本技術(shù)涉及基因檢測，具體涉及一種用于犬個體識別和親權(quán)鑒定的str分型方法、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、我國有超5000萬只寵物犬，其作為人類工作動物或伴侶動物，與人類生活密不可分。正因于此，犬不可避免的與某些案事件的發(fā)生密切相關(guān)，例如，脫落的犬毛發(fā)可能在涉案的不同個體間轉(zhuǎn)移，可用于將嫌疑人和犯罪現(xiàn)場、嫌疑人和受害人或受害人與犯罪現(xiàn)場等相互關(guān)聯(lián)；由于養(yǎng)犬?dāng)?shù)目的增加，犬傷人案件也屢見不鮮，而實現(xiàn)犬的精準(zhǔn)個體識別和親權(quán)鑒定，有利于還原案事件原貌，重建案事件現(xiàn)場，確定責(zé)任人，并為此類案事件的審理提供關(guān)鍵證據(jù)。此外，犬作為伴侶動物在各個不同的家庭，給我們帶來很多的陪伴和歡樂的同時，在寵物市場交易中也占據(jù)重要地位，其中一些名貴犬種在交易過程中需要進(jìn)行dna鑒定，以明其血統(tǒng)。

2、短串聯(lián)重復(fù)序列(short?tandem?repeat,str)也叫微衛(wèi)星dna，是基因組上一類重復(fù)序列，按照重復(fù)單位堿基數(shù)可分為二核苷酸序列以及三、四、五和六核苷酸序列。str是法醫(yī)dna分析中應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記類型，在個體識別和親權(quán)鑒定中發(fā)揮了重要作用。其中基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction,pcr)和毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis，ce)平臺的str檢測靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，是當(dāng)前str分析的金標(biāo)準(zhǔn)。而基于pcr-ce技術(shù)的str分析也是犬dna檢測的主要技術(shù)方法。為了更準(zhǔn)確和高效的進(jìn)行犬的管理和涉犬案件的偵查工作，澳大利亞、美國、匈牙利、英國等國家已經(jīng)開展了犬相關(guān)str數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建工作。

3、當(dāng)前，已有針對10個、11個、15個、17個、24個犬特異性str開發(fā)的一系列犬個體識別分型檢測體系，這些體系中主要檢測二核苷酸和四核苷酸重復(fù)單元的str。與此同時，國際動物遺傳學(xué)學(xué)會(international?society?for?animal?genetics,isag)為了規(guī)范犬的品系和家系追蹤，推薦了21個str基因座，可用于家犬的親權(quán)鑒定。最新研究中，研究人員開發(fā)包含24個str的復(fù)合擴增分型檢測體系，對犬群體的累積排除概率為0.9999，但該體系包含基因座同國際其他研究相差較大，不利于實驗室間結(jié)果比對以及相關(guān)技術(shù)方法的推廣和大規(guī)模應(yīng)用。除此之外，我國可用于犬個體識別和親權(quán)鑒定的str分型技術(shù)體系有限。為了彌補犬個體識別和親權(quán)鑒定的技術(shù)不足，亟需開發(fā)構(gòu)建犬一種新型str分型技術(shù)體系。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決前述技術(shù)問題，申請人開發(fā)了一種靈敏度高、特異性好和穩(wěn)定性優(yōu)的犬個體識別/親權(quán)鑒定的str分型技術(shù)。

2、本技術(shù)的第一目的是尋求一種新的犬個體識別和親權(quán)鑒定的str分型產(chǎn)品或試劑盒；

3、本技術(shù)的第二目的是尋求一種犬個體識別和親權(quán)鑒定的str分型檢測方法。

4、具體的，本技術(shù)采用如下技術(shù)方案：

5、本技術(shù)首先提供一種用于犬個體識別和親權(quán)鑒定分型的引物組合物，所述引物針對21個犬特異性str基因座；

6、進(jìn)一步的，所述基因座和大小包括如下：

7、fh2848(131-170nt)、ahth130(188-222nt)、ren64e19(224-248nt)、ren169o18(252-294nt)、inu055(300-355nt)、aht137(75-120nt)、inu030(124-157nt)、ren247m23(164-190nt)、ahth260(195-230nt)、inra21(250-294nt)、ren105l03(300-340nt)、ren162c04(82-122nt)、ahtk253(141-181nt)、ren169d01(190-236nt)、ren54p11(246-282nt)、fh2054(293-353nt)、cxx279(82-130nt)、inu005(140-175nt)、ahtk211(180-225nt)、ahth171(230-268nt)、aht121(279-339nt)。

8、優(yōu)選的，所述引物組合物針對性別鑒定的基因座amelogenin(90-129nt)。

9、進(jìn)一步的，所述引物的具體序列如seq?id?no.1-44所示。

10、進(jìn)一步的，所述引物被分為4組，且被熒光標(biāo)記；

11、優(yōu)選的，所述熒光標(biāo)記分別為fam、hex、tamra和rox標(biāo)記：

12、組1：fam藍(lán)色熒光標(biāo)記：針對基因座amelogenin(90-129nt)、fh2848(131-170nt)、ahth130(188-222nt)、ren64e19(224-248nt)、ren169o18(252-294nt)、inu055(300-355nt)；

13、組2：hex綠色熒光標(biāo)記：針對基因座aht137(75-120nt)、inu030(124-157nt)、ren247m23(164-190nt)、ahth260(195-230nt)、inra21(250-294nt)、ren105l03(300-340nt)；

14、組3：tamra黃色熒光標(biāo)記：針對基因座ren162c04(82-122nt)、ahtk253(141-181nt)、ren169d01(190-236nt)、ren54p11(246-282nt)、fh2054(293-353nt)；

15、組4：rox紅色熒光標(biāo)記：針對基因座cxx279(82-130nt)、inu005(140-175nt)、ahtk211(180-225nt)、ahth171(230-268nt)、aht121(279-339nt)。

16、本技術(shù)還提供一種用于犬個體識別和親權(quán)鑒定分型的試劑盒，其特征在于，包括前述任一所述的引物組合物。

17、進(jìn)一步的，所述試劑盒進(jìn)一步包括：熱啟動taq?dna聚合酶、pcr擴增緩沖液、質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)。

18、本技術(shù)還提供前述任一所述的引物組合物在犬個體識別和親權(quán)鑒定分型中的應(yīng)用，或在制備犬個體識別和親權(quán)鑒定分型試劑盒中的應(yīng)用。

19、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述鑒定分型過程中，pcr擴增過體系de退火溫度為57±2℃，退火時間為80-90s，延伸時間為5-15min，循環(huán)數(shù)為29-30個。

20、本技術(shù)還提供一種犬個體識別和親權(quán)鑒定分型的方法，通過構(gòu)建一個包含有22個犬特異性基因座的復(fù)合pcr擴增體系，采用熒光pcr擴增結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測的方法，對犬特異性的21個str基因座和性別判定amel基因座進(jìn)行檢測，結(jié)合毛細(xì)管電泳的片段分離技術(shù)，在一次實驗中實現(xiàn)所有目標(biāo)基因座的分型，具體可包括如下步驟：

21、利用前所引物組合物進(jìn)行擴增的步驟，或利用前述任一所述試劑盒進(jìn)行檢測的步驟；進(jìn)一步的，所述方法進(jìn)一步包括毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)分析判讀的步驟，最后通過片段大小、基因座的產(chǎn)物峰高比值，確定樣本的基因型。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)至少具有如下優(yōu)勢：

23、1)本技術(shù)的方法具有極高檢測靈敏度，檢測體系可實現(xiàn)低至0.1ng的微量犬dna的完整str分型檢測；

24、2)本技術(shù)分型結(jié)果更加準(zhǔn)確，體系中21個目標(biāo)str基因座的目標(biāo)擴增峰的偏倚均小于0.2nt；

25、3)本技術(shù)檢測的種屬特異性高，體系中所有基因座均有較高犬種屬特異性，檢測中對于貓、小鼠、鴿子、馬、牛、大腸桿菌、魚和mdck細(xì)胞系等非犬來源dna無產(chǎn)物峰。

26、4)本技術(shù)檢材適用性強，體系對于多種不同類型檢材，不同提取方法獲得的模板dna，均可獲得準(zhǔn)確的str分型結(jié)果，檢材適用性強。而且相比于以往方法，本技術(shù)穩(wěn)定性更高，體系在不同引物濃度、緩沖液濃度、退火溫度、退火時間、終延伸時間條件下，多種不同類型的熱循環(huán)儀器上進(jìn)行擴增反應(yīng)，結(jié)果都準(zhǔn)確且穩(wěn)定。綜合而言，本技術(shù)在應(yīng)用過程中可重復(fù)性和權(quán)威性明顯優(yōu)于以往技術(shù)。

27、5)本技術(shù)體系可在3h內(nèi)實現(xiàn)體系中所有基因座的準(zhǔn)確擴增和檢測，速度快，相關(guān)試劑耗材均可大規(guī)模生產(chǎn)，成本低。