本發(fā)明屬于香料合成，具體涉及一種酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法。

背景技術：

1、巨豆三烯酮是煙草中重要的致香化合物，少量添加即可改善吸味，掩蓋雜氣，使余味醇和，是調配高檔香煙不可缺少的香料，在香精香料行業(yè)和煙草行業(yè)中有重要的應用。氧代紫羅蘭醇酯作為煙用香料前體，在卷煙燃吸過程中釋放出巨豆三烯酮等香氣成分，可以賦予卷煙更加柔和的品質，同時還可提高香料的穩(wěn)定性和耐貯性。氧代紫羅蘭醇不僅是煙草中的致香前體，同時也是巨豆三烯酮和氧代紫羅蘭醇酯的關鍵中間體，因此發(fā)展高效的氧代紫羅蘭醇合成方法具有重要意義。

2、現有技術中，通常采用化學合成法制備氧代紫羅蘭醇，一般分為兩種途徑：一種以紫羅蘭酮為原料，經羰基還原、酯化、烯丙位氧化、水解得到產物，該方法合成路線在進行羥基保護和脫保護的過程中影響產物的總收率，步驟繁瑣，且使用重金屬作為氧化劑，對環(huán)境有害；一種以紫羅蘭酮為原料，經烯丙位氧化、羰基還原得到產物，該方法路線短，重點涉及羰基的化學選擇性和區(qū)域選擇性還原反應，需要嚴格控制還原劑用量、反應溫度，需經柱層析分離純化得到產物，分離難度大。這兩種途徑均存在后續(xù)分離純化復雜的問題，且制得的氧代紫羅蘭醇均是消旋體。

3、相較于化學合成法，酶催化方法反應條件溫和、選擇性高，可以在室溫、常壓下高產率獲得目標產物。同時科學研究表明手性香料的香氣特征與立體化學密切相關，因此通過生物催化高效制備手性紫羅蘭醇將有助于手性香料的研究。目前尚無文獻公開報道采用酶法合成手性氧代紫羅蘭醇的方法。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，采用羰基還原酶chkred20或其突變體催化合成手性氧代紫羅蘭醇，收率達到99%以上，對映選擇性達到99%以上，解決上述背景技術中的問題。

2、為實現上述目的，本申請是通過以下技術方案實現的：

3、一種酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，采用以下步驟：

4、s1、將含有氧代紫羅蘭酮的底物和輔助底物投入緩沖溶液中，室溫攪拌至全溶，得到底物溶液；

5、s2、將羰基還原酶chkred20或其突變體及輔酶分散到步驟s1的底物溶液中，保溫攪拌；

6、s3、步驟s2的反應結束后，加水稀釋，然后用乙酸乙酯萃取后、水洗、干燥，將乙酸乙酯濃縮，獲得手性氧代紫羅蘭醇。

7、進一步的，步驟s1中，底物中氧代紫羅蘭酮的濃度為10-60?g/l。

8、進一步的，步驟s1中，優(yōu)選的，底物中氧代紫羅蘭酮的濃度為20-25?g/l。

9、進一步的，步驟s1中，輔助底物為醇類物質，醇類物質能夠作為助溶劑，促進底物氧代紫羅蘭酮在緩沖溶劑中的溶解，也能作為供氫體，使底物更好的被還原為相應的產物。這里的醇類物質如異丙醇、乙醇和正丙醇等，作為優(yōu)選，所述供氫體采用異丙醇，異丙醇的用量為底物重量的10-60倍，優(yōu)選20-40倍。

10、進一步的，步驟s1中，輔助底物的用量為底物重量的20-40倍。

11、進一步的，步驟s1中，緩沖溶液為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液，緩沖溶液的ph范圍為7.0-7.5，緩沖溶液的用量為底物重量的10-20倍（g/l）。

12、進一步的，步驟s2中，羰基還原酶chkred20的用量是底物重量的0.1-0.5?wt%，優(yōu)選為0.1-0.3?wt%。

13、進一步的，步驟s2中，羰基還原酶chkred20的突變體為第97位、第153位或第188位中的至少兩位上的氨基酸殘基被替換的突變體。如突變體m2、突變體m3c1，羰基還原酶chkred20的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，羰基還原酶chkred20的突變體m2的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，羰基還原酶chkred20的突變體m3c1的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

14、采用羰基還原酶chkred20或其突變體能夠針對性的選擇底物中非環(huán)羰基進行不對稱催化還原，實現很好的化學選擇性、區(qū)域選擇性和對映選擇性。同時，采用羰基還原酶-底物偶聯法，能夠實現輔酶的再生，減少輔酶用量，使酶活性在整個反應中都保持較高的水平。最終產物選擇性高、產率高，提供了一種全新的以氧代紫羅蘭酮為原料的酶催化合成手性氧代紫羅蘭醇的方法。

15、進一步的，步驟s2中，輔酶選自nad+，能夠促進催化還原過程中電子的傳遞。這里對于輔酶的用量可以根據實際情況進行調整，并沒有具體的限定，優(yōu)選的，所述輔酶的用量為底物中氧代紫羅蘭酮的用量的0.002-0.004?wt%。

16、進一步的，步驟s2中，酶催化條件為30-40°c下反應24-72h。優(yōu)選地，酶催化反應的條件為：37°c下反應24h。

17、本發(fā)明的有益效果是：

18、1、本發(fā)明提供了一種全新的手性氧代紫羅蘭醇的制備途徑--酶催化方法。

19、2、本發(fā)明采用了底物偶聯法再生輔酶，減少了輔酶的用量，輔助底物作為底物的底物偶聯策略，反應體系簡單，易于分離產物，降低了成本。

20、3、本發(fā)明的技術方案以大于99%的轉化率完成手性紫羅蘭醇的制備，產物ee值達到99%以上，具備工業(yè)應用價值。

技術特征：

1.一種酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，采用以下步驟：

2.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s1中，底物中氧代紫羅蘭酮的濃度為10-60?g/l。

3.根據權利要求2所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s1中，底物中氧代紫羅蘭酮的濃度為20-25?g/l。

4.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s1中，輔助底物為醇類物質，所述輔助底物的用量為底物重量的10-60倍。

5.根據權利要求4所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s1中，輔助底物的用量為底物重量的20-40倍。

6.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s1中，緩沖溶液為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液，緩沖溶液的ph范圍為7.0-7.5，緩沖溶液的用量為底物重量的10-20倍。

7.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s2中，羰基還原酶chkred20的用量是底物重量的0.1-0.5?wt%。

8.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s2中，羰基還原酶chkred20的突變體為第97位、第153位或第188位中的至少兩位上的氨基酸殘基被替換的突變體，羰基還原酶chkred20的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，羰基還原酶chkred20的突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2和/或seq?id?no.3所示。

9.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s2中，輔酶選自nad+，所述輔酶的用量為底物中氧代紫羅蘭酮的用量的0.002-0.004?wt%。

10.根據權利要求1所述的酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，其特征在于，步驟s2中，酶催化條件為30-40°c下反應24-72h。

技術總結
本發(fā)明屬于香料合成技術領域，具體涉及一種酶法高效制備手性氧代紫羅蘭醇的方法，將含有氧代紫羅蘭酮的底物和輔助底物投入緩沖溶液中，室溫攪拌至全溶，得到底物溶液；將羰基還原酶ChKRED20或其突變體及輔酶分散到底物溶液中，保溫攪拌；反應結束后加水稀釋，然后用乙酸乙酯萃取后、水洗、干燥，將乙酸乙酯濃縮，獲得手性氧代紫羅蘭醇。本發(fā)明的酶催化方法反應條件溫和、選擇性高，可以在室溫、常壓下高產率獲得目標產物。采用了底物偶聯法再生輔酶，減少了輔酶的用量，輔助底物作為底物的底物偶聯策略，反應體系簡單，易于分離產物，降低了成本。本技術方案的轉化率大于99%，且產物的ee值達到99%以上，具備工業(yè)應用價值。

技術研發(fā)人員：李文典,陶飛燕,吳雷,張學建,魏寧,丁玉,王益明,簡美玲,黃貴元,廖雪,丁為,崔韜,王娜
受保護的技術使用者：四川三聯新材料有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6