本申請涉及柳藍(lán)葉甲的，具體涉及crispr/cas9的引導(dǎo)序列、引物、試劑盒、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、柳藍(lán)葉甲(plagiodera?versicolora(laicharting))，又名柳圓葉甲，屬鞘翅目(coleoptera)葉甲科(chrysomelidae)昆蟲。柳藍(lán)葉甲是危害楊樹、柳樹等楊柳科植物重要害蟲。它的分布范圍特別廣。柳藍(lán)葉甲成蟲和幼蟲均取食葉片，葉片被危害后，殘留網(wǎng)狀葉脈，致使葉片常卷曲變褐而枯死，嚴(yán)重影響林木的生長。由于柳藍(lán)葉甲生活史時間短，活動范圍廣，一年可發(fā)生多代，在短時間內(nèi)種群可達(dá)到驚人的數(shù)量，每年7-9月為爆發(fā)期，對我國楊柳科植物造成嚴(yán)重的破壞。

2、通過對柳藍(lán)葉甲進(jìn)行基因編輯，研究rna干擾相關(guān)基因功能，促進(jìn)具備安全、對環(huán)境友好特點的rna農(nóng)藥在防治柳藍(lán)葉甲上的應(yīng)用，這對生物農(nóng)藥的發(fā)展具有十分重要的廣闊意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請發(fā)明人利用crispr/cas9技術(shù)，研發(fā)了crispr/cas9的引導(dǎo)序列、引物、試劑盒、方法及應(yīng)用，能夠?qū)α{(lán)葉甲的參與dsrna運輸?shù)目缒さ鞍紫嚓P(guān)編碼基因進(jìn)行敲除，以驗證該蛋白對dsrna具體轉(zhuǎn)運機制，為研制針對柳藍(lán)葉甲的核酸農(nóng)藥提供研究基礎(chǔ)，這對柳藍(lán)葉甲及其他鞘翅目農(nóng)業(yè)害蟲防治具有十分重要的廣闊前景。此外，研究該基因可以為rna農(nóng)藥在其他害蟲防治上研究提供基礎(chǔ)。

2、為此，本申請實施例至少公開了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，實施例公開了crispr/cas9的引導(dǎo)序列，包括如seq?id?no:1或2所示的rna或dna分子，以及如seq?id?no:3或4所示的rna或dna分子。該如seq?id?no:1～4所示的引導(dǎo)序列引導(dǎo)cas9對柳藍(lán)葉甲的進(jìn)行跨膜蛋白相關(guān)編碼基因sidt1進(jìn)行切割以影響相關(guān)基因表達(dá)。其中，如seq?id?no:2所述的dna分子可被轉(zhuǎn)錄得到如seq?id?no:1所述的rna，如seq?id?no:4所述的dna分子可被轉(zhuǎn)錄得到如seq?id?no:3所述的rna。

4、第二方面，實施例公開了crispr/cas9的引導(dǎo)序列，包括如seq?id?no:5或6所示的rna或dna分子，以及如seq?id?no:7或8所示的rna或dna分子。該如seq?id?no:5～8所示的引導(dǎo)序列引導(dǎo)cas9對柳藍(lán)葉甲的進(jìn)行跨膜蛋白相關(guān)編碼基因sidt2進(jìn)行切割以影響相關(guān)基因表達(dá)。其中，如seq?id?no:6所述的dna分子可被轉(zhuǎn)錄得到如seq?id?no:5所述的rna，如seq?id?no:8所述的dna分子可被轉(zhuǎn)錄得到如seq?id?no:7所述的rna。

5、第三方面，實施例公開了第一引物組，包括如seq?id?no:9～12所述的dna分子。

6、第四方面，實施例公開了第二引物組，包括如seq?id?no:13～16所述的dna分子。

7、第五方面，實施例公開了一種試劑盒，包括如seq?id?no:1所示rna、如seq?id?no:3所示rna及seq?id?no:17所示的cas9酶。

8、第六方面，實施例公開了一種試劑盒，包括如seq?id?no:5所示rna、如seq?id?no:7所示rna及seq?id?no:17所示的cas9酶。

9、第七方面，實施例公開了一種敲除柳藍(lán)葉甲基因的方法，包括將第一方面所述的引導(dǎo)序列及cas9導(dǎo)入注射至柳藍(lán)葉甲卵的步驟。

10、第八方面，實施例公開了一種敲除柳藍(lán)葉甲基因的方法，包括將第二方面所述的引導(dǎo)序列及cas9導(dǎo)入注射至柳藍(lán)葉甲卵的步驟。

11、第九方面，實施例公開了第一或二方面所述的引導(dǎo)序列、第三或四方面所述的引物組、第五或六方面所述的試劑盒的應(yīng)用。所述應(yīng)用選自構(gòu)建基因敲除的柳藍(lán)葉甲品系、制備柳藍(lán)葉甲防治的制劑中至少一項。

技術(shù)特征：

1.crispr/cas9的引導(dǎo)序列，包括如seq?id?no:1或2所示的rna或dna分子，以及如seqid?no:3或4所示的rna或dna分子。

2.crispr/cas9的引導(dǎo)序列，包括如seq?id?no:5或6所示的rna或dna分子，以及如seqid?no:7或8所示的rna或dna分子。

3.引物組，包括如seq?id?no:9～12所示的dna分子。

4.引物組，包括如seq?id?no:13～16所示的dna分子。

5.一種試劑盒，包括如seq?id?no:1所示rna、如seq?id?no:3所示rna及seq?id?no:17所示的cas9酶。

6.一種試劑盒，包括如seq?id?no:5所示rna、如seq?id?no:7所示rna及seq?id?no:17所示的cas9酶。

7.一種敲除柳藍(lán)葉甲基因的方法，包括將如權(quán)利要求1所述的引導(dǎo)序列及cas9導(dǎo)入注射至柳藍(lán)葉甲卵的步驟。

8.一種敲除柳藍(lán)葉甲基因的方法，包括將如權(quán)利要求2所述的引導(dǎo)序列及cas9導(dǎo)入注射至柳藍(lán)葉甲卵的步驟。

9.如權(quán)利要求1或2所述的引導(dǎo)序列、如權(quán)利要求3或4所述的引物組、如權(quán)利要求5或6方面所述的試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng)用選自構(gòu)建基因敲除的柳藍(lán)葉甲品系、制備柳藍(lán)葉甲防治的制劑中至少一項。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及柳藍(lán)葉甲的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及CRISPR/Cas9的引導(dǎo)序列、引物、試劑盒、方法及應(yīng)用。所述引導(dǎo)序列如SEQ?ID?NO:1～8所示。引物如SEQ?ID?NO:9～16所示。試劑盒包括引導(dǎo)序列及Cas9。方法包括將引導(dǎo)序列及Cas9導(dǎo)入柳藍(lán)葉甲卵的步驟。應(yīng)用包括構(gòu)建柳藍(lán)葉甲基因突變品系。通過對柳藍(lán)葉甲進(jìn)行基因編輯，驗證基因功能，為研究核酸農(nóng)藥提供基礎(chǔ)，這對柳藍(lán)葉甲及其他鞘翅目農(nóng)業(yè)害蟲防治具有十分重要的廣闊前景。

技術(shù)研發(fā)人員：張江,方康,雍銳,廖重宇,王學(xué)志
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30