，通過磷脂酸為細(xì)胞膜提供的物理屏障，幫助維持細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，克服了螺旋藻中不良化合物的影響，進(jìn)而促進(jìn)了支原體的生長，同時(shí)通過多次平板劃線法分離純化支原體，操作簡單便捷。