本發(fā)明涉及漢坦病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于rpa-crispr/cas12a-lfd體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的dna片段、重組載體、試劑組合和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、腎綜合征出血熱(hemorrhagic?fever?with?renal?syndrome,hfrs)是由漢坦病毒(hv)引起、并由嚙齒類(lèi)動(dòng)物(主要為鼠類(lèi))傳播的嚴(yán)重危害人民群眾身體健康的重大傳染病。作為我國(guó)重點(diǎn)監(jiān)控的乙類(lèi)傳染病，hfrs具有起病急、死亡率高等特點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，每年hfrs病例報(bào)告數(shù)約為十萬(wàn)例，而我國(guó)是hfrs的最主要疫區(qū)，發(fā)病數(shù)占全球病例總數(shù)的90％，高居世界第一，其中吉林省是hfrs的主要流行區(qū)。

2、隨著現(xiàn)代化的發(fā)展，自然資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)加劇了森林的砍伐，從而導(dǎo)致大量嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)入人類(lèi)居住區(qū)域，增加了漢坦病毒感染的可能性，感染病例預(yù)計(jì)將會(huì)持續(xù)增加。引起hfrs的hv有四種：漢灘病毒(htnv)、漢城病毒(seov)、普馬拉病毒(puuv)和多布拉伐-貝爾格萊德病毒(dobv)。不同亞型病毒引起疾病的臨床表現(xiàn)也不盡相同，通常由htnv和dobv引起的hfrs較為嚴(yán)重，因此hfrs四種亞型的早期鑒別與檢測(cè)不僅可以幫助臨床醫(yī)生更好地評(píng)估患者病情，制定治療策略、提高治療效果；同時(shí)還有助于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，以提供更準(zhǔn)確的預(yù)后指導(dǎo)和管理。此外不同亞型間病毒的感染與流行具有地理分布性，而我國(guó)hfrs主要由htnv和seov兩種型別病毒感染所致，其中由htnv感染引起的hfrs最為嚴(yán)重，死亡率可達(dá)9％-12％。因此建立一種針對(duì)htnv的準(zhǔn)確、高效、便攜的檢測(cè)方法，對(duì)hfrs患者的早期治療以及控制疾病的流行爆發(fā)起到了重要的作用。

3、目前，htnv的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要為血液學(xué)檢查和病原體核酸檢測(cè)。血液學(xué)檢查主要是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)患者血清中抗?jié)h坦病毒的igg或igm抗體，但該種檢測(cè)方法靈敏度低、特異性差、易漏檢，不能進(jìn)行早期診斷而貽誤治療。實(shí)時(shí)熒光定量pcr作為目前漢坦病毒快速病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其需要昂貴專(zhuān)業(yè)儀器、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果判讀繁瑣，從而無(wú)法在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)廣泛普及應(yīng)用。

4、重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)作為一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，主要通過(guò)重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和聚合酶模擬dna體內(nèi)擴(kuò)增，在恒溫條件下即可快速、靈敏、高效、特異地?cái)U(kuò)增目的片段。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、擴(kuò)增效率強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。crispr/cas系統(tǒng)，是原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可抵抗外源性噬菌體或質(zhì)粒遺傳元件的入侵?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基因工程及核酸檢測(cè)領(lǐng)域之中。crispr-cas12a是crispr-cas系統(tǒng)的一種變體，也被稱(chēng)為cpf1。cas12a酶具有dna酶切功能，可以切割特定單鏈dna探針，從而實(shí)現(xiàn)快速核酸檢測(cè)。rpa擴(kuò)增的雙鏈dna，在crrna的引導(dǎo)下cas12a可以切割雙鏈模板dna和熒光標(biāo)記探針，探針被水解后釋放出熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱從而判定目標(biāo)核酸片段的有無(wú)。同時(shí)也可聯(lián)合測(cè)流層析試紙條(lfd)對(duì)結(jié)果進(jìn)行更加準(zhǔn)確直觀(guān)的觀(guān)察。然而迄今為止，還未有報(bào)道將crispr系統(tǒng)應(yīng)用于漢坦病毒的檢測(cè)診斷。本研究將開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速且易操作的htnv檢測(cè)方法，通過(guò)rpa增加反應(yīng)的靈敏度，同時(shí)利用cas12a的切割活性來(lái)排除rpa反應(yīng)的假陽(yáng)性結(jié)果，建立rpa-crispr?cas12a-lfd檢測(cè)體系，以實(shí)現(xiàn)htnv的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供了一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的dna片段。

2、本發(fā)明的目的之二是提供了一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的重組載體。

3、本發(fā)明的目的之三是提供了一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合。

4、本發(fā)明的目的之四是提供了一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑盒。

5、本發(fā)明的目的之五是提供了一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑盒在檢測(cè)病毒htnv亞型非診斷目的的應(yīng)用。

6、本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

7、一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的dna片段，所述dna片段為含有seq?id?no.1所示的堿基序列組成的dna片段。

8、一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的重組載體，所述重組載體包含如seq?id?no.1所示的堿基序列組成的dna片段。

9、優(yōu)選的是，所述重組載體使用的質(zhì)粒為puc57。

10、一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合，所述試劑組合包括用于rpa擴(kuò)增得到含有seq?id?no.1所示的堿基序列組成的dna片段的引物組和crrna；

11、其中，所述引物組包括如seq?id?no.2所示的上游引物序列和如seq?id?no.3所示的下游引物序列；以及

12、所述crrna為如seq?id?no.4所示的堿基序列組成的rna片段。

13、優(yōu)選的是，還包括ssdna探針；

14、其中，所述ssdna探針的5'端標(biāo)記有fam且3'標(biāo)記有bhq1；或者

15、所述ssdna探針的5'端標(biāo)記有fam且3'標(biāo)記有biotin。

16、優(yōu)選的是，還包括ssdna探針；

17、其中，所述ssdna探針的核苷酸序列為5'-fam-ttatt-bhq1-3'；或者

18、所述ssdna探針的核苷酸序列為

19、5'-fam-tttttttattttttt-biotin-3'。

20、一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑盒，包括所述的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合。

21、優(yōu)選的是，還包括：rpa擴(kuò)增試劑、crispr/cas12a識(shí)別切割試劑和探針。

22、一種基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑盒在檢測(cè)病毒htnv亞型非診斷目的的應(yīng)用，使用所述的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑盒。

23、優(yōu)選的是，包括如下步驟：

24、步驟一、提取待檢測(cè)樣本的dna，作為模板dna；

25、步驟二、將所述步驟一所得的模板dna加入rpa反應(yīng)體系充分混勻，采用引物對(duì)進(jìn)行rpa擴(kuò)增反應(yīng)；

26、其中，rpa擴(kuò)增反應(yīng)的rpa反應(yīng)體系和rpa反應(yīng)條件如下：

27、rpa反應(yīng)體系：向含有凍干酶粉的ep管中加入29.5μl的primer?free?rehydrationbuffer，各2.4μ的引物對(duì)中的上游引物、下游引物，12.2μ的ddh2o后，加入1μ的濃度為100ng/μl模板dna，最后在蓋子上加入2.5μ的mgoac激活劑；

28、rpa反應(yīng)條件：將所述rpa反應(yīng)體系充分混勻，在37℃～41℃條件下，擴(kuò)增10～35min；

29、步驟三、將crrna、ssdna探針和cas12a酶與所述步驟二中得到的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物混合，進(jìn)行cas12a熒光檢測(cè)反應(yīng)；

30、其中，cas12a熒光檢測(cè)反應(yīng)體系如下：

31、在無(wú)菌pcr管中依次加入3μ的10×culease?buffer，濃度為10nm～50nm的lbcas12a?nuclease，濃度為300nm～700nm的ssdna-fq，濃度為10nm～50nm的crrna，depch2o?16μ，混勻后加入rpa擴(kuò)增產(chǎn)物2μ，混勻離心后置于熒光定量pcr儀中39℃孵育，每隔30s采集一次熒光信號(hào)，共設(shè)置90個(gè)循環(huán)數(shù)，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)肉眼觀(guān)察紫外下反應(yīng)液熒光強(qiáng)度、統(tǒng)計(jì)分析熒光定量pcr儀中熒光值進(jìn)行判讀；或者

32、在無(wú)菌pcr管中依次加入3μ的10×culease?buffer，濃度為10nm～50nm的lbcas12a?nuclease，濃度為2μm的ssdna-fb?7.5μ，濃度為10nm～50nm的crrna，depc?h2o16μ，混勻后加入rpa擴(kuò)增產(chǎn)物2μ，離心混勻置于35℃～41℃溫浴20min，在反應(yīng)管中加入高壓后超純水補(bǔ)足為50μl，將cas12/13專(zhuān)用核酸檢測(cè)試紙條插入反應(yīng)管中靜置1-2min后觀(guān)察結(jié)果；

33、其中，所述lbcas12a?nuclease的初始濃度為1μm，稀釋至終濃度為10nm～50nm后進(jìn)行構(gòu)建所述cas12a熒光檢測(cè)反應(yīng)體系；所述ssdna-fq的初始濃度為2μm，稀釋至終濃度為300nm～700nm后進(jìn)行構(gòu)建所述cas12a熒光檢測(cè)反應(yīng)體系；所述crrna的初始濃度為500nm，稀釋至終濃度為10nm～50nm后進(jìn)行構(gòu)建所述cas12a熒光檢測(cè)反應(yīng)體系。

34、本發(fā)明所述的有益效果：

35、1、本發(fā)明提供的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合和試劑盒檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)漢灘病毒的檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)100％，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出目標(biāo)物質(zhì)，降低假陽(yáng)性或假陰性的概率；同時(shí)，還特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，只能檢測(cè)出漢灘病毒，而檢測(cè)不出與漢灘病毒有親緣關(guān)系的新疆出血熱病毒、馬爾堡病毒、埃博拉病毒；

36、2、本發(fā)明提供的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合和試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有高效性，試劑盒的操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)業(yè)操作人員，測(cè)試速度迅速，可通過(guò)肉眼觀(guān)察紫外下熒光強(qiáng)度或試紙條條帶進(jìn)行結(jié)果判讀，能夠加快檢測(cè)流程，節(jié)省時(shí)間和人力資源；

37、3、本發(fā)明提供的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合和試劑盒在用于檢測(cè)檢測(cè)病毒htnv亞型非診斷目的的應(yīng)用時(shí)，具有經(jīng)濟(jì)性，相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法，本發(fā)明試劑盒無(wú)需使用大型儀器設(shè)備，具有較低的成本，有利于批量生產(chǎn)和推廣應(yīng)用；

38、4、本發(fā)明提供的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合和試劑盒使用方便，試劑盒設(shè)計(jì)緊湊，易于攜帶和儲(chǔ)存，適合在醫(yī)院、診所及戶(hù)外大規(guī)模篩查中使用；

39、5、本發(fā)明提供的基于rpa-crispr/cas12a體系檢測(cè)漢坦病毒htnv亞型的試劑組合和試劑盒在使用時(shí)，合成方法更為環(huán)保，使用的原材料無(wú)毒害，降低了環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)。