本發(fā)明屬于生物，涉及一種目標(biāo)組織捕獲裝置和方法及其在構(gòu)建空間分辨轉(zhuǎn)錄組文庫中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、單細(xì)胞級(jí)別的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中最關(guān)鍵的一步是有效捕獲感興趣的單細(xì)胞。其捕獲方法通常依賴于將細(xì)胞團(tuán)或組織塊通過機(jī)械或酶水解的方式轉(zhuǎn)變成單細(xì)胞懸浮液，但是該方法會(huì)導(dǎo)致單細(xì)胞的空間位置的丟失。單細(xì)胞分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組是通過對(duì)具有空間信息的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序而獲得的。基于微針的采樣技術(shù)與激光捕獲顯微切割(laser?capturemicrodissection,lcm)技術(shù)類似，是一種能夠從組織中分理出特定細(xì)胞群體或組織學(xué)區(qū)域、同時(shí)保留空間定位信息的技術(shù)，其發(fā)展使得特異性地對(duì)組織樣品中某一個(gè)或某一類細(xì)胞進(jìn)行空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究成為可能。冰凍切片比石蠟切片具有更少的rna降解，更適合開展空間分辨的轉(zhuǎn)錄組研究。此外，冰凍切片因其簡(jiǎn)單且無需固定而成為當(dāng)前單細(xì)胞級(jí)別空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中切片制備的主要方法。在進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得rna之前，在顯微鏡可視化條件下通過鋼針采樣獲得單細(xì)胞腦組織樣本。然而，目前使用的lcm技術(shù)只能從少量細(xì)胞中提取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)保留原始空間信息，并且價(jià)格昂貴且操作要求較高。

2、因此，需要開發(fā)簡(jiǎn)易且低成本的空間分辨轉(zhuǎn)錄組研究捕獲方法，而基于鋼針的采樣可以低成本且準(zhǔn)確捕獲靶細(xì)胞，同時(shí)保留結(jié)構(gòu)和空間數(shù)據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種能實(shí)現(xiàn)組織精準(zhǔn)采樣的微針采樣裝置。

2、本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了一種適用于空間分辨的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的單細(xì)胞級(jí)別冷凍組織切片目標(biāo)捕獲方法，本發(fā)明采用武藏鋼針的微量組織捕獲的方法，能夠顯著提高單個(gè)樣本的基因數(shù)目，提高捕獲準(zhǔn)確率至99％。

3、本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供了所述的微針采樣裝置和所述的冷凍組織切片目標(biāo)組織捕獲方法在構(gòu)建空間分辨轉(zhuǎn)錄組文庫和/或質(zhì)控及數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用。

4、技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種目標(biāo)組織捕獲裝置，所述目標(biāo)組織捕獲裝置從下至上包括底座、可移動(dòng)底板、設(shè)置在可移動(dòng)底板上的可制冷載物臺(tái)、底座一側(cè)固定設(shè)置有可升降的采樣裝置、所述采樣裝置上設(shè)有可拆卸的采樣微針，所述采樣微針位于可制冷載物臺(tái)的正上方，采樣微針上方設(shè)有帶光源的正置顯微鏡，所述正置顯微鏡通過升降裝置固定連接在底座的另一側(cè)，所述可移動(dòng)底板上的x軸和y軸方向分別設(shè)有帶刻度的標(biāo)尺以及控制其向x軸和/或y軸方向移動(dòng)的旋鈕。

5、其中，所述采樣微針包括武藏鋼針、32g針頭、34g針頭、4聯(lián)排針或正方形4針。

6、其中，所述武藏鋼針的內(nèi)徑為10-160μm。

7、本
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
還包括所述的微針采樣裝置在組織切片采樣中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明內(nèi)容還包括一種冷凍組織切片目標(biāo)組織捕獲方法，包括以下步驟：

9、(1)將冷凍組織切片置于所述的目標(biāo)組織捕獲裝置的可制冷載物臺(tái)上；

10、(2)通過旋鈕控制x軸和y軸的移動(dòng)方向，確定x軸和y軸的空間位置信息(x，y)坐標(biāo)后，將可升降的采樣裝置垂直向下進(jìn)行物理切割并采樣獲得目標(biāo)組織；所述(x，y)坐標(biāo)為(1-10cm，1-10cm)；

11、(3)采樣至針尖后，吹打收集至pcr管蓋上。

12、其中，步驟(1)中所述的冷凍組織切片的厚度為10-35μm。

13、其中，步驟(2)中所述(x，y)坐標(biāo)為(1cm，1cm)、(2cm，2cm)或(3cm，3cm)。

14、本發(fā)明內(nèi)容還包括所述的微針采樣裝置、所述的冷凍組織切片目標(biāo)組織捕獲方法在構(gòu)建空間分辨轉(zhuǎn)錄組文庫和/或質(zhì)控及數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用。

15、所述應(yīng)用包括將獲得的目標(biāo)組織上滴加單細(xì)胞裂解液，以完全覆蓋目標(biāo)組織為準(zhǔn)，在常溫下裂解5-10min，離心收集至pcr管底，將裂解得到的rna溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。

16、其中，所述轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建采用smart-seq2建庫方法。

17、有益效果：與現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組采樣方式如lcm相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：該空間分辨的鋼針采樣方法不僅能夠顯著提高空間轉(zhuǎn)錄組單個(gè)樣本的基因數(shù)目，而且準(zhǔn)確率及成功率比傳統(tǒng)采樣技術(shù)更高。另外，冷凍切片梯度降溫并用乙醇染色及褪色可以防止組織切片的裂開。該方法簡(jiǎn)單而且成本較低，不需要昂貴的設(shè)備或者非常難的技術(shù)操作，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室都易實(shí)現(xiàn)且應(yīng)用廣泛。

技術(shù)特征：

1.一種目標(biāo)組織捕獲裝置，其特征在于，所述目標(biāo)組織捕獲裝置從下至上包括底座、可移動(dòng)底板、設(shè)置在可移動(dòng)底板上的可制冷載物臺(tái)、底座一側(cè)固定設(shè)置有可升降的采樣裝置、所述采樣裝置上設(shè)有可拆卸的采樣微針，所述采樣微針位于可制冷載物臺(tái)的正上方，采樣微針上方設(shè)有帶光源的正置顯微鏡，所述正置顯微鏡通過升降裝置固定連接在底座的另一側(cè)，所述可移動(dòng)底板上的x軸和y軸方向分別設(shè)有帶刻度的標(biāo)尺以及控制其向x軸和/或y軸方向移動(dòng)的旋鈕。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)組織捕獲裝置，其特征在于，所述采樣微針包括武藏鋼針、32g針頭、34g針頭、4聯(lián)排針或正方形4針。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的目標(biāo)組織捕獲裝置，其特征在于，所述武藏鋼針的內(nèi)徑為10-160?μm。

4.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的目標(biāo)組織捕獲裝置在組織切片采樣中的應(yīng)用。

5.一種冷凍組織切片的目標(biāo)組織捕獲方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種冷凍組織切片目標(biāo)組織捕獲方法，其特征在于，步驟（1）中所述的冷凍組織切片的厚度為10-35?μm。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種冷凍組織切片目標(biāo)組織捕獲方法，其特征在于，步驟（2）中所述（x，y）坐標(biāo)為（1?cm，1?cm）、（2?cm，2?cm）或（3?cm，3?cm）。

8.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的目標(biāo)組織捕獲裝置、權(quán)利要求5~7任一項(xiàng)所述的冷凍組織切片目標(biāo)組織捕獲方法在構(gòu)建空間分辨轉(zhuǎn)錄組文庫和/或質(zhì)控及數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括將獲得的目標(biāo)組織上滴加單細(xì)胞裂解液，以完全覆蓋目標(biāo)組織為準(zhǔn)，在常溫下裂解5-10?min，離心收集至pcr管底，將裂解得到的rna溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建采用smart-seq2建庫方法。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種目標(biāo)組織捕獲裝置和方法及其在構(gòu)建空間分辨轉(zhuǎn)錄組文庫中的應(yīng)用，具體包括將冷凍組織切片置于貼有PDMS膜的玻片上，取出后置于制冷片上，然后通過武藏鋼針捕獲切割冷凍組織切片的痕量目標(biāo)組織，并收集至PCR管蓋中，加入裂解液完全覆蓋目標(biāo)組織，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫。通過梯度降溫及制冷片防止冷凍組織切片的快速降解，然后對(duì)采樣后的原始組織切片成像及測(cè)量確定空間位置。本發(fā)明的一種目標(biāo)組織捕獲裝置和方法能夠顯著提高空間轉(zhuǎn)錄組單個(gè)樣本的基因數(shù)目，準(zhǔn)確率及成功率比傳統(tǒng)采樣技術(shù)更高。

技術(shù)研發(fā)人員：周瑩,葛芹玉,陸祖宏
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30