本發(fā)明屬于基因工程，涉及一種基于深度學(xué)習(xí)改造的熱穩(wěn)定性高的酶突變體。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)工程在酶分子改造方面應(yīng)用廣泛，主要通過對基因的修改改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)酶的催化效率提高、熱穩(wěn)定性提高、底物特異性改變等。主要涉及的方法有定向進(jìn)化、理性設(shè)計和半理性設(shè)計。許多定向進(jìn)化的例子已經(jīng)證實，通過高通量篩選方法對酶中任意位置的隨機突變進(jìn)行大規(guī)模篩選可以產(chǎn)生所需的突變體。然而，由于蛋白質(zhì)的大小和篩選的耗時性質(zhì)，使用易錯pcr作為主要方法的定向進(jìn)化通常是相對低效的。因此，需要借助計算機方法理性或半理性設(shè)計蛋白質(zhì)工程。借助于計算機的機器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等人工智能方法被應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程，在酶結(jié)構(gòu)預(yù)測、穩(wěn)定性/選擇性/催化活性、指導(dǎo)酶設(shè)計等問題中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，為酶分子設(shè)計提供新的可能，并大大提高了實驗效率。

2、腈酶超家按序列相似性和結(jié)構(gòu)功能域分類可將其分為13個分支。然而，腈酶超家族中只有一個分支具有轉(zhuǎn)化腈的能力，其他分支優(yōu)先表現(xiàn)為酰胺水解或縮合特性。大多數(shù)超家族成員都有一個共同的α-β-β-α結(jié)構(gòu)折疊和一個cys-glu-lys催化位點。腈水解酶(ec3.5.5)是腈酶超家族中的一種酶，它可以在一步反應(yīng)中將一系列腈催化成相應(yīng)的羧酸并釋放氨。腈水解酶介導(dǎo)的生物催化反應(yīng)具有環(huán)境溫和、環(huán)境友好、無副產(chǎn)物產(chǎn)生、產(chǎn)物具有優(yōu)異的區(qū)域選擇性、化學(xué)選擇性和立體選擇性等優(yōu)點，與傳統(tǒng)化學(xué)途徑所需要苛刻的酸堿反應(yīng)條件和產(chǎn)生不良副產(chǎn)物相比，腈水解酶在精細(xì)化工生產(chǎn)中有望成為傳統(tǒng)化學(xué)途徑的替代品。腈水解酶在催化產(chǎn)生煙酸、(r)-扁桃酸、丙烯酸、乙醇酸、1,5-二甲基-2哌啶酮、阿托伐他汀、加巴噴丁、(r)-巴氯芬和(s)-普瑞巴林等有價值的精細(xì)化學(xué)品中已有所應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決提高腈水解酶的熱穩(wěn)定性，本發(fā)明提供了一種基于深度學(xué)習(xí)改造的熱穩(wěn)定性高的酶突變體。本發(fā)明基于深度學(xué)習(xí)改造，以腈水解酶zjb09122為母本同時對f168、v305和f307三個位點突變后得到組合突變體f168v/v305l/f307y，使得腈水解酶的熱穩(wěn)定性大大提高，提高腈水解酶在合成加巴噴丁中的潛力。

2、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種熱穩(wěn)定性高的腈水解酶突變體，其氨基酸序列如seqid?no.1所示。?本發(fā)明基于深度學(xué)習(xí)改造，以acidovorax facilis來源的腈水解酶zjb09122為母本同時對f168、v305和f307三個位點突變后得到組合突變體f168v/v305l/f307y，使得腈水解酶的熱穩(wěn)定性大大提高，提高腈水解酶在合成加巴噴丁中的潛力。

4、第二方面，本發(fā)明提供了一種熱穩(wěn)定性高的腈水解酶突變體的編碼基因。

5、具體地，本發(fā)明給出了一種熱穩(wěn)定性高的腈水解酶突變體的編碼基因的核苷酸序列，如seq?id?no.2所示。

6、第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，所述重組載體包含上述編碼基因。

7、第四方面，本發(fā)明提供了一種基因工程菌，所述工程菌包含上述編碼基因或上述重組載體。

8、作為優(yōu)選，所述基因工程菌的宿主菌為大腸桿菌。

9、第五方面，本發(fā)明提供了上述腈水解酶突變體或上述基因工程菌在合成加巴噴丁中的應(yīng)用。經(jīng)過同時對f168、v305和f307三個位點突變進(jìn)行突變，突變?yōu)閒168v、v305l、f307y，腈水解酶的熱穩(wěn)定性得以大大提高，進(jìn)而提升了腈水解酶在合成加巴噴丁中的潛力。

10、第六方面，本發(fā)明提供了一種d型氨基酸氧化酶突變體，該d型氨基酸氧化酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

11、第七方面，本發(fā)明提供了一種硝基還原酶突變體，該硝基還原酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

12、基于深度學(xué)習(xí)改造的方法，對d型氨基酸氧化酶、硝基還原酶進(jìn)行改造、突變，也能在使得其熱穩(wěn)定性提高，有利于在l-草銨膦前體2-羰基-4[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸和3-氨基-2-羥基苯乙酮的合成中的應(yīng)用。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

14、本發(fā)明以acidovorax facilis來源的腈水解酶zjb09122為母本，采用深度學(xué)習(xí)方法，高通量篩選到組合突變體zjb09122_m3，突變體zjb09122_m3為同時對f168v、v305l、f307y三個位點突變后得到，具體通過構(gòu)建含有突變的重組菌株，誘導(dǎo)培養(yǎng)后篩選出熱穩(wěn)定性提高幅度最大的一種腈水解酶突變體zjb09122_m3。本發(fā)明突變體zjb09122_m3的最適ph在7.5-8.0之間；最適溫度在45-50℃之間；在ph7.0的na2hpo4-nah2po4緩沖液中，反應(yīng)溫度為45℃時，zjb09122和zjb09122_m3的比活力分別為7.18?u/mg、8.16?u/mg，t1/2分別為16h、48?h；在熱穩(wěn)定性方面，當(dāng)zjb09122和zjb09122_m3在65℃下保溫一段時間后，殘留酶活分別為初始酶活的18.91%、60.52%，且突變體zjb09122_m3的t50值為65.0℃，較野生型zjb09122的59.1℃提高了5.9℃。。因此，本發(fā)明的腈水解酶突變體zjb09122_m3具有熱穩(wěn)定性高的特點，本發(fā)明的高熱穩(wěn)定性腈水解酶突變體在加巴噴丁的合成中應(yīng)用潛力較大。

技術(shù)特征：

1.一種基于深度學(xué)習(xí)改造的熱穩(wěn)定性高的酶突變體，其特征在于：氨基酸序列如seqid?no.1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的酶突變體的編碼基因。

3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4.一種重組載體，其特征在于：所述重組載體包含權(quán)利要求2所述的編碼基因。

5.一種基因工程菌，其特征在于：所述工程菌包含權(quán)利要求2所述的編碼基因或權(quán)利要求4所述的重組載體。

6.如權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主菌為大腸桿菌。

7.如權(quán)利要求1所述的酶突變體在合成加巴噴丁中的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求5所述的基因工程菌在合成加巴噴丁中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種基于深度學(xué)習(xí)改造的熱穩(wěn)定性高的酶突變體。上述深度學(xué)習(xí)的方法，可應(yīng)用于酶分子改造。本發(fā)明采用深度學(xué)習(xí)方法，可以篩選到優(yōu)勢突變體。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了調(diào)控酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸殘基，對酶在高溫下的催化性能改良具有重要指導(dǎo)意義，同時本發(fā)明為酶在工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用提供有力借鑒。

技術(shù)研發(fā)人員：薛亞平,湯恒,陳梅,孫玉澤,鄭裕國
受保護的技術(shù)使用者：浙江工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2