本發(fā)明涉及細(xì)胞內(nèi)mirna原位成像的探針設(shè)計(jì)，特別涉及多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)及其在mirna-21成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是人類的主要死亡原因之一，極大威脅人類健康，給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來重大負(fù)擔(dān)。microrna（mirna）是一種重要的內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)因子，參與人體/動(dòng)物體內(nèi)包括發(fā)育、分化、凋亡和增殖在內(nèi)的眾多生物過程，其異常表達(dá)已被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，部分上調(diào)的mirna可阻止下游蛋白質(zhì)的表達(dá)，并影響眾多與癌癥相關(guān)的通路，在癌癥起始到發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段都發(fā)揮作用。因此，對(duì)癌細(xì)胞中過表達(dá)的靶標(biāo)mirna進(jìn)行精準(zhǔn)成像，對(duì)科研人員了解癌癥的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。然而，癌細(xì)胞內(nèi)mirna的豐度較低，其精準(zhǔn)成像受到靈敏度不足的嚴(yán)重阻礙。

2、目前，行業(yè)內(nèi)已開發(fā)了眾多mirna信號(hào)放大策略來提高mirna檢測(cè)的靈敏度。其中，酶輔助的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，如滾環(huán)擴(kuò)增和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增，在活體應(yīng)用時(shí)受到了嚴(yán)重限制。傳統(tǒng)的無酶信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，如雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hcr）和催化發(fā)夾組裝系統(tǒng)（cha），其使用的探針通常一直處于激活狀態(tài)。然而靶標(biāo)mirna通常也會(huì)以不可忽略的水平存在于目標(biāo)區(qū)域之外，這就使得傳統(tǒng)探針的擴(kuò)增反應(yīng)在到達(dá)目標(biāo)區(qū)域之前便被靶標(biāo)被動(dòng)觸發(fā)，導(dǎo)致出現(xiàn)嚴(yán)重的背景信號(hào)干擾。因此，開發(fā)一種穩(wěn)定可靠的方法以實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)mirna的高靈敏度、特異性成像成為目前行業(yè)內(nèi)的迫切需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)及其在mirna-21成像中的應(yīng)用，這種多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)對(duì)mirna-21檢測(cè)具有特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了mirna-21時(shí)空間可控的放大成像。具體通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

2、一種多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

3、設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針h1和h2；所述分子信標(biāo)探針h1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，并且所述分子信標(biāo)探針h1在核苷酸序列自3’端起的第8和第9個(gè)堿基之間嵌入二硫鍵，第15個(gè)堿基上修飾熒光基團(tuán)cy3；所述分子信標(biāo)探針h2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，并且所述分子信標(biāo)探針h2在核苷酸序列自3’端起的第8和第9個(gè)堿基之間嵌入光裂解連接鍵（pc-linker），在5’端修飾熒光基團(tuán)cy5；

4、所述多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)用于檢測(cè)mirna-21。

5、進(jìn)一步地，多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)的構(gòu)建方法還包括以下步驟：

6、制備水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒，將多聚賴氨酸包覆在所述水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒上，將多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒和所述分子信標(biāo)探針h1和h2混合，孵育，得到多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)。

7、本發(fā)明提供的上述多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)的構(gòu)建方法中，通過熱解法制備油相上轉(zhuǎn)換納米顆粒，然后將油相上轉(zhuǎn)換納米顆粒通過酸乙醇和超純水離心清洗，制備得到能夠?qū)㈤L(zhǎng)波長(zhǎng)近紅外光轉(zhuǎn)換為短波長(zhǎng)紫外光，且均一的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒ucnps；再將多聚賴氨酸和水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒室溫?cái)嚢杼幚?，得到多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒；最后將多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒，與分子信標(biāo)探針h1和h2（兩者組合即m-cha）混合孵育，即可得到m-cha/u復(fù)合物，即多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)。

8、本發(fā)明提供的多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，既可以僅包含分子信標(biāo)探針h1和h2，也可以將分子信標(biāo)探針h1和h2與多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒結(jié)合，制成m-cha/u復(fù)合物。根據(jù)檢測(cè)mirna-21的環(huán)境條件不同，選擇合適的多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)。當(dāng)檢測(cè)試管等非細(xì)胞環(huán)境中的mirna-21時(shí)，直接將分子信標(biāo)探針h1和h2加至待測(cè)樣品中，并加入gsh（谷胱甘肽），進(jìn)行孵育和檢測(cè)。

9、進(jìn)一步地，多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒、分子信標(biāo)探針h1和h2的摩爾比為1:(30-50)?:(30-50)。

10、更進(jìn)一步地，多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒、分子信標(biāo)探針h1和h2的摩爾比為1:50:50。

11、本發(fā)明還提供了一種分子信標(biāo)探針組合，所述分子信標(biāo)探針h1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，并且所述分子信標(biāo)探針h1在核苷酸序列自3’端起的第8和第9個(gè)堿基之間嵌入二硫鍵，第15個(gè)堿基上修飾熒光基團(tuán)cy3；所述分子信標(biāo)探針h2的核苷酸序列如seqid?no.2所示，并且所述分子信標(biāo)探針h2在核苷酸序列自3’端起的第8和第9個(gè)堿基之間嵌入光裂解連接鍵（pc-linker），在5’端修飾熒光基團(tuán)cy5；所述分子信標(biāo)探針組合用于檢測(cè)mirna-21。

12、本發(fā)明還提供了一種多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，采用上述任意一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

13、本發(fā)明提供的上述多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，技術(shù)關(guān)鍵在于采用了針對(duì)mirna-21的分子信標(biāo)探針。其中，分子信標(biāo)探針h1在序列自3’端起的第8和第9個(gè)堿基之間嵌入二硫鍵，其作用是利用其能夠響應(yīng)gsh刺激發(fā)生斷裂的能力，實(shí)現(xiàn)h1在gsh刺激下進(jìn)行激活；在第15個(gè)堿基上修飾熒光基團(tuán)cy3，其作用是作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）的供體，當(dāng)發(fā)生fret時(shí)，cy3能夠?qū)⒆陨戆l(fā)射的能量傳遞給受體；分子信標(biāo)探針h2在序列自3’端起的第8和第9個(gè)堿基之間嵌入光裂解連接鍵（pc-linker），其作用是利用其能夠響應(yīng)紫外光（uv）刺激發(fā)生斷裂的能力，實(shí)現(xiàn)在nir輻照下，上轉(zhuǎn)換納米顆粒將nir轉(zhuǎn)換為uv對(duì)h2進(jìn)行激活。分子信標(biāo)探針h2在序列5’端修飾熒光基團(tuán)cy5，其作用是作為fret的受體，通過接收來自供體的能量，進(jìn)行自身對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射。

14、分子信標(biāo)探針h1和h2，以及mirna-21的核苷酸序列如下表1所示。

15、表1

16、

17、腫瘤組織相對(duì)于正常組織其gsh表達(dá)量明顯升高，探針h1只有在腫瘤組織中才會(huì)被激活，因此本發(fā)明提供的多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)在腫瘤組織與正常組織中的激活情況有區(qū)別，具有空間可控的成像能力。由于只有使用nir光照射時(shí)，h2上的pclinker才會(huì)斷裂，在時(shí)間上可以根據(jù)操作者的需要在特定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行激活，使得本發(fā)明具有時(shí)間可控的成像能力，即實(shí)現(xiàn)了mirna-21時(shí)空間可控的放大成像。

18、本發(fā)明還提供了上述分子信標(biāo)探針組合的應(yīng)用用途，具體用于不以疾病診斷和治療為目的的檢測(cè)非細(xì)胞環(huán)境中的mirna-21。

19、進(jìn)一步地，上述應(yīng)用用途中，當(dāng)檢測(cè)環(huán)境為非細(xì)胞環(huán)境時(shí)，將待測(cè)樣品裝入檢測(cè)容器中，加入所述分子信標(biāo)探針組合和gsh；對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行紫外燈照射，然后常溫孵育；最后檢測(cè)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度完成檢測(cè)。

20、本發(fā)明還提供了上述多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)的應(yīng)用用途，具體用于用于不以疾病診斷和治療為目的的檢測(cè)細(xì)胞環(huán)境中的mirna-21。

21、本發(fā)明聲稱的“不以疾病診斷和治療為目的”，是指非臨床條件下（例如在實(shí)驗(yàn)室科研或教學(xué)過程中），進(jìn)行細(xì)胞環(huán)境或非細(xì)胞環(huán)境中的mirna-21檢測(cè)。即只要不直接用于診斷或治療人體或動(dòng)物體的與囊泡病毒相關(guān)的疾病/癥狀的應(yīng)用場(chǎng)景，都可以采用本發(fā)明提供的上述技術(shù)手段。容易想到的是，在臨床中，也可以考慮采用本發(fā)明提供的納米發(fā)夾探針組合進(jìn)行mirna-21檢測(cè)。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：

23、1、本發(fā)明構(gòu)建的多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)通過將二硫鍵和光裂解連接體作為擴(kuò)增的門控單元，在進(jìn)行臨床或非臨床條件下進(jìn)行mirna-21檢測(cè)與成像時(shí)具有優(yōu)異的靈敏度和特異性。

24、2、本發(fā)明構(gòu)建的多變量門控信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)利用多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒作為近紅外光轉(zhuǎn)紫外光的轉(zhuǎn)換器，避免了直接使用外源紫外光對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行激活，極大提高光穿透深度與生物相容性；多聚賴氨酸包覆的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒作為探針載體，在進(jìn)行細(xì)胞成像時(shí)還具有良好的細(xì)胞內(nèi)探針遞送效率和時(shí)空分辨率。