本發(fā)明涉及檢測試劑盒，尤其涉及基因甲基化子宮內膜癌檢測試劑盒。

背景技術：

1、子宮內膜癌是發(fā)生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，好發(fā)于圍絕經期及絕經后的婦女，近年來呈年輕化趨勢，早期(i期、ii期)子宮內膜癌患者的五年生存率達70％以上，iii期患者的五年生存率約為40-50％，而iv期患者的五年生存率僅為15-20％。因此，實現子宮內膜癌的早期診斷是改善患者預后的重要舉措。子宮內膜癌的早期診斷方法有診斷性刮宮、細胞學檢查、經陰道超聲和宮腔鏡檢查等，但這些診斷方法均存在一定的弊端。臨床診斷主要依靠診斷性刮宮，該方法取樣有創(chuàng)傷，哺乳期或浸潤型子宮內膜癌人群子宮壁薄弱，刮宮時可能造成子宮穿孔，給患者造成傷害；細胞學檢查最接近篩查策略，但當前缺乏統一的細胞學標準；經陰道超聲無法確定子宮內膜病變時內膜厚度的界值；宮腔鏡檢查費用高昂，且單獨運用診斷價值有限。因此，子宮內膜癌早期檢測亟需一種準確度高、方便且侵入性小的檢測方法。

2、根據目前的臨床資料研究，預后與診斷時間密切相關，越早診斷(figo期i-ii)預后越好，如5年生存率從i期的85％下降到iv期的25％。目前，經陰道超聲掃描(transvaginal?ultrasound?scan，tvus)和子宮內膜活檢相結合是診斷ec的常用方法。然而，準確度存在很大的異質性，婦科腫瘤疾病的敏感性在0.5～0.8之間。另一方面，子宮內膜活檢不僅具有侵入性和不舒服，存在大量技術問題，而且受組織數量的限制。此外，診斷后的個性化治療也面臨很大的挑戰(zhàn)。例如，組織學分類的變化增加了病人護理的復雜性，使比較隨機試驗、作出治療決定和準確預測預后變得具有挑戰(zhàn)性。此外，許多尚未解決的研究問題仍然存在，從治療毒性，診斷程序到輔助治療。因此，可靠的診斷對于充分治療和降低ec死亡率是必要的。

3、lncrnas被認為是表觀遺傳調控網絡的重要組成部分，通過影響原蛋白、染色質和轉錄因子的結構來調控基因表達和后轉錄。許多研究顯示，一些lncrna會影響人類癌癥的多方面，如永久的復制、細胞死亡的拮抗和免疫監(jiān)視的逃避。因此，lncrna被用作許多癌癥診斷的生物標志物。基因啟動子cpg島的高甲基化可以使基因沉默。目前dna甲基化已被證明是一種高度穩(wěn)定的分子特征，可以在腫瘤組織和細胞中檢測到。本研究中，基于rp4/rp11/ctd多指標甲基化位點聯合診斷，建立子宮內膜癌診斷模型。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種檢測準確性高、操作便捷快速、可以為宮內膜癌的臨床診斷提供可靠參考依據的子宮內膜癌診斷試劑盒，內含引物，探針，反應試劑等，本檢測試劑盒檢測子宮內膜細胞收集器采集的宮頸表皮細胞樣本，篩查靈敏性和特異性都比較高。

2、為了實現上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

3、基因甲基化子宮內膜癌檢測試劑盒，包括：用于對rp4，rp11和ctd甲基化檢測的pcr反應液以及陰性對照和陽性對照，所述pcr反應液包括pcr反應液a和pcr反應液b；

4、所述pcr反應液a包括dntp、鹽離子組分、穩(wěn)定劑、dna聚合酶；

5、所述pcr反應液b包括rp4引物，rp11引物，ctd引物和gapdh引物，以及以及熒光探針。

6、本試劑盒基于熒光定量pcr原理，以甲基化pcr熒光探針法對宮頸表皮細胞樣本中rp4，rp11和ctd基因甲基化的檢測，檢測準確性高、操作便捷快速、可以為宮內膜癌的臨床診斷提供可靠參考依據。

7、優(yōu)選地，所述rp4引物包括rp4-616b8.5-f和rp4-616b8.5-r，正向引物序列為5’-atgagtgtggcagcctatgt-3’，反向引物序列為5’-aactcctgacctcgtgatcc-3’。

8、優(yōu)選地，所述rp11引物包括rp11-389g6.3-f和rp11-389g6.3-r，正向引物序列為5’-ggccttgagagatagagggg-3’，反向引物序列為5’-atacgtccttcccatcctgc-3’。

9、優(yōu)選地，所述ctd引物包括ctd-2377d24.6-f和ctd-2377d24.6-r，正向引物序列為5’-ttccggtgtccagatgttca-3’，反向引物序列為5’-aaggtgagttggggaggatg-3’。

10、優(yōu)選地，所述gapdh引物包括gapdh-f和gapdh-r，正向引物序列為5’-gcacagtcaaggctgagaatg-3’，反向引物序列為5’-atggtggtgaagacgccagta-3’。

11、基因甲基化子宮內膜癌檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

12、rna分離及qrt-pcr分析；

13、dna甲基化分析；

14、pcr擴增。

15、本產品對rp4，rp11和ctd甲基化檢測，在rp4，rp11和ctd基因啟動子與子宮內膜癌發(fā)生高度相關的cpg區(qū)域，針對經過重亞硫酸鹽轉化后的序列分別設計了特異性引物和熒光探針，可以在pcr反應中特異性的檢測出甲基化序列。

16、優(yōu)選地，所述rna分離及qrt-pcr分析的具體過程為：所述從受試者身上獲取新鮮組織樣本，用trizol試劑提取組織總rna，然后用primescript?rt試劑盒將rna轉化為cdna，使用hiff?qpcr?sybr?green?master?mix在quantstudio?6系統中檢測rp4、rp11和ctd中3′lncrnas的表達，將表達量歸一化為gapdh?mrna的含量，通過δct方法計算。

17、優(yōu)選地，所述dna甲基化分析的具體過程為：所述新鮮組織樣本為宮頸表皮細胞樣本，取自子宮內膜細胞收集器，使用tianamp基因組dna試劑盒提取基因組dna，獲得20份dna洗脫液，然后用125μl轉化液、500μl消化液和60μl?bs洗脫液處理亞硫酸氫鹽，進行亞硫酸氫鹽轉化，最后，在abi?7500設備上進行rp4/rp11/ctd?pcr擴增。

18、優(yōu)選地，所述pcr擴增的具體步驟包括：

19、預變性；

20、變性；

21、退火；

22、延伸；

23、檢測熒光。

24、優(yōu)選地，所述預變性時，溫度設置在95℃，持續(xù)時間為180秒，循環(huán)數為1次；

25、所述變性時，溫度設置在95℃，持續(xù)時間為10秒，循環(huán)數為45次；

26、所述退火、延伸和檢測熒光時，溫度設置在60℃，持續(xù)時間為32秒，循環(huán)數為45次。

27、與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

28、本試劑盒基于熒光定量pcr原理，以甲基化pcr熒光探針法對宮頸表皮細胞樣本中rp4，rp11和ctd基因甲基化的檢測，檢測準確性高、操作便捷快速、可以為宮內膜癌的臨床診斷提供可靠參考依據。

29、本產品對rp4，rp11和ctd甲基化檢測，在rp4，rp11和ctd基因啟動子與子宮內膜癌發(fā)生高度相關的cpg區(qū)域，針對經過重亞硫酸鹽轉化后的序列分別設計了特異性引物和熒光探針，可以在pcr反應中特異性的檢測出甲基化序列。