本發(fā)明涉及snp標(biāo)記，具體涉及一種用于檢測花椒銹病的snp標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、花椒銹病是由花椒鞘銹菌(coleosporium?zanthoxyli)引起的真菌性病害?；ń蜂P病是花椒栽培區(qū)普遍發(fā)生的葉部病害，花椒銹病主要危害葉片，尤其是幼嫩的葉片，少部分會危害花椒的果實(shí)、葉柄，可引起花椒葉片的大量脫落，從而導(dǎo)致花椒樹重新萌發(fā)出新葉，這不僅影響當(dāng)年椒樹的營養(yǎng)積累及翌年的花椒產(chǎn)量和品質(zhì)，更重要的是對花椒樹的壽命有很大的威脅。我國在花椒銹病防控方面主要采取化學(xué)防治方法，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，且對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因此迫切需要尋找和建立綠色的防控方法，目前抗病品種的開發(fā)利用是目前防治病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前普遍采用田間長期觀察和人工接種病原物方法來評價(jià)不同品種(無性系)花椒對銹病的抗性，但田間長期觀察的周期比較長且受環(huán)境影響較大，然而人工接種病原物的評價(jià)方法不能完全模擬自然環(huán)境條件，其結(jié)果不完全可靠。尋找準(zhǔn)確快速的抗性鑒定方法是花椒抗銹病育種研究進(jìn)程中的中關(guān)鍵問題。

2、單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphisms)主要是指在基因組序列中由于單個(gè)核苷酸的替換而引起的多態(tài)性，在所有遺傳變異中最為豐富。snp作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，與前兩代分子標(biāo)記相比，snp具有標(biāo)記密度高，分布廣泛；可以自動化檢測與規(guī)模化篩選；代表性強(qiáng)；遺傳穩(wěn)定，突變頻率低等優(yōu)點(diǎn)，雖然對植物的研究起步晚，但是發(fā)展十分迅速。隨著測序技術(shù)的成熟以及成本的降低，木本植物基因組中snp快速檢測成為可能且技術(shù)愈發(fā)成熟，snp標(biāo)記輔助育種手段越來越受關(guān)注。植物病害的發(fā)生十分頻繁和廣泛，在生產(chǎn)上造成十分嚴(yán)重不良的影響，然而在我們生產(chǎn)上存在許多生長周期比較長的植物種類，抗病育種的方法是目前大家都比較認(rèn)可的病害防治的方法，但是針對一些生長周期比較長的植物來說，該種方法的效率是十分低下的。然而運(yùn)用分子標(biāo)記輔助育種選擇能夠在很大程度上提高我們的育種效率。另一方面在之前表現(xiàn)抗病的品種很可能會因?yàn)闀r(shí)間推移而失去抗病性，給花椒的抗病育種帶來了極大的考驗(yàn)。因此，不斷的選育新的抗病品種尤為重要。

3、抗病育種離不開抗病性鑒定，傳統(tǒng)的人工接種鑒定和田間長期觀察會因?yàn)槿藶榧碍h(huán)境因素的干擾判斷標(biāo)準(zhǔn)會有所差異。因此在花椒幼苗期時(shí)通過分子標(biāo)記的技術(shù)對不同品種的抗病性進(jìn)行鑒定，挑選出抗病品種進(jìn)行培育，能夠節(jié)約很多時(shí)間，將育種周期大幅度縮短。但花椒分子生物學(xué)進(jìn)展相對其他木本植物緩慢，目前尚未見到開發(fā)篩選與花椒銹病抗性基因相關(guān)的snp分子標(biāo)記的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測花椒銹病的snp標(biāo)記及應(yīng)用，以提供一種快速檢測花椒銹病的分子生物學(xué)方法。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種用于檢測花椒銹病的snp標(biāo)記，snp標(biāo)記為30616-314，snp標(biāo)記所在基因序列如seq?id?no.1所示，其中，snp標(biāo)記在上述基因序列5’端起的第314位堿基；snp標(biāo)記的堿基為t或c。

3、本發(fā)明提供了一種用于檢測上述花椒銹病的snp標(biāo)記的引物組，引物組包括公共引物30616-314-f、正常堿基引物30616-314-r1和突變堿基引物30616-314-r2；其中30616-314-f的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；30616-314-r1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；30616-314-r2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

4、本發(fā)明提供了一種用于檢測上述snp標(biāo)記的試劑盒，包含上述的引物組。

5、本發(fā)明提供了一種上述snp標(biāo)記或上述引物組或上述試劑盒在花椒抗病育種中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提供了一種檢測花椒銹病的方法，通過對待測花椒進(jìn)行上述的snp標(biāo)記的檢測，確定花椒的抗花椒銹病類型。

7、進(jìn)一步，具體步驟如下：

8、(1)提取待測花椒基因組dna；

9、(2)利用上述中的三條引物分別組成正常堿基引物對30616-314-f、30616-314-r1和突變堿基引物對30616-314-f、30616-314-r2，分別采用正常堿基引物對和突變堿基引物對步驟(1)中的待測花椒基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

10、(3)對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，確定待測花椒的抗花椒銹病類型；若僅在突變堿基引物對擴(kuò)增出條帶，說明待測花椒為高抗花椒銹病花椒；若在突變堿基引物對和正常堿基引物對都擴(kuò)增出條帶，說明待測花椒為中等抗花椒銹病花椒；若在突變堿基引物對未擴(kuò)增出條帶，說明待測花椒為感花椒銹病花椒。

11、本發(fā)明具有以下有益效果：本研究根據(jù)前期田間鑒定和接種病原物鑒定結(jié)果，基于健康和發(fā)病的抗性種和易感品種花椒轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，通過分析抗病及感病花椒品種(無性系)中差異基因表達(dá)情況以及相關(guān)的基因功能注釋結(jié)果，篩選可能與抗性相關(guān)的基因，尋找可能與抗花椒銹病相關(guān)snp標(biāo)記，并使用等位基因特異pcr技術(shù)對snp標(biāo)記進(jìn)行基因分型，開發(fā)與花椒抗銹病相關(guān)的snp分子標(biāo)記，并應(yīng)用該標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定，以期為花椒銹病抗性種質(zhì)的篩選和鑒定提供快速準(zhǔn)確的分子生物學(xué)方法，推動了花椒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測花椒銹病的snp標(biāo)記，其特征在于，所述snp標(biāo)記為30616-314，所述snp標(biāo)記所在基因序列如seq?id?no.1所示，其中，所述snp標(biāo)記在所述基因序列5’端起的第314位堿基；所述snp標(biāo)記的堿基為t或c。

2.一種用于檢測權(quán)利要求1所述花椒銹病的snp標(biāo)記的引物組，其特征在于，所述引物組包括公共引物30616-314-f、正常堿基引物30616-314-r1和突變堿基引物30616-314-r2；其中30616-314-f的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；30616-314-r1的核苷酸序列如seq?idno.3所示；30616-314-r2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

3.一種用于檢測權(quán)利要求1所述snp標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的引物組。

4.權(quán)利要求1中所述的snp標(biāo)記或權(quán)利要求2所述引物組或權(quán)利要求3所述試劑盒在花椒抗病育種中的應(yīng)用。

5.一種檢測花椒銹病的方法，其特征在于，通過對待測花椒進(jìn)行權(quán)利要求1所述的snp標(biāo)記的檢測，確定花椒的抗花椒銹病類型。

6.如權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于，具體步驟如下：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種用于檢測花椒銹病的SNP標(biāo)記及應(yīng)用，該SNP標(biāo)記為30616?314，該SNP標(biāo)記序列自5’端起第314位堿基為T或C，該SNP標(biāo)記對應(yīng)的基因型為CC時(shí)，為高抗花椒銹病的基因型，該SNP標(biāo)記對應(yīng)的基因型為時(shí)CT，為中等抗花椒銹病的基因型。該SNP標(biāo)記可準(zhǔn)確的檢測出花椒銹病形態(tài)，通過基因手段進(jìn)行檢測，可大大縮短檢測周期，提高檢測準(zhǔn)確性。

技術(shù)研發(fā)人員：韓珊,張賓珊,衣建民,陳廣焱,葉萌,朱天輝,劉應(yīng)高,李姝江,李書穎,周宇爵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23