本發(fā)明涉及工具酶，更具體地說，涉及一種提高生物柴油轉(zhuǎn)化率的新型工具酶組合及應用。

背景技術：

1、工業(yè)社會對燃料的用量需求持續(xù)走高，而不可再生化石燃料的儲量卻日益減少，化石燃料大量碳排放造成的不良后果也已經(jīng)顯現(xiàn)。找到一種更優(yōu)良、更清潔的燃料對于環(huán)境保護和緩解石化燃料的壓力是必要的。生物柴油是一種綠色安全的燃料，可以由可食用和不可食用的植物油、動物脂肪、廢棄食用油和許多其他質(zhì)量較差的油制成。

2、目前已經(jīng)商業(yè)化的生物柴油生產(chǎn)方法包括化學酯交換法、酶催化法、全細胞催化法等?；瘜W酯交換法需要強酸堿、高溫等條件，生產(chǎn)條件苛刻、能耗高，且還需要過量的甲醇參與反應。全細胞催化本質(zhì)是利用胞內(nèi)或胞外酶完成催化，催化過程中不可避免會出現(xiàn)細胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)釋放到反應體系，給后期產(chǎn)品提取帶來不便。相比較而言，酶解催化條件溫和、催化效率高、工藝可控性高、成本低，是最為理想的生產(chǎn)方法，此方法也是目前主流的生產(chǎn)方法。

3、目前階段酶法生產(chǎn)生物柴油依然存在一些弊端，如用脂肪酶單價較高、生產(chǎn)周期較長、能耗較大等，因此開發(fā)更先進的生物柴油生產(chǎn)用酶勢在必行，鑒于此，我們提出一種提高生物柴油轉(zhuǎn)化率的新型工具酶組合及應用。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種提高生物柴油轉(zhuǎn)化率的新型工具酶組合及應用，以解決現(xiàn)有脂肪酶單價較高、生產(chǎn)周期較長、能耗較大技術問題。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供如下技術方案：一種提高生物柴油轉(zhuǎn)化率的新型工具酶組合及應用，包括以下步驟：

3、s1、酶的廣泛篩選；

4、s1.1、樣本采集：

5、從全球不同地域的土壤、水體、植物根際等生態(tài)環(huán)境中采集微生物樣本，確保多樣性；

6、s1.2、初篩：

7、利用含有甘油三酯的瓊脂培養(yǎng)基進行初步篩選，觀察微生物的生長情況及對甘油三酯的降解能力；

8、s1.3、復篩：

9、將初篩得到的微生物接種至含有標準甘油三酯和非天然底物的反應體系中，其中標準甘油三酯是大豆油甘油三酯，非天然底物是脂肪酸甲酯混合物，在溫度20℃至45℃、ph6.2至9.2的條件下培養(yǎng)，測定反應后產(chǎn)物的種類和數(shù)量、底物轉(zhuǎn)化率，篩選出具有潛在高效催化能力的候選酶源；

10、s1.4、評估與優(yōu)化：

11、對候選酶源進行進一步的酶學性質(zhì)評估，包括熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性、底物特異性等，選擇最優(yōu)菌株；

12、s2、候選酶的分離與純化；

13、細胞破碎：采用超聲波破碎破碎微生物細胞，釋放細胞內(nèi)的脂肪酶；

14、初步分離：通過離心分離去除細胞碎片和大部分雜質(zhì)，得到含有脂肪酶的粗酶液；

15、多級層析：利用離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等技術，對粗酶液進行逐級純化，去除雜質(zhì)，提高酶純度，純化過程中，嚴格控制溫度、ph值和離子強度，避免酶活損失；

16、酶活性與純度檢測：采用酶活測定方法和蛋白質(zhì)純度檢測技術，對純化后的脂肪酶進行活性和純度檢測，確保滿足后續(xù)應用要求，其中蛋白質(zhì)純度檢測技術為sds-page電泳；

17、s3、酶的定向進化與組合；

18、基因克隆與測序：從純化后的脂肪酶中提取dna，進行基因克隆和測序，獲取完整的基因序列信息；

19、定向進化策略設計：基于基因序列信息和酶學性質(zhì)評估結果，設計定點突變、基因重組的定向進化策略，以提高酶的催化效率、穩(wěn)定性和底物選擇性；

20、突變體構建與篩選：通過基因工程手段構建突變體庫，并在高溫、高醇濃度、非天然底物存在的情況下進行篩選，挑選出性能優(yōu)異的突變體；

21、酶組合優(yōu)化：將篩選出的突變體進行組合試驗，通過測定組合酶在不同反應條件下的催化性能，確定最佳組合比例，形成具有協(xié)同作用的新型工具酶組合；

22、優(yōu)選的，所述s1中，使用微流控芯片進行單細胞培養(yǎng)與篩選，每個微室獨立培養(yǎng)一個微生物細胞，通過熒光標記快速識別具有高效催化能力的細胞；

23、結合自動化液體處理系統(tǒng)和機器人操作，實現(xiàn)樣本的自動加樣、反應、檢測和數(shù)據(jù)分析，顯著提高篩選通量和準確性。

24、優(yōu)選的，所述s3中，利用深度測序技術獲取突變體庫的基因序列信息，結合生物信息學分析預測突變對酶結構和功能的影響；

25、通過冷凍電鏡解析目標脂肪酶的三維結構，指導定點突變的設計，確保突變位點的合理性和有效性。

26、優(yōu)選的，所述s2中，基于目標脂肪酶的氨基酸序列，通過計算機模擬篩選與其高親和力結合的短肽或小分子化合物；

27、對篩選出的配體進行化學合成或基因工程表達，并通過親和純化實驗驗證其結合特異性和純化效率。

28、優(yōu)選的，所述s3中，在脂肪酶基因中引入二硫鍵穩(wěn)定基序，以增強酶分子內(nèi)部的相互作用和穩(wěn)定性；

29、通過基因融合技術將脂肪酶與具有穩(wěn)定作用的免疫球蛋白fc段蛋白質(zhì)連接，形成融合蛋白，提高酶在極端條件下的耐受性。

30、一種提高生物柴油轉(zhuǎn)化率的新型工具酶組合的應用方法，包括以下步驟：

31、s1、原料預處理；

32、s1.1、油脂收集與分類：

33、收集餐廚廢棄油脂、餐廚廢油等廢棄動植物油脂，進行分類和初步去雜；

34、s1.2、脫膠處理：

35、在70℃-80℃的溫度下，使用磷酸鹽或檸檬酸等脫膠劑處理油脂，去除磷脂雜質(zhì)；

36、s1.3、脫酸處理：

37、調(diào)節(jié)油脂ph值至4.5-5.0，使用氫氧化鈉進行中和反應，去除游離脂肪酸；

38、s1.4、脫色與脫臭：

39、使用活性炭吸附劑去除油脂中的色素和異味物質(zhì)；

40、s1.5、脫水處理：

41、通過分子篩脫水法去除油脂中的水分，使其達到反應所需的水分含量要求；

42、s2、酶組合添加與反應條件優(yōu)化；

43、s2.1、酶組合配制：

44、將新型工具酶組合按優(yōu)化比例配制成反應液備用；

45、s2.2、反應體系建立：將預處理后的油脂與甲醇或其他低碳醇類按一定比例混合，加入酶組合反應液或固定化酶載體，形成反應體系；

46、s2.3、反應條件優(yōu)化：

47、在溫度40℃-50℃、壓力0.1mpa-1.0mpa的條件下進行反應，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、補充甲醇、調(diào)節(jié)ph值優(yōu)化反應條件，提高轉(zhuǎn)化率和反應速率；

48、s3、反應過程監(jiān)控；

49、s3.1、在線監(jiān)測：

50、利用在線監(jiān)測設備實時監(jiān)測反應體系的溫度、壓力、反應物濃度及產(chǎn)物生成情況；

51、s3.2、定時取樣分析：

52、在反應過程中定時取樣，分析樣品的組成和性質(zhì)變化，評估反應進程和效果；

53、s3.3、條件調(diào)整：

54、根據(jù)監(jiān)測和分析結果，適時調(diào)整反應條件以確保反應高效進行；

55、s4、產(chǎn)物分離與純化；

56、采用離心分離技術，初步分離出生物柴油與甘油相；

57、利用蒸餾技術對生物柴油進行提純，去除未反應的醇類和水分；

58、引入分子篩去除生物柴油中的微量催化劑殘留和色素，提高產(chǎn)品的純度；

59、s5、存儲；

60、在不同溫度、光照條件下儲存生物柴油樣品，定期檢測其理化性質(zhì)變化；

61、通過加速老化試驗模擬長期儲存條件，評估生物柴油的抗氧化能力和穩(wěn)定性。

62、優(yōu)選的，所述s1中；

63、使用超聲波處理油脂，通過空化效應破壞油脂中的大分子結構，促進雜質(zhì)分離；

64、采用微波加熱技術加速脫酸、脫色和脫水過程，同時保持油脂的營養(yǎng)成分不被破壞；

65、利用超臨界二氧化碳作為溶劑進行萃取和進化，去除油脂中的有害物質(zhì)和異味成分。

66、優(yōu)選的，所述s2.3中；

67、結合jmp實驗設計與統(tǒng)計分析軟件進行多因素多水平的實驗設計，減少實驗次數(shù)并提高優(yōu)化效率；

68、利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型對反應數(shù)據(jù)進行學習和訓練，建立反應條件與產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率之間的非線性關系模型，預測最佳反應條件組合。

69、優(yōu)選的，所述s3中；

70、利用在線色譜分析技術實時監(jiān)測反應體系中各組分的濃度變化；

71、設置報警系統(tǒng)，在反應條件偏離設定范圍時自動調(diào)整。

72、優(yōu)選的，所述s4中；

73、對生物柴油產(chǎn)品進行深度脫色處理，以提高產(chǎn)品的透明度和色澤穩(wěn)定性；

74、引入超臨界萃取技術進一步純化生物柴油，去除微量雜質(zhì)和副產(chǎn)物；

75、對純化后的生物柴油進行長期儲存穩(wěn)定性測試，評估其長期使用的可靠性。

76、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

77、本發(fā)明通過廣泛采集微生物樣本，以甘油三酯的瓊脂培養(yǎng)基對微生物進行初步篩選，并將初篩后的微生物接種至含有標準甘油三酯和非天然底物的反應體系中進行復篩，得到具有潛在高效催化能力的候選酶源，并以熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性、底物特異性對候選酶源進行性質(zhì)評估，通過分離與純化技術得到高活性和純度的脂肪酶，通過提取脂肪酶中的dna進行克隆和測序得到基因序列性息，設計定點突變、基因重組的定向進化策略，并通過基因工程手段構建突變體庫，將突變產(chǎn)生的基因表達后置于高溫、高醇濃度、非天然底物存在的情況下進行篩選，從而得到基因定向進化的脂肪酶，解決了現(xiàn)有脂肪酶單價較高、生產(chǎn)周期較長、能耗較大的問題。