本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種促進(jìn)血管形成的重組人iii型膠原蛋白及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是哺乳動物中最重要和最豐富的蛋白質(zhì)之一，在人體的皮膚、結(jié)締組織和骨骼以及其它組織中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白。在人體內(nèi)膠原蛋白的含量約為總蛋白質(zhì)的30％。膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。iii型膠原蛋白由三條肽鏈向右卷曲扭成三股螺旋狀。一級結(jié)構(gòu)分析表明，其多肽鏈很長的區(qū)段序列是由gly-x-y氨基酸序列重復(fù)而成。其中，x通常為脯氨酸，y通常為羥脯氨酸和羥賴氨酸，后兩種氨基酸在其他蛋白質(zhì)中很少見。

2、膠原蛋白的免疫原性低，具有促進(jìn)組織修復(fù)、止血等功能，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)材料、藥品等領(lǐng)域?，F(xiàn)階段，膠原蛋白主要從動物組織中提取得到，然而來源于動物組織的材料都存在病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，如瘋牛病等。同時，天然膠原蛋白廣泛存在于皮膚組織和血管，在生物體的生長和傷口愈合過程中表達(dá)上調(diào)，但天然膠原蛋白促血管生成率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)血管生成的重組人iii型膠原蛋白及其制備方法與應(yīng)用，解決了天然膠原蛋白促血管生成率低的問題。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種促進(jìn)血管形成的重組人ⅲ型膠原蛋白，氨基酸序列如seq?id?no.1所示，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3、所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備心血管支架材料或人工血管。

4、所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備皮膚組織修復(fù)材料。

5、所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備治療心血管疾病的制劑。

6、一種表達(dá)載體，包含如seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

7、一種宿主細(xì)胞，包含上述的表達(dá)載體。

8、所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的任意一種。

9、一種利用所述宿主細(xì)胞制備重組人ⅲ型膠原蛋白的方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組人ⅲ型膠原蛋白表達(dá)后進(jìn)行純化，獲得重組人ⅲ型膠原蛋白。

10、所述純化的方法選自鹽析法、超濾法、親和層析法和凝膠過濾層析法中的任意一種

11、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明將全長天然iii型膠原蛋白的9個不同位點(diǎn)替換成來自i型膠原蛋白的與整合素位點(diǎn)特異性結(jié)合的gfoger序列，在不改變天然全長氨基酸總長度的情況下增強(qiáng)其促血管生成功能，同時還替換了4個粘附率較低的天然整合素位點(diǎn)，使重組iii型膠原蛋白具有較高的黏附力進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。通過這種改造方式將將血管形成率提高37％以上，且其翻譯的蛋白分子量適中，容易制備

12、本發(fā)明的重組膠原蛋白進(jìn)行密碼子優(yōu)化可更好的適應(yīng)宿主菌。

13、本發(fā)明的重組膠原蛋白去除膠原編碼區(qū)c-端、n-端的全長鏈序列，有效地避免了一系列抗原免疫反應(yīng)。

14、本發(fā)明制備的重組膠原蛋白由畢赤酵母工程菌表達(dá)而得，該蛋白無內(nèi)毒素隱患，且該蛋白不攜帶組氨酸標(biāo)記，可通過分子篩進(jìn)行純化，最終直接可得目的蛋白，不需要額外切除組氨酸標(biāo)記序列。

15、本發(fā)明的方法所制備的基因重組膠原蛋白，可顯著促進(jìn)血管生成，應(yīng)用于心血管疾病以及傷口愈合及皮膚修復(fù)中，并且不會造成免疫排斥，可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)用材料、化妝品等領(lǐng)域。

16、本發(fā)明的重組人iii型膠原蛋白制備方法適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并且制備出的產(chǎn)品沒有動物來源的感染源，因此生物安全性更高

技術(shù)特征：

1.一種促進(jìn)血管形成的重組人ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種編碼如權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備心血管支架材料或人工血管。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備皮膚組織修復(fù)材料。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備治療心血管疾病的制劑。

6.一種表達(dá)載體，其特征在于，包含如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。

7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的任意一種。

9.利用權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞制備重組人ⅲ型膠原蛋白的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組人ⅲ型膠原蛋白表達(dá)后進(jìn)行純化，獲得重組人ⅲ型膠原蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，純化的方法選自鹽析法、超濾法、親和層析法和凝膠過濾層析法中的任意一種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)血管形成的重組人III型膠原蛋白及其制備方法與應(yīng)用。一種促進(jìn)血管形成的重組人Ⅲ型膠原蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明將全長天然III型膠原蛋白的9個不同位點(diǎn)替換成來自I型膠原蛋白的與整合素位點(diǎn)特異性結(jié)合的GFOGER序列，在不改變天然全長氨基酸總長度的情況下增強(qiáng)其促血管生成功能，同時還替換了4個粘附率較低的天然整合素位點(diǎn)，使重組III型膠原蛋白具有較高的黏附力進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。通過這種改造方式將將血管形成率提高37％以上，且其翻譯的蛋白分子量適中，容易制備。

技術(shù)研發(fā)人員：李偉娜,張雅倩,范代娣,宇文偉剛,牛子陽,萬喆
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西北大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2