本發(fā)明公開了一種利用i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，開發(fā)出一種擴(kuò)大及可移動(dòng)編輯窗口的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（i-f?cast?qcascade?abe），具有擴(kuò)大及可移動(dòng)的靶向范圍。相對(duì)于abe8e系統(tǒng)擴(kuò)大了靶向范圍，且可通過(guò)改變crrna?spacer長(zhǎng)度移動(dòng)編輯窗口，具有良好的應(yīng)用前景，屬于生物。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、堿基編輯器助于研究基因內(nèi)突變的影響和治療遺傳疾病，目前的堿基編輯器主要包含與改變?dna?堿基的酶融合的催化受損的?cas9?或?cas12?直系同源物，然而，使用i型crispr的cascade進(jìn)行堿基編輯的潛力尚未被探索。目前的堿基編輯窗口受限于?cas9?或cas12?的?r?環(huán)大小，cas9?或?cas12?衍生的?abe8e?通常具有小于12?nt的窗口。i?型系統(tǒng)可誘導(dǎo)較大的r環(huán)，這種延伸的r環(huán)可以為?ssdna?脫氨酶或糖基化酶提供更多的核苷酸底物，可能具有更多可靶向位點(diǎn)，并且可以誘導(dǎo)更多種類的突變類型。較寬的編輯窗口對(duì)于破壞功能序列很有用，例如破壞感染相關(guān)基因或基因治療的抑制基因。

2、i-f3?型?crispr?相關(guān)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)通過(guò)cascade-tniq?復(fù)合物進(jìn)行靶向，引導(dǎo)轉(zhuǎn)座子?dna?插入特定靶位。與典型i型crispr系統(tǒng)通過(guò)cas11與nts相互作用固定r-loop不同，i-f3通過(guò)tniq固定r-loop，使其與dna穩(wěn)定結(jié)合。

3、為了探索?i?型系統(tǒng)在堿基編輯方面的潛力，擴(kuò)展i型系統(tǒng)在真核細(xì)胞中的應(yīng)用，開發(fā)具有獨(dú)特編輯窗口的新堿基編輯器是本發(fā)明的目的所在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種利用i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，包括tn7016?i-f3b的cascade復(fù)合物與?tniq?轉(zhuǎn)座蛋白和crdna序列；涉及一種新的堿基編輯工具（i-f?cast?qcascade?abe），具有獨(dú)特編輯窗口，擴(kuò)展一型crispr系統(tǒng)在真核細(xì)胞中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明公開了一種利用i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，包括tada-8e和i-f?cast的靶向元件（cas6、cas7、cas8、tniq）；tada-8e分別構(gòu)建在cas6、cas7、cas8的c端及tniq的n端。通過(guò)對(duì)比，?cas7-tada及cas8-tada分別與qcascade其他元件共表達(dá)，可產(chǎn)生有效編輯。其中cas8-tada與qcascade其他元件共表達(dá)得到編輯效率最佳的新型abe系統(tǒng)i-f?cast?qcascade?abe。

3、本發(fā)明所述的一種利用i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，其特征在于：基于i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的堿基編輯系統(tǒng)，相對(duì)于abe8e系統(tǒng)（a4-a8），i-fcast?qcascade?abe具有更廣泛編輯窗口（a6-a18），且可通過(guò)改變crrna?spacer長(zhǎng)度移動(dòng)編輯窗口。

4、本發(fā)明所說(shuō)的i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

5、i-f?cast?qcascade?abe的構(gòu)建與hek293t細(xì)胞驗(yàn)證編輯效率；構(gòu)建各元件單表達(dá)質(zhì)粒，以及將tada-8e構(gòu)建連接到（cas6、cas7、cas8、tniq）載體當(dāng)中，得到cas8-tada、tniq、cas7、cas6、tada-tniq、cas7-tada、cas6-tada、cas8表達(dá)質(zhì)粒，連接tada-8e的元件與qcascade其他元件共表達(dá)，第一組為tada-tniq、cas6、cas7、cas8，第二組為tniq、cas7-tada、cas8、cas6，第三組為tniq、cas7、cas8-tada、cas6，第四組為tniq、cas7、cas8、cas6-tada。四種組合質(zhì)粒在4個(gè)hek293t細(xì)胞位點(diǎn)（oxa1l-1，oxa1l-3，bcl11a-1，oxa1l-2）驗(yàn)證堿基編輯的效率，第二種組合（tniq、cas7-tada、cas8、cas6）和第三種組合（tniq、cas7、cas8-tada、cas6）可以進(jìn)行有效編輯。其中，第三組（tniq、cas7、cas8-tada、cas6）可實(shí)現(xiàn)最佳編輯效率。第二組（tniq、cas7-tada、cas8、cas6）命名為i-f?cast?qcascade?cas7-tada?abe。第三組（tniq、cas7、cas8-tada、cas6）命名為i-f?cast?qcascade?abe。

6、i-f?cast?qcascade?abe系統(tǒng)窗口的表征，在8個(gè)位點(diǎn)評(píng)估了i-f?cast?qcascadeabe的編輯活性，并表征編輯窗口為a6-a18。

7、i-f?cast?qcascade?abe在三個(gè)位點(diǎn)評(píng)估改變crrna?spacer長(zhǎng)度對(duì)窗口的影響，隨著crrna?spacer長(zhǎng)度的縮短或增加，編輯窗口分別向pam近端或遠(yuǎn)端移動(dòng)。

8、本發(fā)明的積極效果在于：提供了一種新的堿基編輯工具（i-f?cast?qcascadeabe），基于i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的堿基編輯系統(tǒng)，相對(duì)于abe8e系統(tǒng)，i-f?castqcascade?abe具有更廣泛且可調(diào)的編輯窗口，有助于人們對(duì)應(yīng)不同的突變位點(diǎn)、不同突變位置時(shí)有不同的選擇。

技術(shù)特征：

1.一種利用i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，其特征在于：

2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的一種利用i型crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種利用I型CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，開發(fā)出一種擴(kuò)大及可移動(dòng)編輯窗口的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（I?F?CAST?QCascade?ABE），具有擴(kuò)大及可移動(dòng)的靶向范圍。相對(duì)于ABE8e系統(tǒng)擴(kuò)大了靶向范圍，且可通過(guò)改變crRNA?spacer長(zhǎng)度移動(dòng)編輯窗口，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：李占軍,牛文超,錢育強(qiáng),王迪,龔恒,趙丁,高汛,陳佳惠,于紅亮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30