本發(fā)明屬于大白菜育種，尤其涉及到一種大白菜高抗根腫病材料鑒定用分子標(biāo)記組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌(plasmodiophora?brassica?woronin)侵染引起的一種世界性病害，寄主范圍很廣，可危害白菜、甘藍(lán)、蘿卜、花椰菜、油菜等100多種栽培的和野生的十字花科植物。大白菜是根腫病危害最嚴(yán)重的十字花科蔬菜之一，近年來(lái)，我國(guó)沿海地區(qū)、云貴川、東北部分地區(qū)以及西部地區(qū)等全國(guó)大部分地區(qū)都有根腫病發(fā)生，發(fā)生面積急劇增加并逐年加重，已經(jīng)成為大白菜主產(chǎn)區(qū)的主要病害。

2、由于根腫病菌休眠胞子抗逆性強(qiáng)，在土壤中可存活10年以上，化學(xué)防治極為困難?？共∑贩N的選育和應(yīng)用是解決根腫病危害的根本途徑。而分子標(biāo)記輔助育種是選育抗根腫病大白菜品種的有效手段。目前研究報(bào)道的白菜抗根腫病基因位點(diǎn)較多，比如a1連鎖群上的crr2，a2連鎖群上的crc和rcr8，a3連鎖群上的crr3、cra、crb、crk、crd、rcr1、rcr2、rcr4，a5連鎖群上的crra5，a6連鎖群上的crr4，a8連鎖群上的crr1(crr1a，crr1b)、rcr9、crs等。但報(bào)道的基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記多數(shù)并不能很好的鑒定品種和材料的抗病性(標(biāo)記結(jié)果與接種鑒定結(jié)果不一致)，無(wú)法高效篩選出高抗根腫病的品種或材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種大白菜高抗根腫病材料鑒定用分子標(biāo)記組合及其應(yīng)用，該分子標(biāo)記組合不僅可以篩選出市場(chǎng)上的高抗根腫病大白菜品種，還可以快速選育出聚合至少2個(gè)以上抗病位點(diǎn)的高抗根腫病育種材料，可有效應(yīng)用于高抗根腫病品種或材料的篩選或選育中。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種大白菜高抗根腫病材料篩選用分子標(biāo)記組合，其特征在于，由大白菜3號(hào)連鎖群的crb分子標(biāo)記b0902、crr3分子標(biāo)記opc11-2s以及8號(hào)連鎖群的分子標(biāo)記p29組成。

3、作為優(yōu)選，擴(kuò)增分子標(biāo)記b0902的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，反向引物的核苷酸序列如seq?id?no：2所示；

4、擴(kuò)增分子標(biāo)記opc11-2s的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no：3所示，反向引物的核苷酸序列如seq?id?no：4所示；

5、擴(kuò)增分子標(biāo)記p29的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no：5所示，反向引物的核苷酸序列如seq?id?no：6所示。

6、本發(fā)明還提供了一種用于篩選大白菜高抗根腫病材料的試劑盒，包括上述技術(shù)方案所述的引物對(duì)。

7、本發(fā)明提供了一種根據(jù)上述技術(shù)方案所述的分子標(biāo)記組合、上述技術(shù)方案所述的引物對(duì)或上述技術(shù)方案所述的試劑盒在篩選高抗根腫病大白菜品種或材料，或選育出聚合3個(gè)抗病位點(diǎn)的高抗根腫病育種材料中的應(yīng)用。

8、作為優(yōu)選，篩選時(shí)包括以下步驟：

9、用權(quán)利要求2所述的引物對(duì)對(duì)待篩選大白菜品種或材料樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；

10、利用所得pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或sds-page凝膠電泳，將同時(shí)具有三個(gè)分子標(biāo)記的抗病特征條帶的品種或材料的樣本判斷為高抗根腫病大白菜品種或材料。

11、作為優(yōu)選，分子標(biāo)記b0902的抗病特征帶為160bp，分子標(biāo)記opc11-2s的抗病特征帶為1300bp，分子標(biāo)記p29的抗病特征帶為77bp。

12、作為優(yōu)選，同時(shí)具有兩個(gè)抗病特征帶的品種或材料的抗病性大體優(yōu)于只有一個(gè)抗病條帶的品種或材料；

13、opc11-2s、p29抗病條帶為純合抗病條帶時(shí)，抗病性優(yōu)于b/o或b/p均為雜合時(shí)的抗性。

14、作為優(yōu)選，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

15、b0902的pcr程序?yàn)?5℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min；

16、opc11-2s的pcr程序?yàn)?5.5℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，57℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

17、p29的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

18、作為優(yōu)選，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

19、pcr混合物反應(yīng)體積為10μl、2×tag?plus?master?mix?5μl、10mmol·μl-1的引物各0.5μl、10ng·μl-1的dna模板4μl。

20、本發(fā)明提供了一種高抗根腫病大白菜品種或材料的選育方法，包括以下步驟：

21、利用上述技術(shù)方案所述的大白菜高抗根腫病材料篩選用分子標(biāo)記組合對(duì)大白菜品種或材料進(jìn)行根腫病抗性篩選，選出同時(shí)具有分子標(biāo)記組合中三個(gè)分子標(biāo)記的抗病特征條帶的育種材料，即為高抗根腫病育種材料ccr108-47。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于：

23、本發(fā)明利用大白菜3號(hào)連鎖群的crb分子標(biāo)記b0902、crr3分子標(biāo)記opc11-2s以及8號(hào)連鎖群的分子標(biāo)記p29的分子標(biāo)記組合對(duì)大白菜品種或材料進(jìn)行根腫病抗性鑒定。三個(gè)分子標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以篩選出市場(chǎng)上的高抗根腫病大白菜品種，還可以快速選育出聚合至少2個(gè)以上抗病位點(diǎn)的高抗根腫病育種材料，可有效應(yīng)用于高抗根腫病品種或材料的篩選或選育中。

24、本發(fā)明利用上述分子標(biāo)記組合進(jìn)一步篩選到了高抗根腫病育種材料ccr108-47，其含有3個(gè)純合抗病主效基因，一方面可以用來(lái)直接配制高抗根腫病組合，另一方面可作為根腫病抗性轉(zhuǎn)育源，轉(zhuǎn)育其他優(yōu)良抗根腫病育種材料。

技術(shù)特征：

1.一種大白菜高抗根腫病材料篩選用分子標(biāo)記組合，其特征在于，由大白菜3號(hào)連鎖群的crb分子標(biāo)記b0902、crr3分子標(biāo)記opc11-2s以及8號(hào)連鎖群的分子標(biāo)記p29組成。

2.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記組合的引物對(duì)，其特征在于，擴(kuò)增分子標(biāo)記b0902的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，反向引物的核苷酸序列如seq?id?no：2所示；

3.一種用于篩選大白菜高抗根腫病材料的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求2所述的引物對(duì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記組合、權(quán)利要求2所述的引物對(duì)或權(quán)利要求3所述的試劑盒在篩選高抗根腫病大白菜品種或材料，或選育出聚合3個(gè)抗病位點(diǎn)的高抗根腫病育種材料中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，篩選時(shí)包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，分子標(biāo)記b0902的抗病特征帶為160bp，分子標(biāo)記opc11-2s的抗病特征帶為1300bp，分子標(biāo)記p29的抗病特征帶為77bp。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，同時(shí)具有兩個(gè)抗病特征帶的品種或材料的抗病性大體優(yōu)于只有一個(gè)抗病條帶的品種或材料；

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

10.一種高抗根腫病大白菜品種或材料的選育方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種大白菜高抗根腫病材料鑒定用分子標(biāo)記組合及其應(yīng)用，屬于大白菜育種技術(shù)領(lǐng)域。該分子標(biāo)記組合由大白菜3號(hào)連鎖群的CRb分子標(biāo)記B0902、Crr3分子標(biāo)記OPC11?2S以及8號(hào)連鎖群的分子標(biāo)記P29組成。該分子標(biāo)記組合不僅可以篩選出市場(chǎng)上的高抗根腫病大白菜品種，還可以快速選育出聚合3個(gè)抗病位點(diǎn)的高抗根腫病育種材料，可有效應(yīng)用于高抗根腫病品種或材料的篩選或選育中。

技術(shù)研發(fā)人員：楊曉云,張清霞,宋永駿,張淑霞,司朝光,郭瑩,潘中強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青島市分院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6