本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ox40l、il-23和il-36γ三聯(lián)mrna疫苗及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、ox40(cd134,tnfrsf4)最初被定義為t細(xì)胞活化標(biāo)記物，后發(fā)現(xiàn)是具有共激活功能的ngfr/tnfr超家族成員。ox40與配體ox40l(cd252,tnfsf4)結(jié)合傳遞共刺激信號(hào)。ox40l可在抗原遞呈細(xì)胞(apc)，如：b細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上表達(dá)；另外在其它細(xì)胞類型如langerhans細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞、和nk細(xì)胞也可誘導(dǎo)表達(dá)?？梢?，ox40和ox40l的結(jié)合參與了t細(xì)胞與淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞之間多種生理反應(yīng)。

2、il-36γ屬于il-1家族，它作用于樹突細(xì)胞促進(jìn)其成熟，并能夠增加相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌；它能夠促進(jìn)t細(xì)胞的擴(kuò)增和th1和th9的分化；有研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤的作用。il-23屬于il-12家族，它不但能夠激活樹突細(xì)胞，也能夠激活nkt等其他免疫細(xì)胞；它不但能夠擴(kuò)增和維持th17細(xì)胞，也能夠作用于抗原刺激的t細(xì)胞。

3、mrna-2752是moderna公司研發(fā)的一種編碼ox40l、il-23和il-36γ的信使rna(mrna)藥物，目前正處于臨床1期試驗(yàn)階段。mrna-2752被封裝在脂質(zhì)納米顆粒(lnp)中，通過腫瘤內(nèi)注射(itu)直接遞送到腫瘤部位。臨床前數(shù)據(jù)表明，它與pd-l1抑制劑聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同作用。該藥物旨在治療實(shí)體瘤和淋巴瘤，通過表達(dá)這些免疫調(diào)節(jié)因子，mrna-2752有望增強(qiáng)患者的免疫反應(yīng)，從而有效地對(duì)抗癌細(xì)胞。

4、mrna藥物在序列優(yōu)化上面臨一些挑戰(zhàn)。mrna分子本身不穩(wěn)定，容易被降解。這會(huì)影響藥物的有效性和持久性。mrna的翻譯效率受其序列和結(jié)構(gòu)的影響。優(yōu)化密碼子使用和二級(jí)結(jié)構(gòu)可以提高翻譯效率，但這需要復(fù)雜的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的ox40l、il-23和il-36γ三聯(lián)mrna疫苗及其應(yīng)用。通過對(duì)mrna-2752中的人ox40l、人il-23和人il-36γmrna序列進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了mrna在細(xì)胞中的表達(dá)水平。優(yōu)化后的mrna在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)于mrna-2752的治療效果。本發(fā)明的ox40l、il-23和il-36γ三聯(lián)mrna疫苗可用于腫瘤的免疫治療，具有顯著的臨床應(yīng)用潛力。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

5、本發(fā)明在一方面，提供了一種人ox40l?mrna分子，所述mrna包含編碼人ox40l的cds編碼區(qū)，所述cds編碼區(qū)選自seq?id?no:1-12所示的核苷酸序列或與seq?id?no:1-12所示的核苷酸序列具有密碼子簡(jiǎn)并性且具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列。

6、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人il-36γmrna分子，所述mrna包含編碼人il-36γ的cds編碼區(qū)，所述cds編碼區(qū)選自seq?id?no:14-23所示的核苷酸序列或與seq?id?no:14-23所示的核苷酸序列具有密碼子簡(jiǎn)并性且具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列。

7、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人il-23mrna分子，所述mrna包含編碼人il-23的cds編碼區(qū)，所述cds編碼區(qū)選自seq?id?no:25-34所示的核苷酸序列或與seq?id?no:25-34所示的核苷酸序列具有密碼子簡(jiǎn)并性且具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列。

8、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種mrna藥物組合物，所述藥物組合物包含人ox40lmrna分子、人il-36γmrna分子和人il-23mrna分子。人ox40l?mrna分子、人il-36γmrna分子和人il-23mrna分子的質(zhì)量比優(yōu)選1：1：1。

9、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種三聯(lián)mrna疫苗，所述疫苗包括藥物組合物和藥物遞送載體。

10、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種三聯(lián)mrna疫苗的制備方法，包括如下步驟：

11、(1)將陽離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇化磷脂溶解在有機(jī)溶劑乙醇中，得到脂質(zhì)納米顆粒的混合物a；其中，陽離子脂質(zhì)為dlin-mc3-dma，輔助磷脂為dspc，聚乙二醇化磷脂為dmg-peg2000。

12、(2)將mrna用乙酸鈉溶液稀釋，得到混合物b；

13、(3)將混合物a和混合物b通過微流控設(shè)備混合，制備脂質(zhì)納米顆粒組合物，并在pbs中進(jìn)行透析。

14、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上述藥物組合物、上述三聯(lián)mrna疫苗或根據(jù)上述制備方法制備得到的三聯(lián)mrna疫苗在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用還包括向受試者施用有效量的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。

15、在一個(gè)實(shí)施例中，上述mrna分子還包括5′utr和3′utr，所述5’utr優(yōu)選seq?id?no:36所示的核苷酸序列，所述3′utr優(yōu)選seq?id?no:37所示的核苷酸序列。mrna分子還包括flag?tag和poly(a)，所述flag?tag優(yōu)選flag?tag?x2，所述poly(a)優(yōu)選

16、在一個(gè)實(shí)施例中，上述mrna可以是經(jīng)過修飾的，提高mrna的穩(wěn)定性和翻譯效率。mrna的修飾方式包括：n6-甲基腺苷(m6a)、5-甲基胞嘧啶(m5c)、1-甲基腺苷(m1a)、7-甲基鳥苷(m7g)、假尿苷(ψ)、4-乙酰胞嘧啶(ac4c)等。優(yōu)選地，mrna的修飾為將cds序列中的所有尿苷(u)替換為n1-甲基-假尿苷(n1-methyl-pseudouridine,m1ψ)堿基。

17、在一個(gè)實(shí)施例中，藥物遞送載體選自脂質(zhì)體納米顆粒(lnp)、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、聚合物納米粒子、魚精蛋白納米粒子、多肽納米粒子多肽納米粒子、病毒載體、無機(jī)納米粒子、細(xì)胞穿透肽或自組裝rna-脂質(zhì)復(fù)合物。所述lnp包含陽離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇化磷脂。

18、在一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)納米顆粒組合物(mrna-lnp)的制備方法包括如下步驟：

19、(1)將dlin-mc3-dma、dspc、膽固醇和dmg-peg2000按照一定摩爾比溶解在有機(jī)溶劑乙醇中，得到脂質(zhì)納米顆粒的濃度為25mm的混合物a；摩爾比為45-55：8-12：35-45：1-2，優(yōu)選50:10:38.5:1.5；

20、(2)將200μg表達(dá)mrna用ph為4、濃度為100mm的乙酸鈉溶液稀釋至0.35mg/ml，得到混合物b；

21、(3)將混合物a和混合物b通過微流控設(shè)備混合，制備脂質(zhì)納米顆粒組合物(mrna-lnp)，并在pbs中進(jìn)行透析。

22、在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、三陰性乳腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤。

23、在一個(gè)實(shí)施例中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括pd-1拮抗劑、pd-l1拮抗劑或ctla-4拮抗劑。pd-1拮抗劑是特異性結(jié)合pd-1的抗體或其抗原結(jié)合部分，pd-l1拮抗劑是特異性結(jié)合pd-1的抗體或其抗原結(jié)合部分。ctla-4拮抗劑是特異性結(jié)合ctla-4的抗體或其抗原結(jié)合部分。pd-1拮抗劑選自納武單抗、派姆單抗、匹利珠單抗，pd-l1拮抗劑選自度伐單抗、avelumab、阿特珠單抗，ctla-4拮抗劑ipilimumab、tremelimumab。

24、(三)有益效果

25、本發(fā)明提供了ox40l、il-23和il-36γ三聯(lián)mrna疫苗及其應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具備以下有益效果：

26、采用自主研發(fā)的基于深度學(xué)習(xí)的mrna序列設(shè)計(jì)方法，綜合評(píng)估密碼子頻率、簡(jiǎn)并性和稀有性；序列的gc含量、吉布斯自由能；以及序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)，針對(duì)人ox40l、人il-23和人il-36γ的氨基酸序列設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的mrna序列。優(yōu)化后的mrna在細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于mrna-2752，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更優(yōu)異的治療效果。本發(fā)明的ox40l、il-23和il-36γ三聯(lián)mrna疫苗可用于腫瘤的免疫治療，具有顯著的臨床應(yīng)用潛力。

27、(四)術(shù)語和定義

28、本文所述的“核苷酸”是指包含磷酸基團(tuán)的核苷。核苷酸通常由三部分組成的分子：一個(gè)五碳糖(核糖或脫氧核糖)、一個(gè)磷酸基團(tuán)和一個(gè)含氮堿基(嘌呤或嘧啶)。

29、本文所述的“mrna(信使rna)”是指一種單鏈核酸分子，從dna模板轉(zhuǎn)錄而來，攜帶遺傳信息，并在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。mrna的結(jié)構(gòu)通常包含5'端帽結(jié)構(gòu)(5'cap)、5'非翻譯區(qū)(5'-utr)、編碼區(qū)(開放閱讀框，orf)、3'非翻譯區(qū)(3'-utr)和/或多聚腺苷酸尾(poly-a?tail)。

30、本文所述“cds編碼區(qū)”是指mrna分子中實(shí)際被翻譯成蛋白質(zhì)的部分。cds從起始密碼子(通常是aug)開始，到終止密碼子(如uaa、uag或uga)結(jié)束。位于5'非翻譯區(qū)(5'utr)和3'非翻譯區(qū)(3'utr)之間。cds由外顯子組成，包含所有編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

31、本文所述的“密碼子簡(jiǎn)并性”指的是在遺傳密碼中，多個(gè)不同的密碼子(codons)能夠編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象。

32、本文所述的“同一性”是指兩個(gè)或多個(gè)生物大分子序列(如dna、rna或蛋白質(zhì)序列)之間的相似性程度。在比較兩個(gè)序列時(shí)，序列同一性是通過確定在相同位置上具有相同成分的序列的比例來量化的。

33、本文所述的“修飾”是指分子在狀態(tài)或結(jié)構(gòu)上的改變?？梢酝ㄟ^多種方式進(jìn)行修飾，包括化學(xué)、結(jié)構(gòu)和功能上的修飾。例如，mrna分子可以通過引入非天然核苷和/或核苷酸進(jìn)行修飾，例如天然核糖核苷酸a、u、g和c的修飾。

34、本文所述的“藥物遞送載體”是指用于將mrna藥物安全有效地遞送到目標(biāo)細(xì)胞或組織的系統(tǒng)。藥物遞送載體的種類通常包括脂質(zhì)體納米顆粒(lnp)、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、聚合物納米粒子、魚精蛋白納米粒子、多肽納米粒子多肽納米粒子、病毒載體、無機(jī)納米粒子、細(xì)胞穿透肽或自組裝rna-脂質(zhì)復(fù)合物。

35、本文所述的“脂質(zhì)體納米顆粒(lnp)”是一種由脂質(zhì)分子組成的納米級(jí)遞送系統(tǒng)，廣泛用于藥物和基因遞送。lnps由多層脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，能夠包裹和保護(hù)藥物分子，如mrna、sirna、dna等。脂質(zhì)納米顆粒(lnps)通常由四種主要類型的脂質(zhì)組成：可電離陽離子脂質(zhì)、磷脂、膽固醇或其衍生物、聚乙二醇(peg)-脂質(zhì)。脂質(zhì)體納米顆粒(lnps)的大小通常在50到200納米之間。lnps的大小可以通過調(diào)節(jié)其組成成分和制備方法來控制，以優(yōu)化其遞送效率和生物分布。

36、本文所述的“mrna疫苗”是指基于信使rna(mrna)技術(shù)開發(fā)的疫苗。其工作原理是將編碼特定抗原蛋白的mrna引入人體細(xì)胞，使細(xì)胞自身產(chǎn)生該抗原蛋白，從而激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。mrna疫苗的結(jié)構(gòu)主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵部分：mrna序列、遞送載體和穩(wěn)定劑、緩沖劑等輔料。

37、本文所述的“有效量”是指能夠產(chǎn)生預(yù)期或有益效果的藥物劑量，例如在臨床治療中取得的結(jié)果。因此，“有效量”會(huì)根據(jù)具體應(yīng)用的上下文而有所不同。例如，在癌癥治療中，藥劑的有效量是指與未使用藥劑相比，能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期治療效果的劑量。

38、本文所述的“免疫檢查點(diǎn)”是指在免疫系統(tǒng)中調(diào)節(jié)t細(xì)胞活性的一類分子。這些檢查點(diǎn)通過調(diào)控t細(xì)胞受體(tcr)與抗原的識(shí)別，維持免疫平衡。免疫檢查點(diǎn)可以分為共刺激和共抑制兩類，分別促進(jìn)或抑制免疫反應(yīng)。常見的免疫檢查點(diǎn)包括：pd-1/pd-l1、ctla-4、tim-3、lag-3、tigit、b7-h3、vista、cd200r、cd47。

39、本文所述的“免疫檢查點(diǎn)抑制劑”是指針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的sirna、dsrna、mirna、shrna、基因編輯系統(tǒng)、和/或抗體、抗原結(jié)合片段或其它小分子藥物。