本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒s1重組蛋白、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬的流行性腹瀉(porcine?epidemic?diarrhea，ped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemic?diarrheavirus，pedv)感染引起的以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的高度傳染性腸道疾病。哺乳仔豬感染pedv后死亡率最高達(dá)100％，各年齡段皆可感染。在我國(guó)快速傳播的新高毒力pedv毒株曾造成了大量仔豬死亡，死亡率接近100％，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、pedv的血清學(xué)檢測(cè)主要包括中和試驗(yàn)(neutralizationtest，snt)、間接免疫熒光試驗(yàn)(immunofluorescenceassay,ifa)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，其中elisa方法容易操作、特異性好，能進(jìn)行高通量檢測(cè)，是常用的血清學(xué)抗體檢測(cè)方法。目前針對(duì)ped發(fā)病尚無有效的治療藥物，需要通過初乳獲得母源抗體所賦予的被動(dòng)免疫。初乳中最重要的免疫因子是iga和igg，其執(zhí)行的免疫功能有所不同，分泌型iga(siga)可錨定在粘膜上保護(hù)仔豬腸道和其他黏膜組織不受病原微生物侵襲。

3、現(xiàn)有的抗pedv免疫球蛋白檢測(cè)試劑盒只能檢測(cè)豬血清和初乳中的抗pedv免疫球蛋白，要求采集豬的血液和母豬的初乳樣品進(jìn)行檢測(cè)。在非洲豬瘟流行的背景下，采血操作不利于非洲豬瘟的防控，而采初乳檢測(cè)，即使發(fā)現(xiàn)抗體水平較低，也沒有時(shí)間調(diào)整免疫程序來改變初乳中的抗體水平，其結(jié)果對(duì)ped防控的指導(dǎo)作用具有滯后性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決以上至少一個(gè)問題，本公開提供了一種重組蛋白、試劑盒及其應(yīng)用。

2、根據(jù)本公開的第一方面，提供了一種重組蛋白，所述重組蛋白包括以下任一條或多條片段：

3、第一片段，其具有如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性的氨基酸序列；

4、第二片段，其具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性的氨基酸序列；

5、第三片段，其具有如seq?id?no:4所示的氨基酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性的氨基酸序列；

6、第四片段，其具有如seq?id?no:5所示的氨基酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性的氨基酸序列；和/或

7、第五片段，其具有如seq?id?no:6所示的氨基酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性的氨基酸序列。

8、在一些實(shí)施方式中，所述第一片段、所述第二片段、所述第三片段、所述第四片段和/或所述第五片段各自獨(dú)立地通過連接肽連接，

9、在一些實(shí)施方式中，所述連接肽包括柔性連接肽，

10、在一些實(shí)施方式中，所述柔性連接肽包括(gmstgw)n、(gns)m、(g)n、(ea3k)n或(xp)n，其中n、m、t、w各自獨(dú)立地選自0～5的整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，所述柔性連接肽具有如seqid?no:7所示的氨基酸序列。

11、在一些實(shí)施方式中，所述第一片段、所述第二片段、所述第三片段、所述第四片段和/或所述第五片段之間的連接肽相同或者不同。

12、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白包括任一所述片段的1～10個(gè)拷貝。

13、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白包括任一所述片段的1個(gè)拷貝、2個(gè)拷貝、3個(gè)拷貝、4個(gè)拷貝、5個(gè)拷貝、6個(gè)拷貝、7個(gè)拷貝、8個(gè)拷貝、9個(gè)拷貝或10個(gè)拷貝。

14、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白包括如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性并保留pedv?s1蛋白免疫原性的氨基酸序列。

15、根據(jù)本公開的第二方面，提供了一種核酸分子，其核苷酸序列能夠編碼第一方面所述的重組蛋白。

16、在一些實(shí)施方式中，所述核酸分子包括如seq?id?no:8所示的核苷酸序列，或與其具有至少60％以上序列同一性的核苷酸序列。

17、根據(jù)本公開的第三方面，提供了一種重組載體，其包括第二方面所述的核酸分子。

18、在一些實(shí)施方式中，所述載體包括但不限于以下中的一種或多種：pfastbac1質(zhì)粒、pgex-4t2質(zhì)粒、pvl1393質(zhì)粒和pspax2質(zhì)粒。

19、根據(jù)本公開的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的重組載體。

20、在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包括真核或原核細(xì)胞。

21、在一些實(shí)施方式中，所述原核細(xì)胞包括細(xì)菌。

22、在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)菌包括大腸桿菌(escherichia?coli)。

23、在一些實(shí)施方式中，所述大腸桿菌包括但不限于dh10bac細(xì)胞、bl21(de3)細(xì)胞、bw25113細(xì)胞、mg1655細(xì)胞、w3110細(xì)胞或w細(xì)胞中的一種或多種。

24、在一些實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞包括酵母、昆蟲、植物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種或多種。

25、在一些實(shí)施方式中，所述昆蟲細(xì)胞包括鱗翅目昆蟲細(xì)胞。

26、在一些實(shí)施方式中，所述昆蟲包括但不限于家蠶(bombyx?morilinnaeus)、甘藍(lán)夜蛾(mamestra?brassicaelinnaeus)、草地貪夜蛾蛹(spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(trichoplusia?ni)、赤眼蜂(trichogrammatid)中的一種或多種。

27、在一些實(shí)施方式中，所述昆蟲細(xì)胞包括但不限于sf9昆蟲細(xì)胞、sf21昆蟲細(xì)胞、sf+細(xì)胞系或high?five細(xì)胞中的一種或多種。

28、根據(jù)本公開的第五方面，提供了一種檢測(cè)抗pedv免疫球蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括第一方面所述的重組蛋白。

29、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括標(biāo)記物標(biāo)記的抗pedv免疫球蛋白的二抗和底物和/或?qū)φ掌贰?/p>

30、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括樣品稀釋液、洗滌液和/或終止液。

31、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白固定在酶標(biāo)板上。

32、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白以方陣法固定在酶標(biāo)板上。

33、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白以0.1～5ug/ml的濃度固定在酶標(biāo)板上。

34、在一些實(shí)施方式中，所述重組蛋白以0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.4ug/ml、0.5ug/ml、0.6ug/ml、0.7ug/ml、0.8ug/ml、0.9ug/ml、1.0ug/ml、1.1ug/ml、1.2ug/ml、1.3ug/ml、1.4ug/ml、1.5ug/ml、1.6ug/ml、1.7ug/ml、1.8ug/ml、1.9ug/ml、2ug/ml、2.1ug/ml、2.2ug/ml、2.3ug/ml、2.4ug/ml、2.5ug/ml、2.6ug/ml、2.7ug/ml、2.8ug/ml、2.9ug/ml、3ug/ml、3.1ug/ml、3.2ug/ml、3.3ug/ml、3.4ug/ml、3.5ug/ml、3.6ug/ml、3.7ug/ml、3.8ug/ml、3.9ug/ml、4ug/ml、4.1ug/ml、4.2ug/ml、4.3ug/ml、4.4ug/ml、4.5ug/ml、4.6ug/ml、4.7ug/ml、4.8ug/ml、4.9ug/ml或5ug/ml的濃度固定在酶標(biāo)板上。

35、在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物包括酶。

36、在一些實(shí)施方式中，所述酶包括辣根過氧化物酶(hrp)或堿性磷酸酶。

37、在一些實(shí)施方式中，所述底物包括四甲基聯(lián)苯胺(tmb)或2,2'-疊氮基-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)。

38、在一些實(shí)施方式中，所述免疫球蛋白包括iga型、igd型、ige型、igg型和igm型中的一種或多種。

39、在一些實(shí)施方式中，所述樣品稀釋液包括血清蛋白、表面活性劑和pbs緩沖液中的一種或多種。

40、在一些實(shí)施方式中，所述樣品稀釋液包括0.5％～5％的血清蛋白。

41、在一些實(shí)施方式中，所述樣品稀釋液包括0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或5％的血清蛋白。

42、在一些實(shí)施方式中，所述血清蛋白包括牛血清蛋白。

43、在一些實(shí)施方式中，所述洗滌液包括表面活性劑和pbs緩沖液中的一種或多種。

44、在一些實(shí)施方式中，所述終止液包括h2so4。

45、在一些實(shí)施方式中，所述表面活性劑包括吐溫。

46、在一些實(shí)施方式中，所述吐溫包括但不限于吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫80中的一種或多種。

47、在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)照品包括陽性對(duì)照品和/或陰性對(duì)照品。

48、在一些實(shí)施方式中，所述陽性對(duì)照品包括抗pedv免疫球蛋白陽性血清。

49、在一些實(shí)施方式中，所述陰性對(duì)照品包括抗pedv免疫球蛋白陰性血清。

50、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒能夠在4℃條件下保存保質(zhì)期在1年以上。

51、根據(jù)本公開的第六方面，提供了一種使用第五方面所述的試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中結(jié)合抗pedv免疫球蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：

52、b1，將待測(cè)樣品加入包被有所述重組蛋白的酶標(biāo)板上進(jìn)行反應(yīng)；

53、b2，加入標(biāo)記物標(biāo)記的抗pedv免疫球蛋白進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)物；

54、b3，所述反應(yīng)物與底物作用產(chǎn)生信號(hào)，根據(jù)信號(hào)判斷所述待測(cè)樣品中抗pedv免疫球蛋白是否存在，其中信號(hào)的強(qiáng)度與待測(cè)樣品中抗pedv免疫球蛋白的濃度相關(guān)。

55、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b1包括將待測(cè)樣品、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品分別加入包被有所述重組蛋白的酶標(biāo)板上進(jìn)行反應(yīng)。

56、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b1中待測(cè)樣品、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品需要先稀釋，稀釋倍數(shù)包括10～200倍。

57、在一些實(shí)施方式中，所述待測(cè)樣品、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品的稀釋倍數(shù)包括50～200倍。

58、在一些實(shí)施方式中，所述待測(cè)樣品、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品需要先稀釋，稀釋倍數(shù)包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200倍。

59、在一些實(shí)施方式中，步驟b1的反應(yīng)溫度為室溫。

60、在一些實(shí)施方式中，步驟b1的反應(yīng)條件為避光。

61、在一些實(shí)施方式中，步驟b1的反應(yīng)時(shí)間包括20～60min。

62、在一些實(shí)施方式中，步驟b1的反應(yīng)時(shí)間包括但不限于20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min。

63、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中的所述標(biāo)記物標(biāo)記的抗pedv免疫球蛋白的稀釋倍數(shù)包括5000～15000倍。

64、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中的所述標(biāo)記物標(biāo)記的抗pedv免疫球蛋白的稀釋倍數(shù)包括但不限于5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000倍。

65、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中的所述反應(yīng)的溫度包括30～45℃。

66、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中的所述反應(yīng)的溫度包括30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃。

67、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中的所述反應(yīng)的時(shí)間包括30～60min。

68、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中的所述反應(yīng)的時(shí)間包括但不限于30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min或60min。

69、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中與底物作用的時(shí)間包括10～30min。

70、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b2中與底物作用的時(shí)間包括但不限于10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min。

71、在一些實(shí)施方式中，所述待測(cè)樣品包括豬的體液樣品。

72、在一些實(shí)施方式中，所述豬的體液樣品包括血液、血漿、血清、乳汁、鼻咽拭子、口腔拭子、糞便、肛門拭子或他們的處理物的檢測(cè)中的一種或多種。

73、在一些實(shí)施方式中，所述豬的體液樣品包括豬的口腔拭子、肛門拭子、血液或乳汁中的一種或多種。

74、在一些實(shí)施方式中，所述乳汁包括初乳。

75、根據(jù)本公開的第七方面，提供了如第一方面所述的重組蛋白或第二方面所述的核酸分子在以下(1)～(3)任一項(xiàng)或多項(xiàng)中的應(yīng)用：

76、(1)制備pedv疫苗；

77、(2)制備抗pedv免疫球蛋白檢測(cè)試劑盒；

78、(3)制備預(yù)防或治療pedv感染(例如豬的流行性腹瀉)的治療藥物。

79、本公開的有益效果：

80、本公開選擇了s1蛋白基因中抗原性和親水性較好的目的片段，進(jìn)行了截?cái)啾磉_(dá)以及重復(fù)表達(dá)，所獲得的重組蛋白具有良好的抗原性親水性和穩(wěn)定性。

81、采用本公開提供的重組蛋白制備抗pedv免疫球蛋白檢測(cè)試劑盒，具有高特異性和高靈敏性，不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)以及批間重復(fù)性好，熱穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。且能夠用于口腔拭子、肛門拭子、血清或初乳等多種不同類型樣品的檢測(cè)，且能夠區(qū)分自然感染與疫苗免疫豬群。為豬流行性腹瀉的檢測(cè)，以及疫苗、治療藥物的研發(fā)提供了良好的平臺(tái)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。